CC BY
108ISSNG868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2GG1, том 11, № 3, с. 2б-42
== ОБЗОРЫ =
УДК 535.822: 57.086.2: 57.08
© Э. И. Лежнев, И. И. Попова, С. В. Кузьмин, С. М. Слащев
КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ МИКРОСКОПИЯ: ПРИНЦИПЫ, УСТРОЙСТВО, ПРИМЕНЕНИЕ (ЧАСТЬ 2)
Во второй части обзора приводятся сведения об особенностях применения КЛСМ в биологических исследованиях. В центре обсуждения — флуоресцентные методы, наиболее широко используемые в биологии и медицине. Приведены достаточно подробные данные о флуоресцентных красителях и стандартах для настройки КЛСМ, поскольку их номенклатура целиком сформирована зарубежными производителями и поставщиками и относится к расходным материалам. Свойства красителей определяют характеристики применяемых источников света и фотодетекторов. Из многочисленных примеров применения КЛСМ рассмотрены те, которые, по мнению авторов, могут сформировать представление у читателя о возможностях этой области аналитической микроскопии. В качестве примеров приведены краткие описания коммерческих КЛСМ, поставляемых на рынок ведущими фирмами, выпускающими оптическое оборудование для научных исследований.
6. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЗОНДЫ И ИСТОЧНИКИ ИЗЛУЧЕНИЯ
Основные преимущества конфокальной микроскопии в биологических исследованиях реализуются при использовании флуоресцентных красителей — зондов. Это обстоятельство оказало существенное влияние на конструкции КЛСМ, формирование световых потоков, детектирование, фильтрацию, алгоритмы обработки сигналов и реконструкцию изображений. Естественно, что при развитии конфокальной микроскопии в первую очередь применялись флуорохромы, используемые в обычной флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и других методах флуоресцентного анализа. Вместе с этим специфика применения красителей в КЛСМ — степень насыщения, смещение спектров флуоресценции, требование устойчивости к фотовыцветанию, без-артефактность, а также возрастающий перечень мишеней исследования — служит поводом для непрерывной разработки флуорохромов новых поколений и совершенствования известных.
В качестве примера новых красителей могут быть названы красители группы Alexa [1]. Красители этой группы обладают высокой фотоустойчивостью, стабильностью, интенсивностью флуоресценции. Перечень наиболее широко применяемых в конфокальной микроскопии флуоресцентных красителей приведен в табл. 1 [2]. В таблице указаны длины волн и типы лазеров, наиболее подходящих для возбуждения флуоресцентных красителей: аргоновый (Аг), аргон-криптоновый (АгКг), гелий-неоновый (Не№), криптон-
аргоновый (КгАг), аргоновый ультрафиолетовый
(ArUV). Кроме указанных типов лазеров в конфокальной микроскопии используются и другие источники света в зависимости от типа конкретного микроскопа, например ртутные лампы высокого давления, лазерные диоды, ртутно-ксеноновые лампы. Подробно различные источники света для конфокальной микроскопии рассмотрены в справочнике под ред. J.B. Pawley [3].
Основным фактором, на который следует обратить внимание при выборе конкретного флуоро-хрома, является степень его устойчивости к интенсивности светового потока возбуждения. Поток возбуждения в КЛСМ обеспечивается лазерными источниками света. Интенсивность потока возбуждения в КЛСМ в области фокусировки при лазерном освещении значительно выше, чем в обычном флуоресцентном микроскопе с освещением препарата от ртутной лампы. Однако полная доза облучения всего препарата в КЛСМ может быть значительно ниже, чем в обычном микроскопе, так как световому воздействию подвергается малая доля препарата. Уменьшению степени выцветания препарата способствует возможность ослабления интенсивности излучения лазера до значения, согласованного со скоростью сканирования и интенсивностью флуоресценции применяемых красителей.
Фирмы, выпускающие КЛСМ, как правило, рекомендуют перечень красителей, спектры поглощения которых хорошо согласованы с линиями применяемых в этих микроскопах лазеров и с оптическими элементами модулей сканирования. Основным источником света, применяемым в конфокальной микроскопии, следует считать охлаждаемый воздухом аргон-ионовый лазер, которым укомплектовано большинство коммерческих КЛСМ.
Табл. 1. Красители, используемые в конфокальной микроскопии
Красители Длина волны возбуждения, нм / тип лазера Длина волны флуоресцентного излучения, нм Примечание
Lucifer yellow СН 425 / Ar 533 Нейроны, межклеточные взаимодействия
BODIPY 665 / HeNe, ArKr 676 Нейтральные липиды
BODY-PY FL LDL 515 / Ar 520 Клеточные ЬБЬ-рецепторы
TRITC 542 / HeNe, ArKr 572 Белковые конъюгаты, флуоресцирующие антитела
Rhodamine Red-Х 560 / HeNe, ArKr 580 Белки, олигонуклеотиды
Lissameine Rhodamine Red-B 570 / HeNe, ArKr 590 Белковые конъюгаты
Texas Red-X 560 / HeNe, ArKr 590 Белки, олигонуклеотиды
Texas Red (конъюгаты и производные) 583 / HeNe, ArKr 603 Вторая метка при окрашивании другими флуоресцентными красителями
DiL 576 / HeNe, ArKr 599 Структура мембран
Trans Fluospheres 488 / Ar, ArKr 560-720 Внутриклеточные процессы и межклеточные взаимодействия
DAPI 358 / ArKr 461 ДНК, РНК
Hoechst 33342 333 / KrAr,ArUV 483 ДНК
Hoechst 33258 345 / KrAr 478 ДНК
YOYO-1 491 / Ar, ArKr 509 ДНК
Mithramycin 445 / Ar 575 ДНК
Acridine Orange 503 / Ar, ArKr 525 / 650 ДНК, РНК
Ettridium Bromide 518 / Ar 605 ДНК, РНК
Sitox Green 504 / Ar, ArKr 523 Соотношение живых и мертвых клеток, ДНК
TOTO-3 642 / HeNe, ArKr 660 Соотношение живых и мертвых клеток, ДНК
Indo-1 338 / KrAr 401, 475 Измерение концентрации Са2+
Fluo-3 506 / Ar, ArKr 526 Внутриклеточный Са2+
Rhod-2 552 / HeNe, ArKr 581 Внутриклеточный Са2+
Fura Red 450- r rK < r, < 0 0 5 .1. 660 Внутриклеточный Са2+
Fura Indoline C-18 498 / Ar, ArKr 694 Концентрация Са2+ в мембранах
Oregon Green 488 BARTA 494 / Ar, ArKr 523 Внутриклеточный Са2+
Magnesium Green 506 / Ar 531 Внутриклеточный Mg2+
Sodium Green 507 / Ar 735 Внутриклеточный Ка+
SNARF 580 / ArKr 640 Внутриклеточный рН
Lucigenin 455, 368 / Ar, KrAr 505 Митохондрии, фагоцитоз, индикатор С1-
Табл. 1 (продолжение)
Красители Длина волны возбуждения, нм/ тип лазера Длина волны флуоресцентного излучения, нм Примечание
FITC 494 / Ar 519 Белки, аминокислотные последовательности Конъюгаты олигонуклеотидов и пептидов
Oregon Green 514 506 / Ar 526 Белки
TMR 555 / HeNe, ArKr 580 Белковые конъюгаты, РН-зависимые процессы
7-AAD 546 / HeNe 647 ДНК (селективная связь с участками О-С)
Histamin fluorescein 493 / Ar 516 Гистаминовая проба
FlCRhR 500 / Ar 517 С-АМР в живых клетках
BC ECF AM 300 / KrAr, ArUV 535 Цитотоксичность, пролиферативная активность
Как видно из табл. 1, три типа лазеров Лг (458, 488, 514 нм), ЛгКг (488, 568, 647 нм) и Ые№ (543, 633нм) обеспечивают возможность возбуждения большинства используемых в конфокальной микроскопии флуоресцентных красителей в видимой области, а лазеры КгЛг (351, 364 нм) и ЛгИУ (360нм) — в ультрафиолетовой области.
7. ФОТОДЕТЕКТОРЫ В КЛСМ
Роль фотодетекторов в КЛСМ, как и в других оптико-электронных приборах, состоит в преобразовании оптического сигнала в его электронный эквивалент. Корректировка сигналов, реконструкция изображения, его визуализация, количественная оценка исследуемых структур и процессов, архивирование полученных результатов осуществляется средствами вычислительной техники.
Анализ структур и процессов методом флуоресцентной конфокальной микроскопии (считаем уместным еще раз отметить определяющее значение и перспективность этого метода в биологических исследованиях) сопряжен с необходимостью регистрации отдельных составляющих полихроматического сигнала. Поэтому фотоприемным устройствам КЛСМ предшествует система оптического преобразования сигнала, работа которой иллюстрируется схемой конфокального сканера ЬЕ1СЛ ТС8 4Э, приведенной на рис. 1. В подрисуночном тексте сделаны соответствующие пояснения к схеме. На схеме можно проследить
Рис. 1. Схема оптического разделения полихроматического луча на монохроматические составляющие в конфокальном микроскопе ТС Б 4Б фирмы Ьеіеа. 1 — сканирующее зеркало, 2 — блок дихроичных зеркал в канале возбуждения, 3 — блок сменных измерительных конфокальных диафрагм, 4 — блоки дихроичных зеркал в каналах измерения, 5 — дихроичное зеркало, 6 — линза, 7 — осветительная конфокальная диафрагма, 8 — блок с запирающими фильтрами, 9 — линза сканера, 10 — объектив, 11 — фотоумножители, 12 — оптическая волоконная связь с лазером, 13 — блок фильтров возбуждения, 14 — объектив микроскопа
ход лучей, поступающих от лазерного источника освещения. В конфокальном сканере ЬБІСЛ ТСБ 4Б использованы многомодовые Лг- и ЛгКг-лазеры и ЛгИУ-лазер. Лазерный луч (в общем случае полихроматический), пройдя один из входных фильтров и световод, по оптическому тракту сканера и микроскопа поступает на препарат, структуры которого могут содержать различные красители, и трансформируется в люминисцентное излучение (в общем случае тоже полихроматическое). Система барьерных фильтров и дихроичных зеркал обеспечивает регистрацию каждым детектором выбранной монохроматической составляющей люминисцентного излучения на каждом шаге сканирования. В качестве детекторов в конфокальном сканере ЬБІСЛ ТСБ 4Б используются высокочувствительные быстродействующие фотоэлектронные умножители (ФЭУ). Аналогичные схемы, отличающиеся конструктивными элементами, содержат конфокальные блоки большинства КЛСМ.
В работах [4, 5] детально проанализированы характеристики, достоинства и недостатки используемых в КЛСМ детекторов и сформулированы требования, предъявляемые к ним. Основное требование состоит в том, чтобы система детектирования сигнала не снижала достигнутые в КЛСМ показатели по разрешению, быстродействию и не вносила дополнительных искажений. В КЛСМ в качестве детекторов нашли применение ФЭУ и многоэлементные твердотельные детекторы (ТТД). В настоящее время в КЛСМ со сканированием столиком и лучом применяются фотоэлектронные умножители. Их достоинства состоят в высоком быстродействии (разрешение по времени составляет 0.2-0.5 нсек) и малом темновом токе. В табл. 2 приведены характеристики фотокатодов современных ФЭУ. Эти характеристики могут быть полезными при выборе типа ФЭУ. Однако малая квантовая эффективность ^Б 3-20 %) и спектральная зависимость ограничивают их применение при работе в режиме реального времени.
Табл. 2. Состав и спектральные характеристики фотокатодов ФЭУ
Материал фотокатодов. Обозначение / Состав Материал окна Красная граница чувстви- тельности, нм Длина волны на max чувствительно- сти X max? нм Световая чувстви- тельность на ^ max, мА/Вт Квантовый выход на ^ max, %
Серебряно-кислородно-цезиевый
S1 (C) / AgOCs Стекло 1100 800 2.3 0.36
Сурьмяно-цезиевые
S4 / SbCs Стекло 680 400 50 16
S11 (A) /SbCs Стекло 680 440 60 17
Super A / SbCs Стекло 700 440 80 22
S13 / SbCs Плавленный кварц 680 440 60 17
Многощелочные
S20 (T) / SbNaKCs Стекло 850 420 70 20
S20 (R) / SbNaKCs Стекло 900 550 3 8
TU / SbNaKCs Плавленый кварц 850 420 70 20
Двухщелочные
Двухщелочной / SbKCs Стекло 630 400 85 26
Двухщелочной / SbKCs Плавленый кварц 630 400 85 26
Двухщелочной / SbRbCs Стекло 700 420 85 25
Теллурид-цезиевый
SB / CsTe Плавленый кварц 340 235 20 10
Поэтому в конфокальных микроскопах реального времени с дисковым сканированием, сканированием щелью и акустооптическим дефлектором нашли применение охлаждаемые многоэлементные ТТД с зарядовой связью (ПЗС). Эти приборы при высокой квантовой эффективности ^Е 60-80 %) обладают широким динамическим диапазоном и возможностью параллельного считывания 20-изображения. Однако в современных ПЗС имеет место перетекание заряда в соседние ячейки, вызывающее возникновение электронных шумов.
Скорость считывания кадра составляет 1-5 с. По мнению J.B. Pawley и V.E. Centonze [6], в будущем эти недостатки будут устранены созданием малоэлементных ПЗС, которые найдут широкое применение в конфокальной микроскопии. В заключение следует отметить, что разработанные и выпускаемые отечественной промышленностью ФЭУ и ПЗС по своим характеристикам не уступают зарубежным образцам и могут быть с успехом использованы при проектировании КЛСМ [7, 8].
Табл. 3. Основные технические характеристики КЛСМ
Параметры Значения
Разрешение, мкм Элементарный сканируемый объем, нм Максимальное количество оптических срезов Сканирующие устройства Максимальная скорость сканирования строки Конфокальные диафрагмы Программное обеспечение Режимы сканирования Виды изображений Скорость формирования изображения Источники света Типы фотоприемников Анализатор спектра фотолюминисценций Оптические микроскопы 0.2 (X—Y) при NA = 1.2 иммерсия, X = 488 нм, 0.4 (Z) при NA = 1.2 иммерсия, X = 488 нм, при дополнительной обработке изображений может быть получено разрешение < 0.1 (Х—Y) 100(Х) х 100(Y) х 400(Z) До 90 - 100 Сканирующий столик, акустооптический дефлектор, гальванометрические зеркала, резонансные гальванометрические зеркала, диск типа Нипкова 64 мкс Круглые отверстия диаметром 10 -120 мкм, щелевые шириной 10 -100 мкм, кольцевые типа диска Нипкова: 150 000 апертур 0 20 мкм, 16 спиралей Цифровая фильтрация, управление, реконструкция 2D, 3D, 3D—t, 4D, 4D(t) изображений, макропрограммирование, анимация, анализ, документирование X—Y, X—Y—Z, X—Z, X—t 2D, 3D, 3D—t, 4D От 1кадр/10 с до 25 кадров/с (30-480 кадров/с — КЛСМ Noran, 640 кадров/с — диск типа Нипкова) Лазеры: HeNe, Ar, ArKr, KrAr, ArUV. Лампы: ртутные, ртутно-ксеноновые, галогенные Фотоумножители, ПЗС-матрицы, фотодиоды Набор светофильтров, монохроматоры, акусто-оптические фильтры Leica DM Series: DMRB/E, DMIRB/E; Nikon: Optiophot 2, Diaphot 200/300; Olympus: BX, BH, IMT, AH, AX, IX; Zeiss: Axioscop, Axioplan, Axiovert
8. ПРИМЕРЫ КОММЕРЧЕСКИХ КОНФОКАЛЬНЫХ МИКРОСКОПОВ
В течение последних лет конфокальные микроскопы разрабатывали и поставляли на рынок разные фирмы. Некоторыми фирмами разработаны несколько модификаций приборов, совершенствование которых продолжается и в настоящее время.
В связи с тем что материалы с описанием КЛСМ рассредоточены в различного вида рекламных проспектах, на сайтах Интернета, в разделах "Материалы и методы" оригинальных публикаций, адресовать заинтересованного читателя к конкретному источнику, который содержал бы исчерпывающие сведения о конструкции и характеристиках приборов затруднительно. Поэтому авторы сочли возможным в настоящем разделе ограничиться примерами КЛСМ, выпускаемых ведущими оптическими фирмами: Leica, K. Zeiss, BioRad, Olympus. В этих приборах реализованы теоретически достижимые характеристики КЛСМ. Характерные параметры в обобщенном виде приведены в табл.3.
Примеры коммерческих КЛСМ фирм Leica, K. Zeiss, BioRad, Olympus приведены в табл. 4. В таблицу включены те модификации приборов, которые имеют отличия, расширяющие их эксплуатационные возможности. Конечно, в таблице не может быть отражено все многообразие разработанных КЛСМ. В нее не вошли, например, рекомендованные для применения в биологии и медицине обладающие широкими возможностями конфокальные микроскопы фирм Noran и Meridian. В настоящем разделе не освещены вопросы, касающиеся создания конфокальных микроскопов, предназначенных для исследований in vivo. Это связано с тем, что производство этих приборов не вышло за рамки изготовления опытных образцов и макетов.
9. ТЕСТИРОВАНИЕ
В связи с тем что КЛСМ является прибором, обеспечивающим количественную оценку исследуемых структур и явлений, то эффективное его использование может быть достигнуто лишь при наличии специальных лабораторных мер и эталонов. В количественной микроскопии использование таких эталонов распространено достаточно широко. КЛСМ является высокоточным и сложным прибором; малейшие отклонения в условиях эксплуатации могут существенно повлиять на его характеристики и результаты исследований. При анализе препарата (особенно с использованием флуоресцентных красителей) возникает необходимость текущей настройки прибора. На ранних стадиях разработки КЛСМ для этих целей применялись тест-объекты биологического происхожде-
ния (диатомовые водоросли, эритроциты птиц и т.д.). В настоящее время созданы специальные стандарты для калибровки ^ЛСМ — Focal Check Microsperes, MultiSpeck Multicpectral Fluorescence Microscopy Standarts Kits, TetraSpeck Fluorescent Microspheres. На рынок такие стандарты поставляет фирма Molecular Probes [2].
Стандарты Focal Check разработаны для настройки КЛСМ и представляют собой полистиро-ловые сферы 015 мкм, что близко к среднему диаметру животной клетки. Сферы окрашены специальным образом двумя или тремя флуоресцентными красителями. Красители наносятся тонким слоем на поверхность сферы, а в некоторых случаях заполняют внутренний объем, ограниченный сферой. Максимумы возбуждения / излучения (нм): 365/430, 505/515, 560/580, 660/680. Стандарты Focal Check выпускаются и используются в виде суспензий. При настройке микроскопа достигается четкость границы между окрашенной и неокрашенной частями изображения сферы на различной глубине фокусировки. Это дает возможность устранить погрешности несоосности элементов оптики, нестабильности источников освещения, уменьшить влияние внешних условий.
Стандарты для многоспектральной флуоресцентной микроскопии MultiSpeck имеют универсальное применение: калибровка обычных флуоресцентных микроскопов и КЛСМ, настройка оборудования для формирования трехмерных цветных изображений микрообъектов. Они представляют собой микросферы диаметром 4 мкм, равномерно окрашенные тремя красителями с четко различающимися полосами излучения (голубой, зеленой, красной). Препараты MultiSpeck поступают на рынок либо в виде слайдов с микросферами, иммобилизованными в заливочную среду, либо в виде суспензий. Слайды содержат зоны с наборами микросфер, обеспечивающими настройки всех параметров КЛСМ. Суспензии дают возможность включать микросферы непосредственно в препарат для уточнения пространственных взаимосвязей, а также изготавливать слайды индивидуального назначения по желанию исследователя.
Стандарты для многоспектральной флуоресцентной микроскопии TetraSpeck представляют собой модификацию микросфер MultiSpeck в направлении расширения спектрального диапазона красителей (голубая, зеленая, оранжевая, красная линии) и увеличения числа размеров микросфер:
0.1-0.2-0.5-1.0-4.0 мкм. Препараты TetraSpeck выпускаются как в виде слайдов, так и в виде суспензий в различных сочетаниях размеров и используемых красителей, открывая перед исследователями широкие возможности в получении при помощи КЛСМ изображений клеток и клеточных структур на уровне сверхразрешения, достижимого в флуоресцентной конфокальной микроскопии.
Табл. 4. Примеры коммерческих КЛСМ
Модель, Число ка- Число и Системы Тип Дополнитель- Рекоменда-
фирма налов ре- тип осве- сканирова- базового ные ции по
гистрации, тителей ния микроскопа эксплуата- примене-
тип фото- ционные нию
детектора возможности
FLUOVIEW 2 канала, 2 канала, Два гальва- Микроско- Интерферен- Исследова-
Olympus ФЭУ Лг и ЛгКг нометри- пы фирмы ционный ние тканей,
лазеры ческих зеркала Olympus контраст клеток и субклеточных структур. Анализ ионов с высоким временным разрешением
MX 50-CF, Камера с Галогено- Диск типа МХ 50, Формирова- Широкое
Olympus ПЗС ма- вая и Нипкова MX 50L ние изобра- применение:
трицей ртутно- ксеноновая лампы жений в реальном времени биология, медицина, электронные технологии
TCS 4D, 4 канала, Лг-лазер Одно Leitz Волоконная Исследова-
Leica ФЭУ 360, 488 нм, зеркало с DMIRB, оптика, ис- ние клеток и
ЛгКг-лазер двумя Leitz DM ключение клеточных
488, 568, гальвано- рассеянного структур
647 нм метрами света, реконструкция изображения 2Б, 3Б, 4Б при раздельном и совместном использовании различных методов контрастирования
TCS NT, 4 канала, 2 канала, Карданный DMIRB, Детектор Широкое
Leica ФЭУ ЛгКг лазер однозер- DMR проходящего применение:
488, 568, кальный света БМЯ биология,
647 нм сканер по ХУ, 3 координатный механический столик медицина, электронные технологии
Табл. 4 (продолжение)
Модель, Число ка- Число и тип Системы Тип Дополнитель- Рекомен-
фирма налов ре- осве- сканирова- базового ные эксплуата- дации по
гистрации, тителей ния микроскопа ционные примене-
тип фото- возможности нию
детектора
LSM 510, 4 канала, Ar-лазер Два гальва- Axlovert 100 Детекторы для Широкое
Carl Zeiss ФЭУ 458, 488 нм, нометриче- MBP, Axio- регистрации примене-
HeNe-лазер ских зерка- plan 2 проходящего ние в
543нм ла, 3 координатный механический столик света и флуоресценции, акусто-оптические фильтры для регулирования интенсивности света, разделения спектральных линий биологии и медицине
Radiance 3 канала, 3 канала, Два гальва- Е600, Е800, В зависимости Исследо-
2000 ФЭУ лазеры: Ar нометри- Е600 FN, от модифика- вание
(7 мо- 457, 477, ческих зер- Eclips ции: исследова- живых
дифика- 488, 514 нм; кала TE 300, ния в проходя- клеток и
ций), KrAr 488, Eclips щем и отражен- тканей,
ф. Bio- 568 нм; TE 300 DV ном свете. Диф- окра-
Rad HeNe 543 нм ференциальный интерференционный контраст, многофотонная микроскопия, режим счета фотонов шенных 1-3 красителя-ми, при одновременном или по-следова-тельном возбуждении. Исследование толстых срезов с помощью многофотонной микроскопии
Перечисленными микросферами не ограничивается перечень средств для калибровки и настройки КЛСМ. Находят применение выпускаемые Molecular Probes фиксированные образцовые окрашенные препараты клеток, которые, не являясь стандартами, могут быть полезны при подборе фильтров и фокусировке микроскопов.
В заключение настоящего раздела следует отметить, что создание тест-систем для работы с КЛСМ свидетельствует не столько о завершенности исследований в создании методов количественной микроскопии, сколько о достижениях на начальных этапах этих исследований, существенно снижающих фактор субъективности.
10. ПРИМЕНЕНИЕ КЛСМ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
К настоящему времени применение конфокальной микроскопии в значительной степени вышло за рамки первоначально предполагаемого М. Минским ее использования в качестве средства исследования микроструктур головного мозга. Для исследователей, чья работа связана с изучением биологии, биофизики, биохимии и физиологии клетки, КЛСМ стал незаменимым инструментом как для наблюдения внутриклеточных структур, так и для количественной оценки процессов в клетках, клеточных мембранах, внеклеточном окружении. Подробный анализ всех работ, связанных с применением КЛСМ, выходит за рамки тематического направления данного журнала, и поэтому авторы сочли возможным ограничиться лишь отдельными примерами, позволяющими специалистам различных отраслей науки, техники и медицины сформировать представление о состоянии этой области. Некоторой компенсацией краткости изложения может служить перечень литературы в конце статьи, который, к сожалению, несмотря на внушительный объем, не может в полной степени охватить всю литературу по обсуждаемому вопросу. Публикации, посвященные применению КЛСМ в биологических исследованиях могут быть условно отнесены к одному из следующих направлений.
1. Иллюстрация возможностей КЛСМ на многочисленных примерах сопоставления изображений, получаемых методами обычной и конфокальной микроскопии [9-11]. Цель этих работ в основном состояла в том, чтобы обратить внимание цитологов, гистологов, генетиков, морфологов на преимущества, заложенные в конфокальном принципе при исследовании внутриклеточных и тканевых структур. На рис. 2 приведено обычное (а) и конфокальное (б) изображения оплодотворенного яйца морского ежа, обработанного имму-нофлуоресцентным красителем [11]. Анализ обычного и конфокального изображений на приведенных рисунках позволяет без труда выявить более тонкие внутриклеточные структуры при использовании конфокального принципа микроско-пирования.
2. Обоснование возможностей достижения высокого разрешения, реконструкции трехмерного изображения, количественной оценки исследуемых микроструктур и процессов [12-14]. Эти работы сформировали теоретическую базу конфокальной микроскопии, послужили предпосылками для целенаправленного совершенствования конструктивных элементов КЛСМ. Биологические объекты (ДНК, фрагменты цитоскелета и т.д.) использовались как тест-системы для создания алгоритмов обработки информации и алгоритмов функ-
Рис. 2. Изображение оплодотворенного яйца морского ежа ^аттесЫпш), окрашенного ан-титубулином. а — обычное изображение, б — конфокальное. Длина линии 50 мкм
ционирования систем управления. На рис. 3. приведены изображения хромосом Сгер18 сарШап8 [12], находящиеся непосредственно на оптическом срезе (а) и реконструированные с использованием метода регуляризации (б). Видно, что в восстановленном изображении разрешение в фокальной плоскости значительно выше, чем в исходном.
3. Оригинальные исследования, посвященные различным разделам биологии клетки. Эти работы представлены обширным перечнем публикаций, в котором могут быть выделены исследования в области нейробиологии (исследования центральной и периферической нервной системы, микроциркуляции в сосудах мозга, внутриклеточных структур, цитоскелета, рецепторов, мембран нейронов [15]); исследования клеточного ядра и его генетического аппарата [14, 16-18]; исследования митохондрий и проблем митохондриального транспорта [19]; исследования транспорта кальция и его локализаций
я
'Ш-
* 4
Ш
Рис. 4. Конфокальное изображение клеток МН1С1 (клетки гепатомы крысы) после окрашивания их са1сет ЛМ и при тушении его свечения с помощью Со2+ в цитозоле. Отчетливо видны ярко светящиеся митохондрии. Длина линии 6.5 мкм
Рис. 3. Изображение набора хромосом Сгер1Б сарШапБ. а — исходное изображение, б — восстановленное изображение при реконструировании с параметром регуляризации л = 10-
[20]; исследования различных клеток (соединительнотканных, эпителиальных, секретирующих и др.), формирующих структурно-функциональные компонеты печени, сердца, почек, крови и других органов [21-26]. В значительной степени многие из этих публикаций имеют непосредственное отношение к проблемам экспериментальной медицины: экспериментальной онкологии, иммунологии, вирусологии, эндокринологии. Как правило,
объектами исследований в работах этого направления являются препараты in vitro, а основные требования к методам микроскопирования состоят в достижении высокого разрешения, возможности количественной оценки исследуемых явлений, эффективного использования красителей и реконструкции трехмерного изображения. В качестве примера на рис. 4 приведено конфокальное изображение клеток МН1С1 (клетки гепатомы крысы) после окрашивания их Са^т AM и при тушении его свечения с помощью Со2+ в цитозоле [25]. Отчетливо видны ярко светящиеся митохондрии.
4. Оригинальные исследования, проводимые in vivo. Это перспективное направление применения конфокальной микроскопии в неинвазивной диагностике многих паталогий активно развивается в офтальмологии, дерматологии и проктологии [27-31]. На рис. 5 изображен оптический срез поверхности слизистой оболочки толстой кишки крысы in vivo после локального применения флуоресцентного красителя (изображение среза представлено в Интернете Dr W. McLaren, Monash University). На рис. 6 и 7 в качестве примера приведены изображения клеточных слоев роговицы глаза, полученные методами конфокальной микроскопии [22]. Основные проблемы применения КЛСМ в офтальмологии состоят в создании
Рис. 5. Оптический срез поверхности слизистой оболочки толстой кишки крысы in vivo после локального применения флуоресцентного красителя
Рис. 6. Клетки эпителия роговицы глаза человека. Фокальная плоскость выбрана так, чтобы получить оптический срез поверхностных клеток (светлые клетки). Клетки, расположенные немного глубже фокальной плоскости, выглядят темнее. Объектив 25х, Ш.=0.6
приборов, обеспечивающих микроскопирование в реальном времени с дозированной освещенностью исследуемых тканей.
Взяв на себя риск в прогнозировании развития
Рис. 7. Оптический срез клеток базального эпителия роговицы глаза человека. Объектив 50х, Ш.=1.0
этого направления, авторы считают возможным предположить появление в недалеком будущем в арсенале доступного медицинского оборудования специализированных диагностических конфокальных микроскопов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Созданием современных КЛСМ не завершены работы по применению принципа конфокальности в исследованиях биологических микрообъектов. Дальнейшее развитие этого принципа осуществляется в рамках следующих направлений.
— Создание так называемых "гибридных" систем. Гибридные системы позволяют расширить функциональные возможности конфокальной микроскопии за счет совместного использования различных микроскопических приборов: ближне-польного и сканирующего микроскопов, раманов-ского и обычного конфокального микроскопов.
— Разработка 4п-конфокальных микроскопов [32, 33]. В этих микроскопах флуоресцентное изображение формируется двумя расположенными встречно конфокальными объективами, а его реконструкция является результатом интерференции совмещенных изображений.
— Разработка методов и аппаратуры конфокальной микротомографии [34]. Конфокальная микротомография позволяет осуществить наблюдение исследуемого объекта под различными углами, что дает возможность выявлять особенности сложной топологии клеток и внеклеточного пространства.
Вместе с этим изготовители коммерческих конфокальных микроскопов непрерывно ведут работы по повышению эксплуатационных показателей существующих моделей КЛСМ за счет применения совершенных источников света, фотодетекторов, красителей, программного обеспечения, повышения виброустойчивости, достижения возможности регистрации флуоресценции при незначительном световом воздействии на клетки и низких концентрациях красителя для длительного наблюдения структур в интактных клетках и анализа происходящих в них процессов путем использования матричных ПЗС с микроканальными пластинами в качестве усилителей изображений.
В завершение настоящего обзора следует отметить, что в нем представлены лишь общие черты конфокальной микроскопии как метода исследований, в создании которого сконцентрированы усилия большого числа отдельных исследователей и коллективов. Авторы надеются на то, что поставленная ими в начале обзора цель достигнута хотя бы частично и вместе с тем сожалеют о том, что потенциал отечественной промышленности оказался невостребованным в решении этой важной для биологии и медицины проблемы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kumar R.K., Chapple C.C., Hunter N. // J. Histochemistry and Cytochemistry. 1999. V. 47, N. 9. P. 1213-1217.
2. Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research ^emicals. Molecular Probes Inc., 1996, XII. Sixth edition. 680 p.
3. Handbook of biological confocal microscopy / Ed. J.B. Pawley. New York—London: Plenum Press, 1990. 233 p.
4. Webb R.H., Dorey C.K. The pixelated image // Handbook of biological confocal microscopy / Ed. J.B. Pawley. New York—London: Plenum Press, 1990. P. 41-51.
5. Art J. Photon detectors for confocal microscopy // Handbook of biological confocal microscopy / Ed. J.B. Pawley. New York—London: Plenum Press, 1990. P.127-139.
6. Pawley J.B., Centonze V.E. Practical laser-scanning confocal light microscopy: obtaining optimal performance from your instrument // Cell Biology: A Laboratory Handbook / Ed. by Celis Julio E. San Diego (CA): Academic Press, 1994. P.44-64.
7. Шелпакова И.Р., Гаранин В.Г., Лабусов В.А. // Заводская лаборатория: Диагностика материалов. 1999. Т. 65. № 10. С. 3-16.
8. Ветохин С.С., Ермалицкий Ф.А., Мельников С.М. и др. // Приборы и техника эксперимента. 1998. № 2. С. 5-12.
9. Amos W.B., White J.G., Fordham M. // Appl. Opt.
1987. V. 26. P. 3239-3243.
10. Shotton D.M. // Proc. R. Microsc. Soc. 1988. V. 23. P.289-297.
11. White J.G., Amos W.B., Fordham M. // J. Cell Biology. 1987. V. 105. P. 41-48.
12. Bertero M., Boccacci P., Brakenhoff G.J. et al. // J. Microscopy. 1990. V. 157. P. 3-20.
13. Brakenhoff G.J., van der Voort H.T.M., van Spronsen E.A. et al. // Nature. 1985. V. 317. P. 748-749.
14. Jones S.J., Taylor M.L., Baarslag M.W. et al. // J. Microscopy. 1990. V. 158. Pt. 2. P. 235-248.
15. Trogadis J.E., Ng G. Y.-K., O’Dowd B.F. et al. // J. Histochemistry and Cytochemistry. 1995. V. 43, N. 5. P. 497-506.
16. Van Dekken H., van Rotterdam A., Jonker R. et al. // J. Microscopy. 1990. V. 158. P. 207-214.
17. Bauman J.G.J., Bayer J.A., Dekken H. // J. Microscopy. 1990. V. 157. P. 73-81.
18. Goldstein S.R., Hubin T., Rosenthal S. et al. // J. Microscopy. 1990. V. 157. Pt. 1. P. 29-38.
19. Fink C., Morgan F., Loew L.M. // Biophysical J. 1998. V. 75. P. 1648-1658.
20. Cleemann L., Wang W., Morad M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95, N. 18. P. 1098410989.
21. Vassy J., Rigaut J.P., Hill A.-M. // J. Microscopy. 1990. V. 157. P. 91-104.
22. Masters B.R., Thaer A. A. // Applied Optics. 1994. V. 33, N. 4. P. 695-701.
23. Andrews P.M., Petroll W.M., Cavanagh H.D. et al. // Am. J. Anat. 1991. V. 191. P. 95-102.
24. Petroll W.M., Jester J.V., Cavanagh H.D. // Scanning. 1994. V. 16. P. 131-149.
25. Petronilli V., Miotto G., Canton M. et al. // Biophysical J. 1999. V. 76, N. 2. P. 725-734.
26. Tadrous P.J. // J. Pathol. 2000. V. 191, N. 4. P. 345-354.
27. Cavanagh H.D., Jester J.V., Essepian J. et al. // CLAO J. 1990. V. 16. P. 65-73.
28. Corcuff P., Bertrand C., Leweque J.L. // Arch. Dermatol. 1993. V. 285. P. 475-481.
29. Ichijima H., Petroll W.M., Jester J.V. et al. // Cornea. 1993. V. 12. P. 369-378.
30. Zhu G., Tekola P., Baak J.P.A. et al. // Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 1994. V. 16, N. 2. P. 145-152.
31. Massig J.H., Preissler M., Wegener A.R. et al. // Applied Optics. 1994. V. 33, N. 4. P. 690-694.
32. Hell S.W., Stelzer E.H.K. // Opt. Commun. 1992. V. 93. P.277-282.
33. Hanninen P.E., Hell S.W., Salo J. et al. // Appl. Phys. Lett. 1995. V. 66. P. 1698-1700.
34. Porwol T., Strehmaier A.-R., Spiess E. et al. // European Microscopy and Analysis. 1997, July. P.21-23.
Рекомендуемая литература по теме раздела б
1. Bacallo R., Garfinkel A. // Three-dimensional Confocal Microscopy: Investigation of Biological Systems / Eds J.K. Stevens et al. London: Academic Press, 1994. P. 172-174.
2. Bacallo R., Bomsel M., Stelzer E. H. K. et al.
Guiding principles of specimen preservation for confocal fluorescence microscopy // Handbook of biological confocal microscopy / Ed. J.B. Pawley. New York—London: Plenum Press, 1990.
P. 197-205.
3. Bock G., Hilchenbach M., Schauenstein K. et al. Photometric analysis of antifading reagents with laser and conventional illumination sources // J. Histochem. & Cytochem. 1985. V. 33, N. 7. P. 699-705.
4. Chen R. F., and Scott C. H. Atlas of Fluorescence Spectra and Lifetimes of Dyes attached to proteins // Anal. Lett. 1985. V. 18. P. 393-422.
5. Gerdes H.-H., Kaether C. Green fluorescent protein: applications to cell biology // FEBS Lett. 1996. V. 389. P. 44-47.
6. Haugland R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Molecular Probes Inc., 1996, XII. Sixth edition. 680 p.
7. Johnson G.D., Davidson R.S., McNamee K.C. et al. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. // J. Immunol. Methods. 1982. V. 55. P. 231-236.
8. Kneen M., Farinas J., Li Y. et al. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 1591-1600.
9. Krenik K.D., Kephart G.M., Offord K.P. et al. Comparison of antifading reagents used in immunofluorescence // J. Immunol. Methods.
1989. V. 117. P. 91-97.
10. Longin A., Souchier C., French M. et al. Comparison of anti-fading agents used in fluorescence microscopy: image analysis and laser confocal microscopy study // J. Histochem. & Cytochem. 1993. V. 41, N. 12. P. 1833-1840.
11. Tsien R.Y., Waggoner A. Fluorophores for
confocal microscopy: photophysics and
photochemistry // Handbook of biological confocal microscopy / Ed. by J.B. Pawley. New York— London: Plenum Press, 1995. P. 267-279.
12. Wells S. Johnson I. // Three-Dimensional Confocal Microscopy: Investigation of Biological Systems / Eds J.K. Stevens et al. London: Academic Press, 1994. P. 101-129.
Рекомендуемая литература по теме раздела Т
1. Cox I.J., Sheppard C.J.R., Wilson T. Supperreso-lution by confocal fluorescence microscopy. // Optik. 1982. V. 60. P. 391-396.
2. Fine A., Amos W.B., Durbin R.M. et al. Confocal
microscopy: applications in neurobiology //
Trends Neurosci. 1988. V. 11. P. 346-351.
3. Hiraoka Y., Sedat J. W., Agard D.A. The use of a charge-coupled device for quantitative optical microscopy of biological structures // Science. 1987. V. 238. P. 36-41.
4. Ploem J.S. Laser scanning fluorescence microscopy // Appl. Opt. 1987. V. 26. P. 3226-3231.
5. Ploem J.S. New instrumentation for sensitive image analysis of fluorescence in cell and tissues // Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences / Eds Taylor D.L. et al. 1986. New York: A. R. Liss. Inc. P. 289-300.
6. Sheppard C.J.R., Wilson T. Image formation in scanning microscopes with partially coherent source and detector // Optica Acta. 1978. V. 25. P.315-325.
7. Sheppard C.J.R., Cogswell C.J. Confocal microscopy with detector arrays // J. Modern Optics. 1990. V. 37. P. 267-279.
8. Shuman H. Contrast in confocal scanning microscopy with a finite detector // J. Microscopy. 1988. V. 149. P. 67-71.
9. Wilson T., Carline A.R. Size of the detector in confocal imaging systems // Optics Lett. 1987. V. 12. P. 227-229.
10. Connor J.A. Fluorescence imaging applied to the measurement of Ca in mammalian neurons // Calcium and ion channel modulation / Eds Grin-nel A.D., Armstrong D., Jackson M.B. New York: Plenum Press, 1988. P. 395-406.
11. Shotton D.M. Confocal scanning optical microscopy and its applications for biological specimens // J. Cell Sci. 1989. V. 94. P. 175-206.
12. Носов Ю.Р., Шиман В.А. Основы физики приборов с зарядовой связью. М.: Наука, 1986. 318 с.
13. Приборы с зарядовой связью / Под ред. Д.Ф. Барба. М.: Мир, 1982. 240 с.
14. Секен К., Томпсон М. Приборы с переносом заряда. М.: Мир, 1978. 328 с.
15. Шелпакова И.Р., Гаранин В.Г., Лабусов В.А. Многоэлементные твердотельные детекторы и их использование в атомно-эмиссионном спектральном анализе (обзор) // Заводская лаборатория: Диагностика материалов. 1999. Т. 65. № 10. С. 3-16.
16. Ветохин С.С., Ермалицкий Ф.А., Мельников С. М. и др. Современные фотоумножители для кинетической и одноквантовой спектрометрии (обзор) // Приборы и техника эксперимента. 1998. № 2. С. 5-12.
Рекомендуемая литература по теме раздела 10
1. Akulinin V.A., Belichenko P.V., Dahlstrom A.
The cellular distribution of GAP-43 immunoreac-tivity in human neocortical areas using immunofluorescence and confocal microscopy: post-ischemic influence // Brain Res. 1998. V. 784, N. 1-2. P.341-346.
2. Amos W.B., White J.G., Fordham M. Use of con-focal imaging in the study of biological structures // Appl. Opt. 1987. V. 26. P. 3239-3243.
3. Andrews P.M., Petroll W.M., Cavanagh H.D. et al. Tandem scanning confocal microscopy (TSCM) of normal and ishemic living kidneys // Am. J. Anat. 1991. V. 191. P. 95-102.
4. Antonini J.M., Charron T.G., Roberts J.R. et al. Application of laser scanning confocal microscopy in the analysis of particle-induced pulmonary fibrosis // Toxicol Sci. 1999. V. 51, N. 1. P. 126-134.
5. Arribas S.M., Daly C.J., Mc Grath I.C. Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy // Methods Enzymol. 1999. V. 307. P. 246273.
6. Attawia M.A., Devin J.E., Laurencin C.T. Immunofluorescence and confocal laser scanning microscopy studies of osteoblast growth and phenotypic expression in three-dimensional degradable synthetic matrices // J. Biomed. Mater. Res. 1995. V. 29. P. 843-848.
7. Babcock G.F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy // Methods Enzymol. 1999. V.307. P.319-328.
8. Bauman J.G.J., Bayer J.A., Dekken H. Fluorescent in-situ hybridization to detect cellular RNA by flow cytometry and confocal microscopy // J. Microscopy. 1990. V. 157. P. 73-81.
9. Beaudet A., Nouel D., Stroh T. et al. Fluorescent ligands for studying neuropeptide receptors by confocal microscopy // Braz. J. Med. Biol. Res. 1998. V. 31, N. 11. P. 1479-1489.
10. Bertero M., Boccacci P., Brakenhoff G.J. et al. Three-dimensional image restoration and superresolution in fluorescence confocal microscopy // J. Microscopy. 1990. V. 157. P. 3-20.
11. Bohnke M., Masters B.R. Confocal microscopy of the cornea // Prog. Retin. Eye Res. 1999. V. 18, N. 5. P.553-628.
12. Brakenhoff G.J., van der Voort H.T.M., van Spronsen E.A. et al. 3-dimensional imaging of biological structures by high resolution confocal scanning laser microscope // Scan microscopy.
1988. V. 2. P. 33-40.
13. Brakenhoff G.J., van der Voort H.T.M., van Spronsen E.A. et al. Three-dimensional chromatin distribution in neuroblastoma nuclei shown by confocal laser scanning microscope // Nature. 1985. V. 317. P. 748-749.
14. Carlsson K., Wallen P., Brodin L. Three-dimensional
imaging of neurons by fluorescence microscopy // J. Microscopy. 1989. V. 155. P. 15-26.
15. Castano P., Marcucci A., Miani J.R.A. et al. Central and peripheral nervous structures as seen at the confocal scanning laser microscopy // J. Microscopy. 1994. V. 175. Pt. 3. P. 229-237.
16. Cavanagh H.D., Jester J.V., Essepian J. et al. Confocal microscopy of the living eye // CLAO J. 1990. V. 16. P. 65-73.
17. Cheng C., Reynolds I.J. Subcellular localization of glutamate-stimulated intracellular magnesium concentration changes in cultured rat forebrain neurons using confocal microscopy. // Neuroscience. 2000. V. 95, N. 4. P. 973-979.
18. Chew S.J., Beuerman R.W., Assouine M. et al. Early diagnosis of infections keratitis with in vivo real time confocal microscopy // CLAO J. 1992. V. 18. P.197-201.
19. Chiou A.G., Kaufman S.C., Beuerman R.W. Differential diagnosis of linear corneal images on confocal microscopy. // Cornea. 1999. V. 18. N. 1. P. 63-66.
20. Chiou A.G., Kaufman S.C., Beuerman R.W. et al. Confocal microscopy in the iridocorneal endothelial syndrome // Br. J. Ophthalmol. 1999. V. 83, N. 6. P. 697-702.
21. Cleemann L., Wang W., Morad M. Twodimensional confocal images of organization density and gating of focal Ca2+ release sites in rat cardiac myocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1998. V. 95 (18). P. 10984-10989.
22. Cheng C., Reynolds I.J. Subcellular localization of glutamate-stimulated intracellular magnesium concentration changes in cultured rat forebrain neurons using confocal microscopy // Neuroscience. 2000. V. 95, N. 4. P. 973-979.
23. Corcuff P., Bertrand C., Leweque J.L. Morphometry of human epidermis in vivo by real time confocal microscopy // Arch. Dermatol. 1993. V. 285. P. 475-481.
24. Evington R.J., Fricker M.D., Wood J.L. et al. Four-dimensional imaging of living chondrocytes in cartilage using confocal microscopy: a practical approach // Am. J. Physiol. 1997. V. 273. P. 1040-1051.
25. Fine A., Amos W.B., Durbin R.M. et al. Confocal
microscopy: applications in neurobiology //
Trends Neurosci. 1988. V. 11. P. 346-351.
26. Fox M.H., Arndt-Jovin T.M., Baumann P.H. et al. Spatial and temporal distribution of DNA replication sites localized by immunofluorescence and confocal microscopy in mouse fibroblasts // J. Cell Sci. 1991. V. 99. P. 247-253.
27. Frueh B.E., Bohnke M. In vivo confocal microscopy of fleck dystrophy // Cornea. 1999. V. 18, N. 6. P. 658-660.
28. Frueh B.E., Cadez R., Bohnke M. In vivo confocal microscopy after photorefractive keratectomy in humans. A prospective, long-term study // Arch. Ophthalmol. 1998. V. 116, N. 11. P. 1425-1431.
29. Gard D.L. Confocal microscopy and 3-D reconstruction of the cytoskeleton of Xenopus oocytes // Microsc. Res. Tech. 1999. V. 44, N. 6. P. 388-414.
30. Hepler P.K., Gunning B.E.S. Confocal fluorescence microscopy of plant cells // Protoplasma.
1998. V. 201, N. 3-4. P. 121-157.
31. Hernandez-Quintela E., Mayer F., Dighiero P. et al. Confocal microscopy of cystic disorders of the corneal epithelium // Ophthalmology. 1998. V. 105, N. 4. P. 631-636.
32. Howell D.N., Miller S.E. Identification of viral infection by confocal microscopy // Methods Enzy-mol. 1999. V. 307. P. 573-591.
33. Ichijima H., Petroll W.M., Jester J.V. et al. In vivo confocal microscopic studies of endothelial wound healing in rabbit cornea // Cornea. 1993.V. 12. P. 369-378.
34. It oh J., Osamura R. Y., Watanabe K. Subcellular visualization of light microscopic specimens by laser scanning microscopy and computer analysis: a new application of image analysis // J. Histochemistry cytochemistry. 1992. V. 40, N. 7. P. 955-967.
35. Jester J.V., Petroll W.M., Garana R.M.R. et al. Comparison of in vivo and ex vivo cellucar structure in rabbit eyes detected by tandem scanning confocal microscopy // J. Microscopy. 1992. V. 165. P. 169-181.
36. Jirkovska M., Kubinova L., Krekule I. Spatial arrangement of fetal placental capillaries in terminal villi: a study using confocal microscopy // Anat. Embryol. Berl., 1998. V. 197. N. 4. P. 263-272.
37. Koester C.J.V., Auran J.D., Rapaport R. et al. Con-focal scanning slit microscopy of normal human corneal basal epithelium centripetal slide and presumed Langerhans cell movement // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34 (suppl.). P. 1014.
38. Koester C.J.V. Scanning mirror microscope with optical sectioning characteristics: Applications in ophtalmology // Appl. Optics. 1980. V. 19. P.1749-1757.
39. Komuro H., Raki C.P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations // J. Neurosci. 1995. V. 15, N. 2. P.1110-1120.
40. Konig K., Simon U., Halbhuber K.-J. 3-D resolved two-photon fluorescence microscopy of living cells using modified confocal laser scanning microscope // Cellular and Molecular Bio-logy.1996. V. 42, N. 8. P.1181-1194.
41. Kumar S.D., Tay S.S. Changes in peptidergic nerves in the atrioventricular valves of
streptozotocin-induced diabetic rats: a confocal microscopy study // Anat. Rec. 2000. V. 258, N. 3. P.277-285.
42. Leclerc P., Jibard N., Meng X. et al. Quantification of the nucleocytoplasmic distribution of wild type and modified proteins using confocal microscopy: interaction between 90-k heat shock protein (Hsp90 alpha) and glucocorticosteroid receptor (GR) // Exp. Cell Res. 1998. V. 242, N. 1. P. 255264.
43. Lemasters J.J., Qian T., Elmore S.P. et al. Confo-cal microscopy of the mitochondrial permeability transition in necrotic cell killing, apoptosis and autophagy // Biofactors. 1998. V. 8, N. 3-4. P.283-285.
44. Lemp M.A., Shields W.M., Essepian J. et al. The clinical use of tandem scanning confocal microscopy of the cornea // Invest Ophthalmol. Vis. Sci.
1992. V. 33 (suppl.). P. 1234-1239.
45. Lwigale P.Y. Nuclear morphologies of bovine corneal cells as visualized by confocal microscopy // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165, N. 2. P.104-112.
46. Mayr C.A., Sami S.M., Remers W.A. et al. Intracellular localization of 6- and 7-substituted 2-[2'-(dimethylamino)ethyl]-1,2-dihydro-3H-dibenz[de,h]isoquino line-1,3-diones (azonafides) is not the limiting factor for their cytotoxicity: an in vitro confocal microscopy study // Anticancer Drugs. 1999. V. 10, N. 2. P. 163-170.
47. Morris D.C., Zhang Z., Davies K. et al. High resolution quantitation of microvascular plasma perfusion in non-ischemic and ischemic rat brain by laser-scanning confocal microscopy // Brain Res. Protoc. 1999. V. 4, N. 2. P. 185-191.
48. Motoyama K., Karl I.E., Flye M.W. et al. Effect of Ca2+ agonists in the perfused liver: determination via laser scanning confocal microscopy // Am. J. Physiol. 1999. V. 276, N. 2. Pt. 2. P. 575-585.
49. Mustonen R.K., Mc Donald M.B., Srivan-naboon S. et al. In vivo confocal microscopy of Fuchs' endothelial dystrophy // Cornea. 1998. V. 17, N. 5. P. 493-503.
50. New K.C., Petroll W.M., Boyde A. et al. In vivo imaging of human teeth and skin using real-time confocal microscopy // Scanning. 1991. V. 13. P. 369-372.
51. Petroll W.M., Cavanagh H.D., Jester J.V. 3-dimensional reconstruction of corneal cells using in vivo confocal microscopy // J. Microscopy.
1993. V. 170. P. 213-219.
52. Petroll W.M., Cavanagh H.D., Jester J.V. Assessment of stress fiber orientation during healing of radial keratotomy wounds using confocal microscopy // Scanning. 1998. V. 20, N. 2. P. 74-82.
53. Petroll W.M., Jester J.V., Cavanagh H.D. In vivo
confocal imaging: general principles and applications // Scanning. 1994. V. 16. P. 131-149.
54. Petronilli V., Miotto G., Canton M. et al. Transient and long-lasting opening of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directlyin intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence // Biophysical J.
1999. V. 76, N. 2. P. 725-734.
55. Prydal J.I., Kerr Muir M.G., Dilly P.N. et al. Con-focal microscopy using oblique sections for measurement of corneal epithelial thickness in conscious humans // Acta Ophthalmol. Scand. 1997. V. 75, N. 6. P. 624-628.
56. Rosenberg M.E., Tervo T.M., Petroll W.M. et al. In vivo confocal microscopy of patients with corneal recurrent erosion syndrome or epithelial basement membrane dystrophy // Ophthalmology.
2000. V. 107, N. 3. P. 565-573
57. Rothen-Rutishauser B., Kramer S.D., Braun A. et al. MDCK cell cultures as an epithelial in vitro model: cytoskeleton and tight junctions as indicators for the definition of age-related stages by confocal microscopy // Pharm. Res. 1998. V. 15, N. 7. P. 964-971.
58. Satoh Y., Nishimura T., Kimura K. et al. Application of real-time confocal microscopy for observation of living cells in tissue specimens // Hum. Cell. 1998. V. 11, N. 4. P. 191-198.
59. Shotton D.M. The current renaissance in light microscopy; Blur-free optical sectioning of biological specimens by confocal scanning fluorescence microscopy // Proc. R. Microsc. Soc. 1988. V. 23. P. 289-297.
60. SilverM.A., StrykerM.P. A method for measuring colocalization of presynaptic markers with anatomically labeled axons using double label immunofluorescence an confocal microscopy // J. Neurosci. Methods. 2000, Jan. 15. V. 94, N. 2. P.205-215.
61. Smith G.J., Bagnell C.R., Bakewell W.E. et al. Application of confocal scanning laser microscopy in experimental pathology // J. Electron. Microsc. Tech. 1991. V. 18. P. 38-49.
62. Soontornniyomkij V., Wang G., Kapadia S.B. et al. Confocal microscopy assessment of lymphoid tissues with follicular hyperplasia from patients infected with human immunodeficiency virus type 1 // Arch. Pathol. Lab. Med. 1998. V. 122, N. 6. P. 534-538.
63. Stricker S.A., Whitaker M. Confocal scanning microscopy of calcium dynamics in living cells // Microscopy Research and Technique Directions.
1999. V. 46. P. 356-369.
64. Sullivan K.F., Shelby R.D. Using time-lapse confocal microscopy for analysis of centromere dynamics in human cells // Methods Cell Biol. 1999.
V. 58. P.183-202.
65. Turner J.N., Swann J.W., Szarowski D.H. et al. Three-dimensional confocal light and electron microscopy of central nervous system tissue and neurons and glia in culture // Intl. Rev. Exper. Path. 1996. V. 36. P. 53-72.
66. Van Dekken H., van Rotterdam A., Jonker R. et al. Confocal microscopy as a tool for the study of the intranuclear topography of chromosomas // J. Microscopy. 1990. V. 158. P. 207-214.
67. Van der Voort H.T.M., Strasters K.C. Restoration of confocal images for quantitative analysis // J. Microscopy. 1995. V. 178. P. 165-181.
68. Van der Voort H.T.M., Brakenhoff G.J., Janssen G.C.A.M. et al. Confocal scanning fluorescence and reflection microscopy: measurements of the 3-D image formation and application in biology // Proc. Soc. Photo-Optical Instrument Ing. (SPIE). 1987. V. 809. P. 138-143.
69. Van Oostveldt P., Bauwens S. Quantitative fluorescence in confocal microscopy // J. Microscopy. 1990. V. 158. Pt. 2. P. 121-132.
70. Vassy J., Rigaut J.P., Hill A.-M. Analysis by con-focal scanning laser microscopy imaging of the spatial distribution of intermediate filaments in foetal and adult rat liver cells // J. Microscopy.
1990. V. 157. P. 91-104.
71. Vesaluoma M.H., Linna T.U., Sankila E.M. et al. In vivo confocal microscopy of a family with Schnyder crystalline corneal dystrophy // Ophthalmology. 1999. V. 106, N. 5. P. 944-951.
72. Werner L.P., Werner L., Dighiero P. et al. Confo-cal microscopy in Bowman and stromal corneal dystrophies // Ophthalmology. 1999. V. 106, N. 9. P.1697-1704.
73. White J.G., Amos W.B., Fordham M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy // J. Cell Biology. 1987. V. 105. P. 41-48.
74. White J.G., Amos W.B., Fordham M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structure by fluorescence light microscopy // J.Cell Biol. 1987. V. 105. P. 41-48.
75. White P.J., Fogarty R.D., Liepe I.J. et al. Live confocal microscopy of oligonucleotide uptake by keratinocytes in human skin grafts on nude mice // J. Invest. Dermatol. 1999. V. 112, N. 6. P. 887892.
76. Zhang Z., Davies K., Prostak J. Quantitation of microvascular plasma perfusion and neuronal microtubule-associated protein in ischemic mouse brain by laser-scanning confocal microscopy // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1999. V. 19, N. 1. P. 68-78.
77. Zhu G., Tekola P., Baak J.P.A. et al. Measurement
by confocal laser scanning microscopy of the volume of epidermal nuclei in thick skin sections // Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 1994. V. 16, N. 2. P. 145-152.
78. Massig J.H., Preissler M., Wegener A.R. et al. Real-time confocal laser scan microscope for examination and diagnosis of the eye in vivo // Applied optics. 1994. V. 33, N. 4. P. 690-694.
79. Tadrous P.J. Methods for imaging the structure
and function of living tissues and cells: 3. Confocal microscopy and micro-radiology // J. Pathol.
2000. V. 191, N. 4. P. 345-354.
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
Материал поступил в редакцию 22.06.2001.
CONFOCAL LASER SCANNING MICROSCOPY: PRINCIPLES, ARRANGEMENT, APPLICATION (PART 2)
E. I. Lezhnev, I. I. Popova, S. V. Kuzmin, S. M. Slashchev
Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS, Pushchino
Information on the features of CLSM application in biological investigations is given in the second part of the review. The discussion is mainly focused on the fluorescent methods most widely used in biology and medicine. Sufficiently detailed data on fluorescent dyes and standards for CLSM setting are cited since their nomenclature is wholly formed by foreign manufacturers and vendors and related to consumed materials. The features of dyes define used sources of light and photodetectors. Among numerous examples of CLSM application those are considered that can help readers, in the authors' opinion, to understand capabilities of this field of analytical microscopy. As an example, brief specifications of commercial CLSM from the leading manufacturers of optical research instrumentation are given.
