CC BY
96
_____________________ ХИРУРГИЯ
Конфокальная лазерная эндомикроскопия в диагностике заболеваний органов желудочно-кишечного тракта
В.А.Солодкий, Ю.В.Синев, О.В.Иванова, И.Б.Грунин, П.Б.Коломацкая
Российский научный центр рентгенорадиологии, Москва (директор — чл.-кор. РАМН, проф. В.А.Солодкий)
|В обзоре рассматриваются потенциальные возможности клинического применения конфокальной лазерной эндомикроскопии в диагностике заболеваний органов желудочно-кишечного тракта. Это новая неинвазиваная методика, которая позволяет посредством миниатюрного конфокального эндомикроскопа во время выполнения рутинной эндоскопической процедуры in vivo в режиме реального времени получать изображения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта в высоком разрешении (так называемые виртуальные биопсии).
Ключевые слова: конфокальная лазерная эндомикроскопия, эндоскопия, предраковые заболевания органов желудочно-кишечного тракта
Confocal Laser Endomicroscopy in the Diagnosis of Gastrointestinal Tract Diseases
V.A.Solodkiy, Yu.V.Sinev, O.V.Ivanova, I.B.Grunin, P.B.Kolomatskaya
The Russian Scientific Center ofRoentgenologyand Radiology, Moscow (Director— Corr. Member of RAMS, Prof. V.A.Solodkiy)
I There is reviewed the potential clinical application of confocal laser endomicroscopy in the diagnosis of the gastrointestinal tract. This is a new noninvasive technique that allows with the help of a miniature confocal endomicroscopy runtime routine endiscopic procedure in vivo in real time to obtain images of the mucous membrane of the gastrointestinal tract in high resolution (the so-called virtual biopsy).
Key words: confocal laser endomicroscopy, endoscopy, precancerous lesions of the gastrointestinal tract
В последние годы эндоскопия, благодаря развитию и совершенствованию медицинской техники и аппаратуры, появлению прогрессивных методик, существенно расширила свои возможности и выделилась в отдельную самостоятельную область медицины. Применение малоинвазивных технологий позволяет проводить эндоскопическое лечение ранних раков желудочно-кишечного и респираторного трактов, пищевода Барретта и т.д. Закономерно, что новые возможности лечебной эндоскопии предъявляют высокие требования к эндоскопии диагностической. Крайне важна точная и наиболее ранняя диагностика опухолевых и предраковых заболеваний, в частности желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), что, в свою очередь, служит предпосылкой к появлению и развитию новых направлений эндоскопических методов обследования.
Несмотря на то, что такие методики, какхромоэндоскопия, увеличительная эндоскопия (Zoom-эндоскопия), эндоскопия высокой четкости (HRE), узкоспектральная эндоскопия (NBI, Narrow Band Imaging), автофлюоресцентная эндоскопия (AFI), заметно улучшили детальную оценку мельчайших патологических изменений слизистой оболочки ЖКТ, выполне-
Для корреспонденции:
Коломацкая Полина Борисовна, врач отделения эндоскопических и
рентгенохирургических методов диагностики и лечения хирургического отдела
Российского научного центра рентгенорадиологии
Адрес: 117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86
Телефон: (495) 120-8526
E-mail: [email protected]
Статья поступила 04.06.2012, принята к печати 31.10.2012
ние прицельных биопсий с последующим морфологическим исследованием биоптатов остается необходимым условием для постановки окончательного диагноза.
Однако выполнение множественных биопсий или эндоскопических резекций сопряжено с известными недостатками. К ним относятся как потенциальные осложнения (кровотечения, перфорации), так и частые ложноотрицательные результаты вследствие взятия нерепрезентативных биопсий, что требует проведения повторных и дополнительных исследований. Это, вместе с дорогостоящим, трудоемким, многоэтапным процессом изготовления гистологических препаратов, приводит к значительным временным и материальным затратам.
В 2006 г. была представлена новая эндоскопическая методика — конфокальная лазерная эндомикроскопия (confocal endomicroscopy — СЕМ или confocal laser endomicroscopy — CLE). CLE — неинвазивная методика, которая посредством встроенного в эндоскоп миниатюрного конфокального эндомикроскопа позволяет получать во время рутинной эндоскопической процедуры in vivo микроскопические изображения слизистой оболочки ЖКТ в высоком разрешении, приближенном к обычной световой микроскопии.
Технические принципы конфокальной лазерной сканирующей эндомикроскопии
Впервые основная концепция конфокальной микроскопии была разработана M.Minsky в середине 50-х годов прошлого столетия в целях исследования нейронной сети в нативном препарате ткани головного мозга без предварительного
17
В.А.Солодкий и др. / Вестник РГМУ, 2012, №6, с. 17-20
окрашивания [1]. Его изобретение тогда осталось без внимания в силу отсутствия на тот момент мощного источника света, необходимого для получения изображения, и отсутствия должного компьютерного оборудования для обработки полученной информации.
Благодаря появившимся в конце 1990-х годов высокоскоростным компьютерным системам, мониторам с высоким разрешением наступил новый этап в развитии конфокальной микроскопии, что стимулировало значительный интерес к применению этого метода в клинической медицине.
Для создания конфокального изображения луч лазера определенной длины волны и низкой мощности (аргон-ионный лазер синего света, волна возбуждения 488 нм) наводится на исследуемый участок слизистой оболочки через объектив с использованием так называемого селективного зеркала. Специальное многослойное напыление из диэлектрических материалов обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти 100% пропускание света в остальном спектральном диапазоне. На образце ткани лазер освещает не все поле зрения, а фокусируется в точку. Предварительно введенные флуоресцентные вещества возбуждаются светом лазера и дают свечение, собираемое тем же объективом. Селективное зеркало отражает рассеянный образцом лазерный свет, пропуская через себя к системе детекции (фотоэлектронный умножитель, ФЭУ) флуоресцентное излучение, очищенное от паразитного светорассеяния. Для улучшения разрешения используется конфокальная диафрагма (конфокальная апертура, «pinhole»), которая помещается в той плоскости, где микроскоп фокусирует флуоресценцию, собранную из фокуса объектива. Через диафрагму проходит только та флуоресценция, которая излучается вблизи фокуса лазерного луча под объективом. Флуоресценция, испускаемая слоями выше и ниже фокуса, оказывается дефокусированной и к ФЭУ не поступает [2].
Миниатюрный конфокальный лазерный микроскоп может быть встроен либо в дистальный конец гибкого эндоскопа (гастроскоп Pentax EG-3870CIK, колоноскоп Pentax ЕС-3870CILK, Pentax, Япония), либо в автономный зонд, который подводится к исследуемому образцу ткани через «рабочий» канал обычного эндоскопа (минизонды CholangioFlex, GastroFlex, ColoFlex, GastroFlex-UHD, ColoFlex-UHD в системе Cellvizio производства Mauna Kea Technologies, Франция) [3, 4]. Краткая сравнительная характеристика конфокальных систем представлена в таблице.
Конфокальная эндомикроскопическая система Pentax
ICS-1000 (Pentax EG-3870CIK и Pentax EC-3870CILK)
Система Pentax ICS-1000 оснащена двумя мониторами: сенсорным для эндомикроскопического изображения и монитором для эндоскопического изображения; запись проводимого исследования ведется одновременно с двух мониторов. Благодаря тому что микроскоп интегрирован непосредственно в эндоскоп, можно проводить забор биопсийного материала через свободный инструментальный канал одновременно с конфокальной записью. Данное устройство позволяет получать конфокальные изображения слизистой оболочки со скоростью 1,6 кадра в секунду (1024*512 пикселей) или 0,8 кадра в секунду (1024*1024 пикселей) с изменяемой глубиной сканирования в пределах от 0 до 250 мкм. При этом поле зрения составляет 475*474 мкм, боковое разрешение —
Таблица. Сравнительная характеристика конфокальных
эндомикроскопических систем Pentax ICS-1000 и Cellvizio
Характеристика Pentax ICS-1000 Cellvizio
Тип излучения Непрерывный Непрерывный
Длина волны лазера 480 нм 488 нм
Степень увеличения *1000 *1000
Разрешение 1 мкм 1-3,5 мкм
Глубина сканирования 250 мкм 190 мкм
Поле зрения 225 625 нм2 282 600 нм2
Частота кадров Возможность мозаичной 0,8 в секунду 12 в секунду
реконструкции поверхности изучаемого Нет Да
участка Совместим
Совместимость с эндоскопами Совместим только с Pentax со всеми видами гибких и ригидных
эндоскопов
0,7 мкм, осевое разрешение — 7 мкм. В иностранной литературе данную методику получения конфокальных изображений принято сокращенно именовать eCLE (от endoscope Confocal Laser Endomicroscopy) [4].
Конфокальная эндомикроскопическая система Cellvizio
Совершенно иная концепция используется французской фирмой «Mauna Kea Technologies». Система состоит из конфокального лазерного сканирующего блока, рабочей станции с программным обеспечением и конфокальных минизондов (рис. 1). Минизонды, содержащие десятки тысяч фиброволокон и миниатюрный оптический объектив, передают сканирующий лазерный луч в зону наблюдения внутри ЖКТ или дыхательных путей и фиксируют флуоресцентный свет, отражаемый тканью [3]. Несомненным преимуществом Cellvizio является совместимость всех типов гибких и ригидных эндоскопов (Fujinon, Pentax, Olympus, Storz и др.), так как минизонды проводятся к исследуемому участку слизистой оболочки через инструментальный канал эндоскопа. При этом диаметр рабочего канала гастроскопа и колоно-скопа должен составлять не менее 2,8 мм, а бронхоскопа — не менее 2,2 мм. Для исследования желчевыводящих путей диаметр инструментального канала холангиоскопа должен быть не менее 1,2 мм.
Сами зонды представлены тремя типами и несколькими моделями в зависимости от их предназначения и оптических свойств. Зонды типа S (ColoFlex™S, GastroFlex™S, AlveoFlex™) подают свет лазера непосредственно на ткань из дистального конца волокна; диапазон глубины исследования ограничен первыми 50 мкм ткани (в зависимости от типа слизистой оболочки); латеральное разрешение составляет 3,5 мкм, а максимальное поле зрения — 600 мкм в диаметре. Зонды типа Z (ColoFlex™, GastroFlex™) позволяют проводить исследование слизистой оболочки с рабочего расстояния в несколько десятков микрон. Латеральное разрешение и поле зрения такие же, как у зондов типа S. Все зонды позволяют получать динамические (12 кадров в секунду) эндомикроскопические изображения, и отдельные кадры могут быть реконструированы по специальному компьютерному алгоритму в мозаичное изображение с расширенным полем зрения (4*2 мм).
В зарубежных литературных источниках за данной методикой получения конфокальных изображений закрепилось
18
Конфокальная лазерная эндомикроскопия в диагностике заболеваний органов желудочно-кишечного тракта
Рис. 1. Эндомикроскопическая система Cellvizio.
сокращенное обозначение pCLE (от probe-based Confocal Laser Endomicroscopy) [3, 4].
Флуоресцентные вещества
Непременным условием для получения высококонтрастного конфокального изображения является использование флуоресцентных веществ, которые применяются как системно (внутривенное введение флуоресцеина или тетрациклина), так и местно (распыление через катетер акрифлавина и крезилового фиолетового). Из перечисленных контрастных агентов в клинической практике наиболее часто применяется 10% флуоресцеин натрия — препарат, традиционно используемый в офтальмологии для флюоресцентной ангиографии и ангиоскопии сетчатки и радужной оболочки глаза. Побочные эффекты при применении флуоресцеина не выражены и включают в себя кратковременную, в течение 1-2 ч, желтуш-ность кожных покровов и окрашивание мочи в ярко-желтый цвет в течение 1-2 дней. После внутривенного введения флуоресцеин в сосудистом русле активно связывается сывороточным альбумином. Несвязанный флуоресцеин путем пассивной диффузии через капиллярные стенки поступает в межклеточное пространство, окрашивая его, а также клетки поверхностного эпителия и собственную пластинку слизистой оболочки. Продолжительность действия флуоресцеина составляет до 30 мин. Применение флуоресцеина дает возможность идентифицировать эпителиоциты, капилляры, эритроциты, межклеточное вещество. Ядра клеток не окрашиваются флуоресцеином и на конфокальных изображениях визуализируются в виде темных пятен.
Рис. 2. Расположение ткани и плоскости сканирования (Images courtesy of Professor Adrian Polglase, Cabrini Hospital, Australia).
проводить в условиях медикаментозной седации, а также использовать съемный дистальный прозрачный колпачок на эндоскоп для фиксации слизистой оболочки.
Основные отличия конфокальной лазерной микроскопии от традиционного гистологического исследования заключаются в том, что получаемые изображения слизистой оболочки ориентированы параллельно ее поверхности (en face) и представляют собой полутоновые изображения (рис. 2). С помощью конфокального сканирующего лазерного микроскопа могут быть получены как отдельные изображения сечений, так и небольшие видеозаписи для демонстрации динамических процессов, например кровотока. Таким образом, ввиду собственных технических особенностей (глубина сканирования ограничена собственной пластинкой слизистой оболочки) и фармакокинетических свойств флуоресцеина (клеточные ядра не окрашиваются) конфокальная эндомикроскопия позволяет провести быструю дифференцировку между неизмененной нормальной слизистой оболочкой и слизистой с регенеративными и опухолевыми изменениями. Определение же степени дисплазии эпителия в настоящее время пока невозможно.
Несмотря на то что от врача-эндоскописта, проводящего конфокальную микроскопию, требуются фундаментальные знания в области нормальной гистологии и патологической анатомии, через 20-30 самостоятельно проведенных процедур достигается высокая точность в постановке гистологиче-скогодиагноза, например пищевода Барретта [3, 5].
Диагностическая достоверность метода конфокальной эндомикроскопии и области его применения
Методика выполнения конфокальной лазерной эндомикроскопии и интерпретация конфокальных эндомикроскопических изображений
Через 7-10 мин после внутривенного введения от 2,5 до
5,0 мл 10% раствора флуоресцеина натрия можно приступать к исследованию. Для этого следует обеспечить довольно плотный контакт дистального конца эндоскопа (с интегрированным конфокальным микроскопом) или минизонда с интересующим участком слизистой оболочки, избегая при этом чрезмерного ее сдавления. Важное условие для получения качественных четких конфокальных изображений или записей — минимизация артефактов, возникающих вследствие перистальтики, непроизвольных и дыхательных движений пациента. С этой целью исследование рекомендуется
Показания к применению конфокальной эндомикроскопии довольно обширны и включают в себя все существующие в настоящий момент показания к выполнению биопсии.
Профессор Р.Кейсслих и его коллеги из Майна (Германия) имеют наибольший опыт работы с конфокальной системой Penfax. Они оценивали возможности и диагностическую точность метода эндомикроскопии в диагностике колоректальных аденом, пищевода Барретта, коллагенозных колитов, а также гастритов, ассоциированных с Helicobacter pylori [5-8]. И в целом можно признать, что даже первые результаты их исследований впечатляют: степень точности достигает 97% [7, 9]. Профессор С.Китабатаке с коллегами из Японии применил метод конфокальной эндомикроскопии при диагностике раннего рака желудка [10]. И в этом случае степень точности в постановке диагноза была высокой и достигала 95%.
19
В.А.Солодкий и др. / Вестник РГМУ, 2012, №6, с. 17-20
У пациентов с подозрением на пищевод Барретта применение конфокальной эндомикроскопии, как в варианте pCLE, так и в варианте eCLE, позволяет поставить данный диагноз и выявить связанные с ним неопластические изменения с точностью, превышающей 90% [4, 5]. Во время эндомикроскопии при пищеводе Барретта определяется цилиндрический эпителий (кишечный тип эпителия) с темными бокаловидными клетками, содержащими муцин, и с характерной ворсинчатой структурой; под эпителием видны субэпителиальные капилляры правильной формы как в поверхностных, так и в более глубоких слоях слизистой оболочки.
У пациентов с подозрением на целиакию конфокальная эндомикроскопия может обеспечить диагностику этого заболевания при выявлении атрофии ворсинок и увеличенного числа интраэпителиальных лимфоцитов [11].
Опухолевые изменения слизистой оболочки толстой кишки можно предсказать с высокой точностью (>95%). Четко дифференцируются гиперпластические и аденоматозные полипы [8, 12].
Конфокальная эндомикроскопия может также использоваться у пациентов с хронической диареей для выявления микроскопических колитов. Известно, что у данной категории больных эндоскопическая и рентгенологическая картина толстой кишки остается нормальной, и для постановки точного диагноза необходимо проводить множественные биопсии слизистой оболочки различных областей толстой кишки. Конфокальная эндомикроскопия позволяет у пациентов с колла-генозным колитом непосредственно во время колоноскопии выявлять субэпителиальные отложения тяжей коллагена, а у больных с лимфоцитарным колитом — внутриэпителиальную инфильтрацию лимфоцитами и исчезновение крипт. Таким образом, CLE дает возможность отказаться от взятия большого количества мультицентрических биопсий «наугад» и поставить точный диагноз в краткие сроки [6].
Для диагностики изменений в панкреато-билиарной системе применяется методика получения конфокальных изображений только с использованием минизондов (pCLE), и основная роль эндомикроскопии заключается в выявлении неопластических изменений в труднодоступных для взятия биопсии участках желчных протоков [13].
Заключение
Использование конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной эндомикроскопии значительно расширяет диагностические возможности современной гастроинтестинальной эндоскопии, позволяя получать микроскопические изображения с разрешением, близким к обычной световой микроскопии, непосредственно во время стандартного эндоскопического исследования в режиме реального времени. Конфокальная микроскопия не изменяет каким-либо образом ткани в ходе исследования, что минимизирует появление артефактов. Процедура сканирования безболезненна для пациента, проходит без повреждения слизистой оболочки, позволяет наблюдать за ее состоянием в динамике. Важнейшее преимущество метода — быстрота получения результата обследования в сравнении с классическим патогистологическим исследованием. Это позволяет не только быстро поставить точный морфологический диагноз и провести дифференциальную диагностику, выполнить предельно точную прицельную «умную» биопсию и заметно умень-
шить (в ряде случаев в 4 раза [8]) количество последующих диагностических биопсий, но и в случае необходимости безотлагательно приступить к рациональномулечению.
Литература
1. Minsky М. Memoir on inventing the confocal scanning microscopy II Scanning. 1988. V.10. P.128-138.
2. Феофанов A.B. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях II Успехи биол. хим. 2007. Т.47. С.371-410.
3. OsdoitA., Genet М., PerchantA. etal. In vivo fibered confocal reflectance imaging: totally non-invasive morphological cellular imaging brought to the endoscopist [Electronic resource] II SPIE Digital Library [Official website], Proc. SPIE 6082. Endoscopic Microscopy. 608208 (Feb. 23, 2006). DOI: 10.1117/12.646659. URL: http://proceedings.spiedigitallibrary.org/volume.aspx?conferenceid=2186&volu meid=250 (accessed: 20.06.2012).
4. Palma G.-P. Confocal laser endomicroscopy in the “in vivo” histological diagnosis of gastrointestinal tract II World J. Gastroenterol. 2009. V.15 (46). P.5770-5775.
5. Goetz M., Hoffman A., Galle P.R. et al. Confocal laser endoscopy: new approach to the early diagnosis of tumors of the esophagus and stomach II Future Oncol. 2006. V.2. P.469-476.
6. Kiesslich R., Hoffman A., Goetz M. etal. In vivo diagnosis of collagenous colitis by confocal endomicroscopy// Gut. 2006. V.55. P.591-592.
7. Kiesslich R., Goetz M.,NeurathM.F. Confocal laserendomicroscopyforgastrointestinal diseases// Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am.2008.V.18. P.451-466.
8. Kiesslich R., Goetz M., Vieth M. etal. Technology insight: confocal laser endoscopy for in vivo diagnosis of colorectal cancer II Nat Clin Pract Oncol. 2007. V.4. P.480-490.
9. Meining A., Saur D., Bajbouj M. et al. In vivo histopathology for detection of gastrointestinal neoplasia with a portable, confocal miniprobe: an examiner blinded analysis// Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2007. V.5. P.1261-1267.
10. Kitabatake S., Niwa Y., Miyahara R. et al. Confocal endomicroscopy for the diagnosis of gastric cancer in vivo// Endoscopy. 2006. V.38 (11). P.1110-1114.
11. Zambelli A., Villanacci V., Buscarini E. et al. Confocal laser endomicroscopy in celiac disease: description of findings in two cases II Endoscopy. 2007. V.39. P.1018-1020.
12. Hurlstone D.P., Baraza W., Brown S. etal. In vivo real-time confocal laser scanning endomicroscopic colonoscopy for the detection and characterization of colorectal neoplasia II Br J Surg. 2008. V.95 (5). P.636-645.
13. Meining A., Frimberger E., Becker V. et al. Detection of cholangiocarcinoma in vivo using miniprobe-based confocal fluorescence microscopy// Clin. Gastroenterol. Hepatol.2008.V.6. P.1057-1060.
Информация об авторах:
Солодкий ВладимирАлексеевич, член-корреспондент РАМН, профессор, директор Российского научного центра рентгенорадиологии Адрес: 117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86 Телефон: (495) 333-9120
Синев Юрий Викторович, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудниклаборатории эндоскопии и рентгенохирургии хирургического отдела Российского научного центра рентгенорадиологии Адрес: 117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86 Телефон: (495) 128-0762
Иванова Оксана Васильевна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудниклаборатории эндоскопии и рентгенохирургии хирургического отдела Российского научного центра рентгенорадиологии Адрес: 117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86 Телефон: (495) 120-8526
Грунин Игорь Борисович, кандидат медицинских наук, заведующий отделением эндоскопических и рентгенохирургических методов диагностики и лечения хирургического отдела Российского научного центра рентгенорадиологии
Адрес: 117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86 Телефон: (495) 120-8526
20
