CC BY
319
УДК 577.33 : 541.14
Компьютерное моделирование строения и спектров флуоресцентных белков
А.В. Немухин12*, Б.Л. Григоренко1, А.П. Савицкий1,3
1 Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3, ГСП-1, МГУ
2 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4
3 Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33, стр. 2 *Е-таіІ: anemukhin@yahoo.com
РЕФЕРАТ Флуоресцентные белки семейства зеленого флуоресцентного белка активно используются как биомаркеры в живых системах. Ответственной за поглощение света и флуоресценцию является хромофорная группа, в основе которой — молекула гидроксибензилиден-имидазолина, формирующаяся в природных условиях из трех аминокислотных остатков внутри белковой глобулы и хорошо экранированная от внешней среды. Наряду с интенсивными экспериментальными исследованиями свойств флуоресцентных белков и соответствующих хромофоров биохимическими, кристаллографическими и спектральными методами для характеризации их строения и спектров в последние годы применяется компьютерное моделирование. В обзоре приведены наиболее интересные результаты молекулярного моделирования структурных параметров, оптических и колебательных спектров хромофорсодержащих областей флуоресцентных белков методами квантовой химии, молекулярной динамики и комбинированными подходами квантовой и молекулярной механики. Основное внимание уделено корреляции теоретических и экспериментальных данных и предсказательным возможностям моделирования, которые полезны для создания новых эффективных биомаркеров.
Ключевые слова: зеленый флуоресцентный белок, молекулярное моделирование, молекулярная динамика, молекулярная механика.
Список сокращений: комбинированные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), молекулярная динамика (МД), метод теории функционала плотности с учетом зависимости от времени (TD-DFT).
ВВЕДЕНИЕ
Открытие и применение цветных белков семейства зеленого флуоресцентного белка [1-7] привело к лавинообразному всплеску интереса исследователей к этим удивительным объектам. Их практическая ценность объясняется возможностью метить цветными белками клеточные клоны и затем в буквальном смысле наблюдать за ходом внутриклеточных событий. Биотехнологические перспективы связаны с многоцветной маркировкой, в частности с возможностями наблюдать за межбелковыми взаимодействиями в живых системах. Достаточно полно характеризованные в кристаллографических исследованиях, эти белки имеют бочкообразную структуру (рис. 1), состоящую из плотно подогнанных Р-листов, хорошо экранирующих от внешней среды хромофорную группу, в основе которой - молеку-
ла гидроксибензилиден-имидазолина (рис. 2), формирующаяся в природных условиях из трех аминокислотных остатков внутри белковой глобулы. Превращения, происходящие с хромофорной группой внутри этой макромолекулы при освещении определенными длинами волн, лежат в основе фотофизических свойств флуоресцентных белков.
Изучению всех аспектов строения и механизмов действия флуоресцентных белков посвящены усилия исследователей разных специальностей. В настоящем обзоре преимущественно анализируются работы по компьютерному моделированию структуры и спектров этих систем. Применение современных приемов молекулярного моделирования [8] может оказать заметную поддержку экспериментальным работам, позволяя существенно снизить
временные и материальные затраты на всестороннее исследование механизмов процессов, протекающих в столь сложных молекулярных системах. Понятно, что описание переходов между электронными состояниями хромофорных молекул, ответственных за поглощение и излучение света, требует применения квантовой теории, и адекватным инструментом моделирования в этом отношении является квантовая химия. Конформационные состояния белковой макромолекулы и структура хромофорсодержащей области также крайне важны для свойств флуоресцентных белков, что определяет применение методов молекулярной механики и молекулярной динамики. Все эти подходы требуют значительных компьютерных ресурсов, а также наличия эффективных алгоритмов и компьютерных программ.
Модели квантовой химии основаны на представлении молекулярных систем как совокупности ядер и электронов, что приводит к необходимости численного решения уравнения Шредингера с использованием приближений разного уровня точности. В настоящее время существует достаточно развитая иерархия квантовохимических подходов, каждый из которых ориентирован на определенные задачи. В частности, для расчетов структурных параметров, т.е. для определения геометрических конфигураций точек минимальной энергии на потенциальной поверхности основного электронного состояния модельной молекулярной системы, и для расчетов колебательных спектров сейчас чаще всего применяют методы теории функциона-
ла электронной плотности. Для расчетов характеристик возбужденных электронных состояний, включая расчеты энергий переходов между состояниями, позволяющие оценивать положения полос в оптическом спектре или нахождение точек конических пересечений, предпочтительны построения с многоконфигурационными волновыми функциями [9]. На практике используются известные пакеты программ квантовой химии, наиболее популярные из которых: GAUSSIAN, GAMESS, MOLPRO, NWCHEM, TURBOMOLE.
В методах молекулярной механики и молекулярной динамики поверхности потенциальной энергии, которые в квантово-химических моделях подлежат прямому расчету, аппроксимируются аналитическими функциями, учитывающими растяжения химических связей, деформацию валентных и двугранных углов, взаимодействие валентно несвязанных атомов, электростатические вклады, иногда и другие добавки. Для каждого подобного вклада в энергию записывается выражение, содержащее параметры, и подбору этих параметров (т.н. силовых полей) уделялось и продолжает уделяться внимание большого числа исследовательских групп. Для компьютерного моделирования белковых систем популярны наборы параметров силовых полей AMBER, cHARMM, OPLSAA, GROMOS и др.
Определенный прорыв в развитии молекулярного моделирования свойств биомолекулярных систем связан с внедрением т.н. комбинированных методов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). Согласно основной
Рис. 2. Молекула хромофора GFP. Верхняя часть (а): анионная форма; нижняя часть (б): нейтральная форма. Здесь и далее зеленым цветом выделены атомы углерода, красным — кислорода, синим — азота
идее этого подхода [10], меньшая часть белковой макромолекулы, в которой важны перераспределения химических связей или переходы между электронными состояниями, включается в квантовую подсистему, и энергии и силы в ней рассчитываются различными методами квантовой химии. Большинство же атомов, окружающих эту выделенную центральную часть, относится к молекулярномеханической подсистеме, моделируемой силовыми полями. В приближениях КМ/ММ энергия каждой точки на потенциальной поверхности складывается из энергии квантовой части в поле ММ-подсистемы и молекулярномеханической энергии. Расчеты и анализ подобных композитных поверхностей потенциальной энергии позволяют исследовать фотофизические процессы с хромофорными молекулами с учетом белковой матрицы.
Далее мы рассмотрим наиболее интересные результаты молекулярного моделирования структурных параметров, оптических и колебательных спектров хромофорсодержащих областей флуоресцентных белков методами квантовой химии, молекулярной динамики и комбинированными подходами КМ/ММ. Основное внимание уделено корреляции теоретических и экспериментальных данных и предсказательным возможностям моделирования.
моделирование структуры и динамики флуоресцентных белков с использованием классических силовых полей
Макромолекулы флуоресцентных белков содержат лишь пептидные группы, для которых известны наборы параметров силовых полей общепринятых библиотек молекулярной механики и молекулярной динамики (МД). Однако в самой хромофорной группе, формирующейся в результате циклизации аминокислотных остатков с участием кислорода, встречаются новые типы атомов. В работе Ройтер и др. [11] сообщаются параметры, совместимые с силовым полем СНАИММ, для молекулы 4'-гидроксибензилиден-2,3-диметилимидазолинона - модели хромофорной группы зеленого флуоресцентного белка GFP, которые были подобраны по результатам квантово-химических расчетов. Первые работы по вычислениям и анализу достаточно коротких классических МД траекторий [11, 12] для нативно-
го и мутированного вариантов GFP проводились на основе координат тяжелых атомов кристаллографических структур 1ЕМА, 1ЕМВ из базы данных белковых структур [13]. Здесь уместно заметить, что координаты атомов, которые помещаются в эту базу данных на основании экспериментальных исследований методами рентгеноструктурного анализа или ядерно-магнитного резонанса, очень часто предварительно уточняются по компьютерным расчетам с программами, основанными на методе молекулярной механики. Моделирование позволяет достроить недостающие атомы водорода в модельных структурах белковых макромолекул, хотя и возникают известные неоднозначности, прежде всего для остатков гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот. Кроме демонстрации достаточной жесткости белковой глобулы в работах [11, 12] приведены карты распределений водородных связей около хромофорной группы как в нейтральной, так и в анионной формах. Для иллюстрации пользы этой информации мы приводим на рис. 3 картину водородных связей около хромофора GFP, полученную в наших оригинальных расчетах.
Известные оптические свойства GFP[14] - наличие двух главных полос поглощения около 400 нм и 480 нм (для нативного типа белка) - связываются с возможностью нахождения хромофорной группы как в нейтральном состоянии с коротковолновым поглощением (форма А, рис. 2а), так и в ионизированном состоянии с длинноволновым поглощением (форма В, рис. 2б). Поскольку сеть водородных связей должна обеспечивать перемещение протонов, связывающее эти две формы (как считается, через промежуточную конформацию I), то анализу ее строения, а также моделированию переноса протонов уделялось большое внимание с самых первых работ. В этом разделе мы упоминаем только теоретические работы, выполненные с классическими моделями. В частности, в рамках метода молекулярной механики анализировалась роль вращения боковой цепи Т^203 (рис. 3), предположительно способствующего переходу между формами А и В [15]. По результатам де-
Агд96
Рис. 3. Иллюстрация сетки водородных связей (черный пунктир) около хромофора GFP. Нумерация аминокислотных остатков соответствует структуре PDB Ю: 1ЕМА
R, но
Cis
Trans
Рис. 4. Цис-транс-изомеризация хромофора GFP
тальных молекулярно-динамических расчетов в работах [16, 17] были сформулированы предположения о путях переноса протонов между различными формами хромофора с участием молекул воды и боковых цепей ближайших аминокислотных остатков. Последствия миграции протонов по сетям водородных связей, причем достаточно протяженным - вплоть до выхода на поверхность белка, для интерпретации фотофизических процессов с GFP, обсуждаются в работах [18, 19].
По результатам расчетов методами молекулярной механики в работах [20-22] и молекулярной динамики в работах [23-25] анализировалось другое важнейшее преобразование в флуоресцентных белках, а именно цис-транс- изомеризация хромофорной группы (рис. 4). Наибольшее значение цис-транс-изомеризация может иметь для т.н. мерцающих цветных белков, в которых флуоресцентные состояния, возникающие на определенное время в зависимости от внешних факторов, чередуются с темными состояниями. Основная рабочая гипотеза объяснения механизма подобных явлений основана на допущении цис-транс-изомеризации хромофорной группы внутри белка для достижения флуоресцентного состояния и его тушения. В следующих разделах настоящей статьи, в которых рассматриваются результаты квантовых расчетов, этой гипотезе также уделяется значительное внимание.
Весьма интересный результат моделирования цис-транс-изомеризации хромофора с учетом белкового окружения, кроме того, иллюстрирующий современные возможности метода классической молекулярной динамики, сообщается в недавней работе [25]. Авторы построили профили свободной энергии (профили потенциала средней силы) для температуры 300 К вдоль угла внутреннего вращения ф (рис. 4) для хромофора GFP в белковой матрице мутанта Ser65Thr, включая все атомы белка и почти 9000 молекул воды, образующих сольватную оболочку. При этом авторы модифицировали параметры силового поля AMBER (используя результаты квантово-химических расчетов), так чтобы они могли относиться к возбужденному электронному состоянию. Была использована т.н. направленная молекулярная динамика, стимулируя вращение вокруг угла ф, с помощью которой удается вывести модельную систему из режима небольших осцилляций около положения минимума энергии и проанализировать обширные области конфигурационного пространства. По результатам расчетов найдено, что для перевала через энергетический барьер и, соответственно, для того чтобы сдвинуться в сторону цис-транс-изомеризации хромофора по координате ф, надо затратить примерно 8 ккал/моль.
В работе [23], в частности, описаны результаты моделирования методами классической МД процесса транс-цис-изомеризации хромофора другого цветного белка, asCP (или asFP595) [26], для которого характерна разгорающаяся флуоресценция. Это означает, что для перевода изначально нефлуоресцентной формы белка в состояние с красным свечением необходимо облучение белка интенсивным зеленым светом, что предположительно связано с фото-индуцированной транс-цис-изомеризацией хромофорной группы. Расчеты траекторий [23, 27], которые были проведены с параметрами силового поля OPLSAA, позволяют составить наглядное представление о возможных движениях хромофора и ближайших аминокислотных остатков при предполагаемых процессах.
В работе [28] методами классической МД изучалась возможность цис-транс-изомеризации хромофора в основном электронном состоянии в белке Dronpa [29], для которого наблюдается индуцированное светом переключение от флуоресцентного к темному состоянию. Как и в случае других фотопереключаемых цветных белков, проверяется гипотеза, что именно изомеризация хромофора ответственна за изменение фотофизических свойств белка. Авторы [28] использовали силовое поле AMBER с добавлениями необходимых параметров для хромофорной молекулы по результатам квантово-химических расчетов. Было показано, что хромофорная группа остается в цис-конформации, но точечные мутации по позициям ближайших аминокислотных остатков способствуют повышению подвижности белковой макромолекулы.
Недавно группой с факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова [30] метод классической МД был использован для моделирования структурных особенностей мономерного красного флуоресцентного белка mRFPl при точечных мутациях по позиции Glu66.
В конце этого раздела следует отметить, что методам молекулярной механики и молекулярной динамики пока нет альтернативы при моделировании конформационных состояний белков. Расчет равновесных координат атомов и анализ эволюции со временем геометрических параметров белковых макромолекул с числом атомов порядка нескольких тысяч может быть практически осуществлен только в рамках классической механики с эмпирическими или полуэмпирическими силовыми полями. Несомненным достижением подобного моделирования для флуоресцентных белков является анализ распределений водородных связей в хромофорсодержащей области, поскольку параметры общепринятых силовых полей AMBER, CHARMM неплохо калиброваны на описание водородных связей. Что касается рассчитываемых энергетических характеристик, например, энергетических барьеров внутреннего вращения при цис-транс-измеризации хромофора и в основном, и тем более в возбужденном состоянии, то к этим результатам следует относиться с осторожностью, понимая их высокую чувствительность к не столь надежно определенным параметрам силовых полей. Качественные результаты МД моделирования - эволюция со временем сетки водородных связей, грубые оценки энергетических барьеров при конформационных превращениях при движении пептидных групп или хромофорных групп - безусловно, полезны и предоставляют важную
информацию. Для более аккуратных оценок характеристик химических превращений, включая перемещения протонов по сетям водородных связей, и для анализа сечений поверхностей потенциальной энергии в основном и в возбужденных состояниях необходимо обращаться к квантовым расчетам.
квантовая химия хромофоров в газовой фазе и в растворах
Первые же квантово-химические расчеты электронной структуры модельной молекулы хромофора GFP [31-34] позволили четко отнести индуцированное светом электронное возбуждение (фотопоглощение) к переходу между син-глетными состояниями S0 ^ S1. В терминах орбиталей этому соответствует переход электрона с высшей занятой молекулярной орбитали (ВЗМО) п-типа на низшую вакантную молекулярную орбиталь (НВМО) п*-типа. На рис. 5 изображен вид этих орбиталей для анионной формы молекулы 4-гидроксибензилиден-имидазолинона (также рис. 4), рассчитанных в работе [35]. Важное заключение, которое следует из рассматривания вида орбиталей - возбуждение меняет локальные характеристики электронной плотности в районе мостикового фрагмента, связывающего фе-нильное и имидазолиноновое кольца хромофорной группы. В результате выравниваются характеристики исходных (в основном состоянии) ординарной (С-СН) и двойной (-СН=С) химических связей, что потенциально облегчает
Рис. 5. Средняя часть: молекула гидро-ксибензилиден-имидазолинона в цис-анионной форме, моделирующая хромофорную группу GFP; нижняя часть: высшая занятая молекулярная орбиталь (ВЗМО); верхняя часть: низшая вакантная молекулярная орбиталь (ВЗМО)
ВЗМО
НВМО
внутреннее вращение вокруг первоначально двойной связи (угол т на рис. 4).
Вопрос о как можно более точном расчете важнейших количественных характеристик хромофорных групп цветных белков семейства GFP - разностей энергий при возбуждении ^ S1) и возврате в основное состояние ^ ^ S0), что сопоставляется с положениями максимумов полос в спектрах поглощения и флуоресценции, и соответствующих интенсивностей, а также рельефов поверхностей потенциальной энергии и в основном, и в возбужденном состоянии, что необходимо для объяснения фотопревращений с хромофорными группами, постоянно обсуждается среди специалистов по вычислительной квантовой химии. По-видимому, первый обзор ранних расчетов приведен в работе Хелмса [36], одно из недавних обсуждений достижений квантовой химии для отдельных молекул хромофоров содержится в работе [37]. Методические аспекты квантово-химических приближений для моделирования фотохимических процессов с органическими молекулами достаточно подробно изложены в обзорных статьях [9, 38, 39]. Чтобы не увязнуть в названиях и деталях приближений квантовой химии, используемых в настоящее время для компьютерных расчетов характеристик органических хромофоров в основном и в возбужденных электронных состояниях, мы ограничимся лишь достаточно поверхностным описанием наиболее употребляемых подходов. Мы позволим себе приводить некоторые устоявшиеся сокращения, обозначенные латинскими буквами.
Расчет равновесных геометрических параметров молекул с числом атомов до сотни в основном электронном состоянии с очень хорошей точностью не представляет большой проблемы. Как правило, методами теории функционала электронной плотности (DFT), которыми уверенно владеет множество химиков, можно рассчитать трехмерную геометрическую структуру хромофорной молекулы и детально рассмотреть ее на мониторе с помощью подходящей компьютерной программы визуализации.
Трудности моделирования оптических спектров связаны с необходимостью соблюдать сопоставимую точность при расчетах основного состояния с доминирующей электронной конфигурацией...п2 и возбужденного состояния с доминирующей конфигурацией...п^п*1 (многоточие перед ВЗМО п-типа относится ко всему набору предшествующих молекулярных орбиталей, которые дважды заселены электронами). Вообще говоря, и в основном состоянии неплохо учитывать смешивание электронных конфигураций, что видно из графа резонансных структур, например, анионной формы хромофора GFP (рис. 6). Соответственно, подходящими представляются подходы квантовой химии с многоконфигурационными волновыми функциями. Весьма часто встречающееся в фотохимии органических молекул обозначение CASSCF (т.е. для метода самосогласованного поля в полном пространстве активных орбиталей) относится именно к многоконфигурационным приближениям квантовой химии.
Поскольку работа с многоконфигурационными приближениями требует навыка, наличия мощной вычислительной техники и терпения (надо долго ждать результатов), возникает соблазн использовать что-нибудь попроще. И в первых работах по расчетам спектров поглощения
хромофоров цветных белков [31-33, 40, 41], и в работах последних лет [27, 42, 43] часто получаются довольно неплохие результаты для положений максимумов оптических полос и интенсивностей с использованием действительно очень простых полуэмпирических методов типа ZШDO
[44], в которых удачным подбором параметров по реперным экспериментальным данным скомпенсированы существенные упрощения теории электронной структуры молекул. Как всегда бывает с полуэмпирическими подходами, заранее не ясно, в каких конкретных случаях они приведут к успеху, а в каких - к большим ошибкам.
Еще более сложна ситуация с другим современным методом расчета разностей энергий основного и возбужденного электронных состояний, который становится весьма популярным среди пользователей квантово-химических компьютерных программ вследствие простоты его применения - методом теории функционала плотности с учетом зависимости от времени (TD-DFT). В ряде случаев метод TD-DFT дает прекрасное согласие с экспериментальными данными для положений максимумов полос поглощений в оптических спектрах органических хромофоров, но в других случаях результаты существенно более скромные [35], причем причины неудач носят принципиальный характер
[45] из-за ошибок в описании состояний с переносом заряда, которые как раз характерны для подобных молекул.
Если сравнивать достижения этих двух «дружественных для пользователя» методов расчета параметров полос в спектрах поглощения хромофоров цветных белков, ZШDO и TD-DFT, то уже в первой работе [41], в которой, в частности, моделировались свойства хромофора красного флуоресцентного белка DsRed [46], отмечалось, что результаты, полученные с использованием ZШDO, ближе к экспериментальным данным, чем с TD-DFT. В недавней работе [42] сравнение вычисленных спектральных характеристик анионов хромофоров белков GFP и DsRed проводится с результатами экспериментальных оценок методами фоторазрушающей спектроскопии в газовой фазе [47-49]. Для анионной формы хромофора GFP (экспериментальное значение положения полосы поглощения - 479 нм [47,
Рис. 6. Резонансные структуры анионной формы хромофора GFP
ХХ<>
О
48]) метод ZШDO позволяет получить 477-481 нм, а вычисленное методом TD-DFT положение интенсивной полосы поглощения (390 или 405 нм в зависимости от деталей расчетной схемы) существенно отличается от экспериментальной величины. Для анионной формы модельного хромофора, синтезированного по мотивам хромофорной группы белка DsRed, экспериментально получено положение полосы поглощения 521 нм [49], в расчетах методом ZШDO - 533 нм, в расчетах методом TD-DFT - 449 нм. Подобный же вывод можно сделать по результатам работы [43], в которой вычислялись спектральные параметры аниона хромофора GFP, - метод ZШDO позволяет получить практически совпадающее с экспериментальным положение полосы поглощения, а метод TD-DFT значительно завышает вертикальную энергию возбуждения с отличием от экспериментальной длины волны (479 нм) на 50-90 нм в синюю сторону. Тем не менее снова отметим, что к предсказаниям полуэмпирического подхода ZШDO следует относиться с осторожностью, причем не понятно, каким образом его можно систематически улучшать, в отличие от подхода TD-DFT, для совершенствования которого рано или поздно будут найдены более надежные представления функционала электронной плотности. Пока что регулярно появляются все новые публикации, в которых приводятся результаты расчетов энергий возбуждения хромофорных молекул от различных цветных белков в разных вариантах приближения TD-DFT [27, 35, 37, 50-55].
Вернемся к более обоснованным в квантовой теории, но «недружественным для пользователя» методам на основе многоконфигурационных приближений, применение которых требует значительных компьютерных ресурсов и наличия опыта квантово-химических расчетов. Потенциально именно эти методы необходимы для решения более широкого класса задач, чем расчеты полос поглощения молекул хромофоров, а именно вычисления сечений поверхностей потенциальной энергии возбужденных электронных состояний с локализацией геометрических конфигураций точек минимумов (с последующим расчетом спектров флуоресценции), точек сближения энергетических поверхностей возбужденного и основного состояний - т.н. точек конических пересечений, в окрестности которых происходит безызлучательное гашение фотовозбуждения, проводятся в рамках многоконфигурационных подходов.
Применение более простых [34] и более сложных [37, 55, 56] вариантов, в которых учитывается простое смешивание электронных конфигураций (устоявшийся термин в квантово-химической литературе - «взаимодействие конфигураций») для вычислений разностей энергий основного и возбужденных состояний хромофорных молекул в вакууме, позволяет в хороших приближениях давать оценки для положений полос в оптических спектрах с характерными ошибками в интервале 20-50 нм. Дополнительные усилия (см. [9, 38, 39] для знакомства с деталями) затрачиваются на оптимизацию орбиталей, входящих в многоконфигурационные волновые функции, чтобы сделать эти орбитали подходящими «в среднем» для основного и возбужденных электронных состояний, и на оптимальный выбор числа орбиталей, заселяемых электронами в основном и возбужденных состояниях, - таким образом приходят к методу CASSCF с усреднением по состояниям,
SA-CASSCF, который в настоящее время представляется базовым для расчетов потенциальных поверхностей возбужденных состояний органических хромофоров. Для достижения большей точности к энергиям метода SA-CASS-CF добавляют поправки по теории возмущений, и только после этого удается уменьшить погрешности при оценках максимумов положений полос в оптических спектрах газофазных хромофоров до 15-20 нм. Примеры столь изощренных расчетов приведены в работах [37, 57, 58] для хромофора GFP, [59] - для хромофора asFP595. В работах [58, 59] рассмотрены различные состояния протонирования хромофорных молекул.
На рис. 7 показана схема, иллюстрирующая возможные превращения хромофорной молекулы (на примере GFP) при фотовозбуждении. При переходе из точки минимальной энергии в основном состоянии S0 на потенциальную поверхность возбужденного состояния S1 за счет релаксации геометрических параметров молекула может оказаться в энергетическом минимуме, из которого возможна флуоресценция. Движение по потенциальной поверхности возбужденного состояния может привести к точке конического пересечения S1/S0 с достаточно измененной геометрической конфигурацией молекулы, через которую осуществляется возврат в основное состояние.
Подобная картина, которую можно надежно рассчитать только методами квантовой химии на основе SA-CASSCF, предоставляет важнейшую информацию о фотофизиче-ских процессах с хромофорными молекулами. Первое такое исследование для анионной формы хромофора GFP для вакуумных условий было описано в работе [57]. Позже были выполнены расчеты для газофазных хромофоров зеленого (GFP) и красных (DsRed, asFP595) белков в анионной форме для цис- и транс-конформаций [60-62]. Объяснение фотоизомеризации хромофорных групп возможно только после анализа подробных картин.
Кроме расчетов возбужденных состояний методы квантовой химии применялись для вычислений геометрических структурных параметров, колебательных спектров и для анализа возможных перегруппировок в основном электронном состоянии в модельных системах, описывающих хромофорную молекулу с соседними молекулярными группами, по мотивам белковой структуры. Первые такие расчеты для достаточно большого молекулярного кластера, моделирующего хромофорсодержащую область GFP, описаны в работе [63]. Авторы работы [64] рассчитали в рамках кластерной модели пути переноса протонов вдоль водородных связей (рис. 3) в хромофорсодержащей области GFP в основном электронном состоянии. Найдено, что активационные барьеры для подобных перемещений достаточно небольшие.
Колебательные спектры различных протонированных форм хромофора GFP были рассчитаны в работе [65] с использованием достаточно популярной неэмпирической молекулярной динамики Кара-Паринелло - методики, основанной на оценках сил, действующих на ядра атомов, приближенным решением квантовых уравнений по теории функционала электронной плотности. В последующей работе [66] рассмотрена модель хромофорсодержащей области GFP большего размера. Проведено прямое сопоставление с результатами экспериментальных исследова-
ний спектров комбинационного рассеяния GFP и молекулы хромофора. Рассчитанные по той же методике полосы в колебательном спектре комбинационного рассеяния хромофоров DsRed сообщаются в работе [67]. В публикации [68] сообщается о результатах расчетов методами квантовой химии колебательных спектров для хромофорных молекул GFP в различных состояниях протонирования. Несмотря на бесспорную пользу расчетов колебательных спектров для небольшой модельной системы, состоящей из хромофорной группы в газовой фазе, очевидны и недостатки такого подхода, прежде всего связанные с недостаточным учетом белкового окружения (даже с включением в модельную систему упрощенных молекулярных групп пептидных цепей). Более интересными представляются результаты подходов, в которых принимается во внимание влияние растворителя, например в работах [69, 70], рассмотренных далее.
Моделирование характеристик молекул хромофоров в растворе методами квантовой химии представляет важный этап в исследовании влияния молекулярного окружения конденсированных сред на их свойства. Обычно рассматриваются либо непрерывные модели, описывающие растворитель как среду с определенным значением диэлектрической постоянной, в полость которой вписывается молекула растворенного вещества, либо дискретные модели с явным введением молекул растворителя в анализируемую систему.
В работе [71] авторы использовали непрерывную модель растворителя и полуэмпирический метод расчета энергий электронного возбуждения [31] для оценок сольвато-хромных сдвигов оптических спектров хромофоров GFP
Структура хромофора в точке минимума возбужденного состояния S1
минимума основного состояния S0
Рис. 7. Иллюстрация превращений хромофорной молекулы GFP в цис-анионной форме при фотовозбуждении
в различных протонированных состояниях при переходе от газовой фазы к этанолу. Отмечалась качественная корреляция между теоретическими и экспериментальными результатами.
Важные результаты были получены в работе [72], в которой диаграмма, иллюстрирующая фотопревращения нейтральной формы хромофора GFP (рис. 7), была рассчитана для модельной системы, включающей хромофорную молекулу в окружении явно заданных молекул воды. Были рассчитаны сечения поверхности потенциальной энергии основного и возбужденного состояний и определены координаты точек минимумов и конических пересечений. Для практического осуществления столь сложных расчетов была применена полуэмпирическая методика квантовой химии АМ1 со специально подобранными для этой задачи параметрами. Главный вывод из этой работы, который активно цитируется в литературе по исследованию флуоресцентных белков, сводится к тому, что растворитель на порядок уменьшает время жизни возбужденного электронного состояния хромофора по сравнению с газовой фазой. В отличие от вакуумных условий в окруженном молекулами растворителя хромофоре облегчается вращение вокруг двойной связи мостиковой группы (рис. 4). В недавней статье [73] моделирование молекулярной динамики нейтральной формы хромофора GFP в окружении молекул воды описано с использованием неэмпирического квантовохимического приближения SA-CASSCF для расчетов потенциальных поверхностей. Подтвержден качественный вывод о большей эффективности тушения возбуждения в растворе по сравнению с газовой фазой.
В работах [70, 71] описаны расчеты колебательных спектров и энергетических профилей тушения фотовозбуждения различных протонированных форм хромофора GFP в водном растворе. Применены непрерывные модели растворителя (т.н. поляризационная континуальная модель, PCM) и использованы неэмпирические методы квантовой химии на основе cASScF для вычислений энергий на потенциальных поверхностях. Также подтверждена возрастающая эффективность внутренней конверсии в растворителе.
Другой подход к моделированию свойств модифицированного хромофора GFP в различных протонированных формах в цис- и транс-конфигурациях в водном растворе продемонстрирован в работе [52]. Распределение частиц в модельной системе, состоящей из хромофора и сольватной оболочки из 857 молекул воды, анализировалось методом Монте-Карло для условий NPT ансамбля. Для расчетов энергий хромофора в возбужденном состоянии применялись варианты TD-DFT и CASSCF, причем отмечались явные преимущества метода cASScF. Проанализированы сольватные сдвиги в спектрах поглощения и возможность цис-транс-изомеризации хромофора в растворе. Та же методика применена и в последующей работе [74], в которой анализировались свойства хромофора DsRed.
Авторы работы [55] вычисляли положения максимумов полос поглощения в спектрах достаточно большой серии хромофоров типа GFP с модификациями в самой хромофорной молекуле, применяя непрерывную модель водного растворителя PcM и различные варианты для расчетов энергий возбуждения. Сделан вывод о достаточно плохом
согласии теоретических и экспериментальных результатов, хотя качественные корреляции могут быть установлены. Синтетические молекулы на основе хромофора GFP также исследовались экспериментально в водном растворе в работе [75] с теоретическими оценками оптических спектров методом TD-DFT с учетом растворителя в рамках непрерывной модели PCM.
В работе [76] оптические спектры хромофора белка asFP595, 2-ацетил-4-(п-гидроксибензилиден)-1-метил-5-имидазолона были экспериментально исследованы в нескольких растворителях при различных значениях pH. В водном растворе полоса при 418 нм была отнесена к нейтральной, а полоса при 520 нм - к анионной формам молекулы хромофора. Положения максимумов полос поглощения в этаноле, пропаноле и диметилформамиде оказались значительно сдвинутыми по отношению к водной системе, причем не прослеживалась корреляция с соответствующими значениями диэлектрической постоянной растворителя. Моделирование спектров было выполнено для различных протонированных состояний хромофорной молекулы в цис- и транс-конформациях в растворах воды, этанола, ацетонитрила и диметилсульфоксида [35]. Использовалась непрерывная модель растворителя PCM и метод TD-DFT для расчета энергий возбуждения. Данные, приведенные в табл., хорошо иллюстрируют соотношение экспериментальных и теоретических результатов. Очевидна качественная корреляция - и в том, и в другом случае отмечается слабая зависимость положений полос от растворителя. Очевидно отнесение более коротковолновой полосы поглощения к нейтральной форме хромофора, а более длинноволновой - к анионной, хотя количественные расхождения достаточно большие - до 50 нм. По экспериментальным данным нельзя отнести наблюдаемые спектры либо к транс-, либо к цис-конформации хромофора в растворе. Расчеты энергий обеих конформаций и в вакууме, и в водном растворе уверенно предсказывают энергию цис-конформации ниже примерно на 1.5 ккал/моль. Рас-
Таблица. Сравнение вычисленных [35] и измеренных [76] (жирным шрифтом в скобках) длин волн максимумов полос поглощения хромофора белка asFP595. Звездочкой отмечены величины, измеренные в диметилформамиде с £ = 38.3
Растворитель Нейтральная форма Анионная форма Цвиттерионная форма
Цис-конформация
Вакуум (£ = 1) 430 484 521
Этанол (£ = 24.3) 453 (425) 504 (542) 538
Ацетонитрил (£ = 36.3) 453 (422*) 502 (572*) 537
ДМСО (£ = 47.2) 458 (422*) 511 (572*) 545
Вода (£ = 80) 453 (418) 502 (520) 537
Транс-конформация
Этанол (е = 24.3) 438 (425) 476 (542) 504
Вода (е = 80) 437 (418) 474 (520) 538
Рис. 8. Структура переходного состояния аниона хромофора GFP на пути от цис-изомера к транс-изомеру в оболочке из молекул воды
четы не подтверждают высказанную авторами работы [76] гипотезу о том, что слабая флуоресценция, наблюдаемая в растворе хромофорной молекулы в диметилформамиде, свидетельствует о близости оптических свойств этого раствора к свойствам белка asFP595.
Вопрос о возможности цис-транс-изомеризации хромофоров цветных белков в растворах обсуждается в течение достаточно длительного времени [77]. В экспериментах, описанных в работе [78], показано, что в водном растворе хромофор GFP, например в анионной форме, может переходить от одной конформации к другой с активационным энергетическим барьером, оцененным по кинетическим данным с уравнением Аррениуса, порядка 13 ккал/ моль. В то же время ранние квантово-химические расчеты [33] приводили к барьерам более 50 ккал/моль. Это расхождение удалось сгладить только недавно - в работе [79] был рассчитан энергетический профиль для цис-транс-изомеризации аниона хромофора GFP в воде с весьма близкими к экспериментальным оценкам барьерами 10-11 ккал/моль, причем этот теоретический результат получается и в рамках новых версий непрерывных моделей растворителя, и в рамках дискретной модели с явным учетом молекул воды в первой сольватной оболочке. На рис. 8 изображена структура модельной системы в конформации на вершине активационного барьера при переходе от цис-изомера к транс-изомеру. В работе [79] показано, что для адекватного описания энергетического профиля реакции изомеризации необходимо использовать многоконфигурационные подходы квантовой химии.
Наконец упомянем еще об одном важном приложении компьютерного моделирования свойств хромофорных групп флуоресцентных белков в растворах - о расчетах констант кислотности (рКа). Эта информация весьма полезна для анализа свойств хромофоров в белковых матрицах, поскольку помогает составить представление о состоянии протонирования хромофора и путях переноса протонов по сетям водородных связей. Расчет значений рКа проводится с использованием термодинамического цикла, компонентами которого являются свободные энер-
гии депротонирования по позиции определенного атома в газовой фазе и свободные энергии сольватации протони-рованной молекулы, соответствующего аниона и свободная энергия сольватации протона. Необходимо провести серию квантово-химических вычислений параметров молекулярных частиц (включая равновесные геометрические параметры и частоты колебаний) в газовой фазе и в растворе, в последнем случае в рамках непрерывных моделей растворителя. Для кислородных и азотных центров хромофоров GFP подобная процедура и результаты вычислений описаны в работах [80-82]. Авторы работы [81] оценили значения pKa для возбужденного электронного состояния. В работе [82] приведены вычисленные величины pKa для хромофоров цветных белков asFP595 и zFP538 в транс-и цис-конформациях.
В заключение этого раздела следует подчеркнуть абсолютную необходимость квантово-химических расчетов для моделирования свойств хромофоров флуоресцентных белков, даже несмотря на их существенную ресурсоем-кость. По мере совершенствования вычислительных методов квантовой химии они с неизбежностью будут становиться все более «дружественными для пользователя». Показательным примером является процедура расчета геометрической структуры (равновесных геометрических параметров в основном электронном состоянии) для молекул с числом атомов до 100 - весьма надежные результаты можно получать на персональных компьютерах, даже особенно не вникая в суть алгоритмов. Пока такой сервис недоступен для моделирования всего процесса фотовозбуждения, но со временем ситуация может измениться.
моделирование свойств флуоресцентных белков методом км/мм
Моделирование свойств хромофоров внутри белковой матрицы целесообразно проводить с применением комбинированных методов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). Очевидно, что к квантовой подсистеме следует отнести хромофорную группу с проведением границы между КМ- и ММ-частями, так чтобы все сопряженные связи, ответственные за поглощение и испускание света, описывались квантовыми уравнениями. Также разумно включить в КМ-часть ближайшие к хромофорной молекуле боковые цепи аминокислотных остатков, которые могут участвовать в переносах протонов, затрагивающих хромофорную группу. Размер квантовой подсистемы может достигать сотни атомов для практически осуществимых расчетов. Рис. 9 иллюстрирует возможный вариант выбора КМ-подсистемы для расчетов методом КМ/ММ свойств белков семейства GFP. Хромофорная группа (здесь от белка asFP595) представлена в КМ-части практически полностью. Боковые цепи остатков Glu, His, Ser, а также молекула воды могут участвовать в переносе протонов. Боковая цепь Arg с положительным зарядом может оказывать значительное влияние на квантовую подсистему.
С подобным выбором модели в работах [83, 84] были выполнены расчеты структурных параметров и энергий хромофорсодержащих областей для белка asFP595, предполагая как транс-, так и цис-конформацию хромофора. Большая часть белковой макромолекулы (более 2000 атомов), окружающая выделенную квантовую подсистему,
Рис. 9. Вариант выбора квантовой подсистемы (представление шарами и стержнями) для моделирования свойств флуоресцирующих белков семейства GFP методом КМ/ММ
была отнесена к ММ-подсистеме. Начальные координаты тяжелых атомов были взяты из кристаллографической структуры темной формы белка PDBID:1XMZ [85] с хромофором в транс-конформации. После добавления атомов водорода (или протонов) равновесная геометрическая конфигурация модельной белковой системы была рассчитана методом КМ/ММ с конформационно подвижными эффективными фрагментами [86, 87] с использованием квантовохимического приближения Хартри-Фока в квантовой части и силового поля AMBER в молекулярно-механической части. Вычисленные координаты атомов хорошо согласуются с кристаллографической структурой [83, 84]. Затем была приготовлена модельная структура с хромофорной группой внутри белковой матрицы в цис-конформации и снова оптимизированы координаты всех частиц методом КМ/ ММ. Одним из важных результатов данного расчета является вывод, что энергия системы с транс-конформацией анионной формы хромофора ниже на 1.6 ккал/моль, чем энергия системы с цис-конформацией. В вакууме порядок конформаций по энергии обратный - цис-изомер изолированного хромофора должен быть более стабильным, чем транс-изомер. Таким образом, белковая матрица способствует большей стабилизации транс-изомера хромофора, что и наблюдается в рентгеноструктурных исследованиях [23, 85, 88]. Для полученных методом КМ/ММ структур модельных систем были также проведены оценки вертикальных энергий возбуждения в квантовой подсистеме в приближении TD-DFT. Найдено, что для структуры с цис-конформацией хромофора переходу S0-S; должна соответствовать более длинноволновая полоса в оптическом спектре. Этот результат также качественно согласуется с экспериментальными наблюдениями и рабочей гипотезой [23, 26, 89, 90], согласно которой asFP595 поглощает зеленый свет в состоянии с транс-конформацией хромофора и флуоресцирует в красной области в состоянии с цис-конформацией хромофора.
Попытки теоретически описать механизм разгорания флуоресценции белка asFP595 с использованием других вариантов метода КМ/ММ предпринимались в работах [27, 91]. Для расчетов точек на поверхностях потенциальной энергии основного и возбужденного состояний небольшой квантовой подсистемы применялись общепринятые подходы TD-DFT и SA-CASSCF. В работе [91] вычисляемые «на лету» силы использовались для расчетов траекторий с возможностью переходов с одной поверхности на другую при фотоизомеризации хромофорной группы в белке. Основное заключение моделирования сводится к утверждению о существенной связи состояния протонирования хромофорной группы в белке asFP595 с транс-цис-изомеризацией. Технически похожие приемы (траекторные расчеты с оценками сил «на лету» по квантовым уравнениям) для анализа фотодинамики белка GFP описаны в работе [73]. В серии работ [92-96] приведены результаты молекулярно-динамического моделирования переносов протонов по сетям водородных связей около хромофорной группы GFP с различными вариантами представления потенциальных поверхностей, в частности по данным квантово-химических расчетов.
В первых же приложениях метода КМ/ММ к расчетам свойств флуоресцентных белков [50, 51] была использована существенно более простая, но и менее надежная методика - структурные параметры белковой молекулы определялись с использованием полуэмпирического квантовохимического подхода АМ1, и энергии возбуждения вычислялись в приближении TD-DFT. Таким образом оценивались полосы в оптических спектрах GFP [50] и синего флуоресцентного белка BFP [51] с модифицированной по отношению к GFP хромофорной группой.
В активно цитируемой работе [97] положения полос в оптическом спектре GFP, отвечающие вертикальным переходам S0 ^ S1 и S1 ^ S0, вычислены в приближении КМ/ ММ с использованием неэмпирических методов на основе CASSCF в квантовой подсистеме и силового поля СНАИММ в ММ-подсистеме. Вычисленные положения полос неплохо согласуются с экспериментальными результатами - расхождения оцениваются в 20-30 нм. Серией расчетов с последовательно расширяющейся квантовой подсистемой исследовано, в частности, влияние на спектр заряженного аминокислотного остатка А^, расположенного рядом с хромофорной группой (рис. 9).
Оптические спектры GFP и ряда его мутантов с перебором протонированных форм хромофорных групп рассчитаны в работе [98]. Авторы использовали для расчетов разностей энергий основного и возбужденного состояния в квантовой подсистеме вариант метода взаимодействия конфигураций, как и в предшествующих исследованиях газофазных хромофоров [56], но учли влияние белковой матрицы в рамках подхода КМ/ММ. Авторы сообщают о хорошем согласии рассчитанных и экспериментальных энергий переходов для поглощения и флуоресценции.
В работах [99, 100] описывается применение одной из версий т.н. многоуровневого квантово-химического подхода к расчетам свойств протяженных молекулярных систем -метода фрагментных молекулярных орбиталей ^МО) для вычислений оптических спектров красных флуоресцентных белков DsRed и серии mFrшts. Результаты полу-
чены в рамках различных вариантов приближения взаимодействия конфигураций для оценок разностей энергий основного и возбужденного состояний. Метод FMO потенциально интересен возможностью вообще избежать применения эмпирических силовых полей молекулярной механики, отказаться от комбинированного подхода КМ/ММ при расчетах свойств белков и использовать только квантовохимические приближения для модельной системы.
заключение
За 10 лет, прошедшие после публикации первых статей, посвященных компьютерному моделированию свойств флуоресцентных белков и их хромофоров [12, 31, 33], накопилось достаточное количество результатов, многие из которых обсуждаются в этой работе. По-видимому, наибольший интерес представляет ответ на вопрос - что же полезное могут извлечь экспериментаторы из результатов компьютерного молекулярного моделирования. Обратимся к одной из последних публикаций обзорного характера, написанной авторитетными специалистами по исследованиям флуоресцентных белков Тонгом и Мичем [7], которые обращают внимание на избранные ими вычислительные работы (в этом параграфе цитируются только эти статьи). Анализ электронной структуры хромофорной молекулы гидроксибензилиден-имидазолинона в основном и возбужденном электронном состояниях, выполненный уже в первых расчетах полуэмпирическими методами квантовой химии [32, 33], позволил связать фотофизические свойства GFP с локальными характеристиками мостико-вого фрагмента молекулы (рис. 2). А именно, увеличение порядка связи метиленой двойной связи при электронном возбуждении должно приводить к уменьшению барьера внутреннего вращения, облегчать внутреннюю конверсию и способствовать цис-транс-изомеризации хромофорной группы. Отмечается значение расчетов сечений потенциальных поверхностей, путей минимальной энергии вдоль угловых координат около мостикового фрагмента и конических пересечений для хромофорной молекулы как в изолированном состоянии, так и в модельном растворе, выполненных с постоянно усложняемыми квантово-химическими приближениями [57, 60, 61, 69, 72, 91, 101]. Поскольку подобные расчеты, которые явно учитывали бы влияние белковой матрицы на фотофизические свойства хромофора, достаточно сложны, отмечаются некоторые заключения о роли стерических затруднений со стороны пептидных групп для внутренней конверсии хромофорной молекулы, сформулированные по результатам моделирования ме-
тодами молекулярной механики [21, 22]. Кроме того, наличие рядом с хромофором заряженного аминокислотного остатка может существенно влиять на динамику фотовозбуждения, как показано расчетами методом КМ/ММ [97]. Моделирование методами молекулярной динамики (иногда в сочетании с квантово-химическими расчетами) [16, 28, 64, 92-96, 102, 103] позволяет наглядно представить пути перемещения протонов вдоль ориентированных сетей водородных связей в белках или превращения с хромофорными группами, что крайне важно для прогнозирования перспективных точечных мутаций, либо усиливающих, либо блокирующих эти пути.
Таким образом, весь арсенал современных средств компьютерного молекулярного моделирования - молекулярная механика, молекулярная динамика, квантовая химия и комбинированные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), применению которых для симуляции структуры и спектров флуоресцентных белков посвящена настоящая статья, признается [7] вполне полезным подспорьем при экспериментальных исследованиях, в свою очередь ориентированных на практическое решение важных задач создания новых эффективных биомаркеров в живых системах путем направленной модификации природных объектов приемами генной инженерии [104].
Самым важным, но и самым трудоемким представляется прямой подход моделирования химических и фотофизиче-ских явлений в белках методом КМ/ММ. Будущий успех на этом пути зависит и от дальнейшего прогресса в создании суперкомпьютерных систем, и от развития эффективных алгоритмов решения уравнений квантовой механики, и, возможно даже в большей степени, от подготовки высококвалифицированных специалистов, способных разбираться в столь широком круге вопросов от биологии до вычислительной математики. Эти усилия будут оправданы, если удастся быстро снабжать биотехнологов надежными предсказаниями перспективных модификаций белковых макромолекул по результатам расчетов, хотя бы в той же мере, как компьютерное моделирование оказалось полезным при проектировании новых лекарственных препаратов [105].
При написании статьи использовались работы, поддержанные Российским фондом фундаментальных исследований (проект 07-03-00059) и Программой президиума РАН по молекулярной и клеточной биологии и Федеральным агентством по науке и инновациям (проект 02.522.11.2002).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Tsien R.Y. // Ann. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 509-544.
2. Zimmer M. // Chem. Rev. 2002. V. 102. P. 759-781.
3. Лабас Ю.А., Гордеева А.В., Фрадков А.Ф. // Природа. 2003. № 3. C. 33-43.
4. Schmid J.A., Neumeier H. // ChemBioChem. 2005. V. 6. P. 1-9.
5. Remington S.J. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. V. 16. P. 714-721.
6. Wachter R.M. // Photochem. Photobiol. 2006. V. 82. P. 339-344.
7. Tonge P. J., Meech S.R. // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 2009. V.205. P. 1-11.
8. Немухин А.В. // Соросовский образовательный ж. 1998. № 6. С. 48-52.
9. Robb M.A., Garavelli M., Olivucci M., Bernardi F. // in Rev. Comput. Chem., Eds. Lipkowitz K.B., Boyd. D.B. Wiley. VCH Publishers. New York. 2000. V. 15. P. 87-146.
10. Warshel A., Levitt M. // J. Mol. Biol. 1976. V. 109. P. 227-249.
11. Reuter N., Lin H., Thiel W. // J. Phys. Chem. B. 2002. V. 106. P. 6310-6321.
12. Helms V., Straatsma T.P., McCammon J.A. // J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. P 3263-3269.
13. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. // Nucl. Acids Res. 2000. V. 28. P. 235-242.
14. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., Boxer S.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.
93. P. 8362-8367.
15. Warren A., Zimmer M. // J. Molec. Graphics Model. 2001. V. 19. P. 297-303.
16. Lill M.A., Helms V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 2778-2781.
17. Patnaik S.S., Trohalaki S., Pachter R. // Biopolymers. 2004. V. 75. P. 441-452.
18. Agmon N. // Biophys. J. 2GG5. V. 88. P. 2452-2461,
19. Leiderman P., Huppert D., Agmon N. // Biophys. J. 2GG6. V. 9G. P. 1009-1018.
2G. Baffour-Awuah N.Y.A., Zimmer M. // Chem. Phys. 2GG4. V. 3G3. P. 7-11,
21. Maddalo S.L., Zimmer M. // Photochem. Photobiol. 2GG6. V. 82. P. 367-372.
22. Megley C.M., Dickson L.A., Maddalo S.L., Chandler G.J., Zimmer M. // J. Phys. Chem, B. 2GG9. V. 113. P. 302-308.
23. Andresen M., Wahl M. C., Stiel A. C., Grater F., Schafer L. V., Trowitzsch S., Weber G., Eggeling C., GrubmUller H., Hell S.W., Jakobs S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2GG5.
V. 1G2. P. 13070-13074.
24 Nifosi R., Tozzini V. // Chem. Phys. 2GG6. V. 323. P. 358-368.
25. Vallverdu G., Demachy I., Ridard J., Levy B. // J. Molec. Struct. THEOCHEM. 2GG9,
V. 898. P. 73-81.
26. Lukyanov K.A., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Matz M.V., Labas Y.A., Savitsky A.P., Markelov M.L., Zaraisky A.G., Zhao X.N., Fang Y., Tan W.Y., Lukyanov S.A.
// J. Biol. Chem. 2GGG. V. 275. P. 25879-25882.
27. Schafer L.V., Groenhof G., Klingen A.R., Ullmann G.M., Boggio-Pasqua M., Robb M.A., GrubmUller H. // Angew. Chemie Int. Ed. 2GG7. V. 46: P. 530-536.
28. Moors S.L.C., Michielssens S., Flors C., Dedecker P., Hofkens J., Ceulemans A,
// J. Chem. Theory Comput. 2GG8. V. 4. P. 1012-1020.
29. Habuchi S., Ando R., Dedecker P., Verheijen W., Mizuno H., Miyawaki A., Hofkens J.
// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2GG5. V. 1G2. P. 9511-9516.
3G. Khrameeva E.E., Drutsa V.L., Vrzheshch E.P., Dmitrienko D.V., Vrzheshch P.V.
// Biochemistry (Mosc). 2GG8. V. 73. P. 1085-1095.
31. Voityuk A.A., Michel-Beyerle M.E., Rosch N. // Chem. Phys. Lett. 1997. V. 272. P 162-167.
32. Voityuk A.A., Michel-Beyerle M.E., Rosch N. // Chem. Phys. 1998. V. 231. P 13-25,
33. Weber W., Helms V., McCammon J.A., Langhoff PW. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1999. V. 96. P 6177-6182.
34. Helms V., Winstead C., Langhoff P.W. //J. Molec. Struct. THEOCHEM. 2GGG. V. 5G6.
P 179-189
35. Nemukhin A.V., Topol I.A., Burt S.K. // J. Chem. Theor. Comput. 2GG6. V.2. P 292-299.
36. Helms V. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2GG2. V. 12. P. 169-175.
37. Epifanovsky E., Polyakov I., Grigorenko B., Nemukhin A., Krylov A.I.
// J. Chem. Theor. Comput. 2GG9. on-line
38. Sinicropi A., Andruniow T., De Vico L., Ferre N., Olivucci M. // Pure Appl. Chem. 2GG5, V. 77. P. 977-993.
39. Wanko M., Hoffmann M., Frauenheim T., Elstner M. // J. Comput. Aided Mol. Des.
2GG6. V. 2G. P 511-518.
4G. Voityuk A.A., Michel-Beyerle M.E., Rosch N. // Chem. Phys. Lett. 1998. V. 296. P 269-276.
41. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. // Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 2GGG. V. 97. P 11990-11995.
42. Wan S., Liu S., Zhao G., Chen M., Han K., Sun M. // Biophys. Chem. 2GG7. V. 129,
P 218-223.
43. Collins J.R., Topol I.A., Nemukhin A.V., Savitsky A.P // Proc. SPIE. 2GG9. V. 7191,
P 71912.
44. Zerner M.C. //Rev. Comput. Chem. Ed. Lipkowitz K.B. and Boyd D.B. VCH Publishing, New York. 1991. V. 2. P 313-366.
45. Dreuw A., Head-Gordon M. // J. Am. Chem. Soc. 2GG4. V. 126. P 4007-4016.
46. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y. A., Savitsky A.P, Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. // Nature Biotechnol. 1999. V. 17. P 969-973.
47. Nielsen S.B., Lapierre A., Andersen J.U., Pedersen U.V., Tomita S., Andersen L.H.
// Phys. Rev. Lett. 2GG1. V. 87. P. 2281G2.
48. Andersen L.H., Lapierre A., Nielsen S.B., Nielsen I.B., Pedersen S.U., Pedersen U.V., Tomita S. // Eur. Phys. J. D. 2GG2. V. 2G. P 597-600.
49. Boye S., Nielsen S.B., Krogh H., Nielsen I.B., Pedersen U.V., Bell A.F., He X.,
Tonge PJ., Andersen L.H. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2GG3. V. 5. P 3021-3026.
5G. Marques M.A.L., Lopez X., Varsano D., Castro A., Rubio A. // Phys. ReV. Lett. 2GG3,
V. 9G. P 2581G1.
51. Lopez X., Marques M.A.L., Castro A., Rubio A. // J. Am. Chem. Soc. 2GG5. V. 127.
P 12329-12337.
52. Xie D., Zeng X. // J. Comp. Chem. 2GG5. V. 26. P 1487-1496.
53. Sun M. // Int. J. Quant. Chem. 2GG6. V. 1G6. P 1G2G-1G26.
54. Amat P., Granucci G., Buda F., Persico M., Tozzini V. // J. Phys. Chem. B. 2GG6. V. 11G,
P. 9348-9353.
55. Timerghazin Q.K., Carlson H.J., Liang C., Campbell R.E., Brown A. // J. Phys. Chem. B, 2GG8. V. 112. P. 2533-2541.
56. Das A.K., Hasegawa J.-Y., Miyahara T., Ehara M., Nakatsuji H. // J. Comput. Chem, 2GG3. V. 24. P 1421-1431.
57. Martin M.E., Negri F., Olivucci M. // J. Am. Chem. Soc. 2GG4. V. 126. P 5452-5464,
58. Bravaya K.B., Bochenkova A.V., Granovsky A.A., Nemukhin A.V. // Russ. J. Phys. Chem. B. 2GG8. V. 2. P 671-675.
59. Bravaya K.B., Bochenkova A.V., Granovsky A.A., Savitsky A.P, Nemukhin A.V.
// J. Phys. Chem. A. 2GG8. V. 112. P 8804-8810.
6G. Olsen S., Smith S.C. // J. Am. Chem. Soc. 2GG7. V. 129. P 2054-2065.
61. Olsen S., Smith S.C. // J. Am. Chem. Soc. 2GG8. V. 13G. P 8677-8689.
62. Olsen S., McKenzie R.H. // J. Chem. Phys. 2GG9. V. 13G. P 1843G2,
63. Laino T., Nifosi R., Tozzini V. // Chem. Phys. 2GG4. V. 298. P 17-28,
64. Zhang R.B., Nguyen M.T., Ceulemans A. // Chem. Phys. Lett. 2GG5. V. 4G4. P 250-256.
65. Tozzini V., Nifosi R. // J. Phys. Chem. B. 2GG1. V. 1G5. P. 5797-5803.
66. Tozzini V., Bizarri A.R., Pellegrini V., Nifosi R., Giannozzi P, Iuliano A., Cannistraro S., Beltram F. // Chem. Phys. 2GG3. V. 287. P 33-42.
67. Tozzini V., Giannozzi P // ChemPhysChem. 2GG5. V. 6. P. 1-4,
68. Yoo H.-Y., Boatz J. A., Helms V., J. Andrew McCammon J.A., Langhoff PW,
// J. Phys. Chem. B. 2GG1. V. 1G5. P 2850-2857.
69. Altoe P., Bernardi F., Garavelli M., Orlandi G., Negri F. // J. Am. Chem. Soc. 2GG5. V.
127. P 3952-3963.
7G. Altoe P., Bernardi F., Conti I., Garavelli M., Negri F., Orlandi G. // Theor. Chem. Acc, 2GG7. V. 117. P 1041-1059.
71. Voityuk A.A., Kummer A.D., Michel-Beyerle M.E., Rosch N. // Chem. Phys. 2GG1. V,
269. P 83-91.
72. Toniolo A., Olsen S., Manohar L., Martinez T.J. // Faraday Discus. 2GG4. V. 127. P 149-163.
73. Virshup A.M., Punwong C., Pogorelov TV., Lindquist B.E., Ko C., Martinez T.D,
// J. Phys. Chem. B. 2GG9. V. 113. P 3280-3291.
74. Yan W., Zhang L., Xie D., Zeng J. // J. Phys. Chem. B. 2GG7. V. 111. P14055-14063.
75. Voliani V., Bizzarri R., Nifosi R., Abbruzzetti S., Grandi E., Viappiani C., Beltram F.
// J. Phys. Chem. B. 2GG8. V. 112. P10714-10722.
76. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S.,
Lukyanov K.A. // Biochem. 2GG5. V. 44. P. 5788-5793.
77. Dong J., Abulwerdi F., Baldridge A., Kowalik J., Solntsev K.M., Tolbert L.M,
// J. Am. Chem. Soc. 2GG8. V. 13G. P. 14096-14098.
78. He X., Bell A.F., Tonge P.J. // FEBS Lett. 2GG3. V. 549. P 35-38.
79. Polyakov I., Epifanovsky E., Grigorenko B., Krylov A.I., Nemukhin A.
// J. Chem. Theor. Comput. 2GG9. on-line
8G. El Yazal J., Prendergast F.G., Shaw D.A., Pang Y.-P // J. Am. Chem. Soc. 2GGG. V. 122,
P. 11411-11415.
81. Scharnagl C., Raupp-Kossmann R.A. // J. Phys. Chem. B. 2GG4. V. 1G8. P 477-489,
82. Nemukhin A.V., Topol I.A., Grigorenko B.L., Savitsky A.P, Collins J.R. // J. Mol. Struct, THEOCHEM. 2GG8. V. 863. P. 39-43.
83. Grigorenko B., Savitsky A., Topol I., Burt S., Nemukhin A. // Chem. Phys. Lett. 2GG6.
V. 424. P 184-188.
84. Grigorenko B., Savitsky A., Topol I., Burt S., Nemukhin A. // J. Phys. Chem. B. 2GG6.
V. 11G. P 18635-18640.
85. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O’Leary S., Kallio K., Chudakov D.M.,
Remington S.J. // Biochem. 2GG5. V. 44. P. 5774-5787.
86. Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Topol I.A., Burt S.K. // J. Phys. Chem. A. 2GG2.
V. 1G6. P. 10663-10672.
87. Nemukhin A.V., Grigorenko B.L., Topol I.A., Burt S.K. // J. Comput. Chem. 2GG3.
V. 24. P. 1410-1420.
88. Wilmann PG., Petersen J., Devenish R.J., Prescott M., Rossjohn J. // J. Biol. Chem, 2GG5. V. 28G. P 2401-2404.
89. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K. // J. Biol, Chem. 2GG3. V. 278. P. 7215-7219.
9G. SchUttrigkeit T.A., von Feilitzsch T., Kompa C.K., Lukyanov K.A., Savitsky A.P, Voityuk A.A., Michel-Beyerle M.E. // Chem. Phys. 2GG6. V. 323. P 149-16 G.
91. Schafer L.V., Groenhof G., Boggio-Pasqua M., Robb M.A., GrubmUller H,
// PLoS Comput. Biol. 2GG8. V. 4. P. e1000034.
92. Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. // Chem. Phys. Lett. 2GG4. V. 396.
P. 2G2-2G7.
93. Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. // J. Am. Chem. Soc. 2GG6. V. 128,
P. 3564-3574.
94. Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. // J. Chem. Theor. Comput. 2GG8. V. 4.
P. 1138-115 G.
95. Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. // J. Phys. Chem. B. 2GG8. V. 112,
P. 13443-13452.
96. Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. // J. Phys. Chem. B. 2GG8. V. 112,
P. 5500-5511.
97. Sinicropi A., Andruniow T., Ferre N., Basosi R., Olivucci M. // J. Am. Chem. Soc. 2GG5, V. 127. P 11534-11535.
98. Hasegawa J., Fujimoto K., Swerts B., Miyahara T., Nakatsuji H. //J. Comput. Chem. 2GG7. V. 28. P. 2443-2452.
99. Mochizuki Y., Nakano T., Amari S., Ishikawa T. // Chem. Phys. Lett. 2GG7. V. 433.
P. 36G-367.
1GG. Taguchi N., Mochizuki Y., Nakano T., Amari S., Fukuzawa K., Ishikawa T.,
Sakurai M., Tanaka S. // J. Phys. Chem. B. 2GG9. V. 113. P. 1153-1161.
1G1. Olsen S., Manohar L., Martinez T.J. //Biophys. J. 2GG2. V. 82. P 359A-459A.
1G2. Wang S.F., Smith S.C. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2GG7. V. 9. P. 452-458.
1G3. Zhang H., Smith S.C. // J. Theor. Comput. Chem. 2GG7. V. 6. P. 789-802.
1G4. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S., Verkhusha V.V. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2GG5. V. 6. P 885—891.
1G5. Баскин И.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. // Успехи химии. 2GG9. Т. 78. С. 539-557,
