CC BY
16
КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РНК ДЛЯ СУБЛИНГВАЛЬНОГО
ПРИМЕНЕНИЯ
Шевченко З.А.1, Лебедев Л.Р.2 ©
1Ведущий инженер Новосибирского национального исследовательского государственного университета (НГУ), Новосибирск; 2д.м.н., зав. лабораторией Института медицинской биотехнологии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, Бердск, Россия
Аннотация
Разработан метод получения сублингвальной формы иммуностимулирующего препарата на основе дрожжевой РНК в качестве профилактического противовирусного средства. В экспериментах in vivo показано повышение фагоцитарной активности макрофагов в сыворотке крови лабораторных животных при его применении.
Ключевые слова: двуспиральная РНК, индукторы интерферонов. Keywords: double-stranded RNA, interferon inductor.
Инфекционные заболевания, такие как грипп, острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), относятся к наиболее массовым и повсеместно распространённым заболеваниям. Они, по данным ВОЗ, ежегодно поражают до 25% населения земного шара.
Для борьбы с ними используются различные терапевтические препараты, в основном - моновалентные, к которым из-за высокой мутационной изменчивости у штаммов вирусов возникает резистентность. Кроме того, специфические противовирусные препараты используются при лечении вирусных гепатитов, герпеса, ВИЧ, геморрагических лихорадок. При сочетанных с ними инфекциях вирусы гриппа могут приобретать резистентность к значительному количеству других классов терапевтических препаратов. При появлении штаммов вируса с высокими резистентностью и патогенностью возникают эпидемии и пандемии.
Наименьшую устойчивость вирусы приобретают к природным средствам защиты организма - интерферонам. Препараты индукторов интерферонов на основе РНК все шире используются при создании лекарственных средств для лечения актуальных инфекционных заболеваний. Одним из таких препаратов является индуктор интерферона на основе двуспиральной РНК микробиологического происхождения - ридостин. В настоящее время он используется в инъекционной форме и, соответственно, в качестве профилактического средства в такой форме не может быть рекомендован к применению. Актуальным и перспективным в качестве профилактического и лечебного средства представляется использование сублингвальной формы иммуностимулятора в капсулах из пектина.
Цель работы состояла в разработке композиции на основе РНК для сублингвального применения,
Материалы и методы исследования
В работе использовали препарат субстанции Ридостин («Диафарм», Россия), содержащий 10% двуспиральной РНК и 90% одноцепочечной РНК, пектин, лактат кальция и полиглюкин (10%-ный раствор декстрана с молекулярной массой 40000 Да).
Стабильность препаратов оценивали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
Для определения фагоцитарной активности использовали двухмесячных сирийских (золотистых) хомяков с массой тела 90-110 г, по 5 голов в каждой группе, полученных из питомника. Для этого им скармливали по 0,2г препарата. Через 6 и 24 ч брали на анализ кровь и выделяли макрофаги. В качестве объекта фагоцитоза использовали частицы туши.
© Шевченко З.А., Лебедев Л.Р., 2017 г.
Фагоцитарную активность определяли по фагоцитарному индексу (ФИ) общепринятым способом [1].
Результаты и обсуждение
На основании литературных и собственных экспериментальных данных в качестве компонентов были выбраны пектин, декстран и кальция лактат.
Препарат в виде капсул получали растворением компонентов: пектин растворяли в Полиглюкине (10%-ый раствор декстрана с молекулярной массой 40000 Да), лактат кальция растворяли в дистиллированной воде. Навеску Ридостина (10% двуспиральной РНК и 90% одноцепочечной РНК) вносили в раствор пектина, перемешивали до полного растворения. Затем вносили раствор кальция лактата при интенсивном перемешивании. При этом образовывались трехмерные микрокапсулы. Препарат формировали в виде пластинок размером 15х20х3 мм.
Были подобраны соотношения компонентов: пектина, декстрана и кальция лактата таким образом, чтобы образовывались однородные капсулы. Ряд соотношений основных компонентов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Содержание основных компонентов в 1 г препарата
№ Содержание Содержание Содержание Содержание Содержание
двуспиральной одноцепочечно пектина, мг кальция декстрана, мг
РНК, мг й РНК, мг лактата, мг
1 0,5 4,5 15 1,0 70
2 0,5 4,5 20 1,5 70
3 0,5 4,5 25 2,0 70
Наиболее однородные микрокапсулы наблюдались при соотношении компонентов, мг/г: пектин - 20, кальция лактат - 1,5, которые и были выбраны для дальнейших исследований. Препарат назвали Рикальцин.
При изучении кинетики высвобождения РНК из микрокапсул в физиологический раствор и раствор 5%-ной соляной кислоты (1г препарата на 5 мл жидкости) при 370С, путем измерения оптической плотности раствора при длине волны 260 нм, было установлено, что максимум концентрации РНК при диффузии в физ.раствор без перемешивания наблюдался через 1-1,5 ч, оставаясь на данном уровне не менее 8ч. При анализе электрофорезом в 1%-ом геле агарозы было установлено, что подвижность РНК в препарате снижена по сравнению с подвижностью исходной (субстанция РНК), но структура ее сохраняется (рис.1). Аналогичное сохранение РНК было установлено после хранения препарата в течение 90 суток в условиях холодильника, при 6оС
И 2ч 4ч 8ч
ш
^ ^ ^ А
Рис.1. Электрофореграмма (1%-ный гель агарозы окрашивание бромистым этидием) образцов РНК, диффундировавшей в раствор через 2, 4 и 8ч из микрокапсул. И - исходная
(субстанция РНК).
При диффузии в раствор 5%-й соляной кислоты, без перемешивания, максимум концентрации РНК был отмечен через 1ч, далее содержание РНК постепенно снижалось до 0 в течение следующих 2 ч. Это свидетельствует о том, что после прохождения желудка и попадания в кишечник содержание РНК в капсулах снижается.
Биологическую активность образцов Рикальцина оценивали на хомяках по его способности повышать фагоцитарную активность макрофагов, определяя фагоцитарный индекс. Как видно из графика (рис.2), повышение активности наблюдалось через 6 ч после введения препарата, эффект стимуляции усиливался через 24 ч. Эти данные согласуются с результатами авторов работы [2], которые использовали введение препарата вирусоподобных частиц из дрожжей, содержащих РНК.
1.6
Оч 6ч 24ч
Время после введения препарата
Рис.2. Фагоцитарный индекс макрофагов после введения препарата Рикальцина. Рразличия с контролем (капсулы, не содержащие РНК) достоверны при P< 0,05
Таким образом, разработан состав композиции на основе РНК (стимулятора неспецифической резистентности) для сублингвального применения, содержащий на один грамм препарата: двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 0,5 мг, одноцепочечную РНК - 4,5 мг, пектин - 20 мг, лактат кальция - 1,5 мг, декстран - 70 мг, дистиллированная вода до 1 мл. Препарат формируется в виде пластинок и применяется сублингвально. Полученные результаты по биологической активности позволяют говорить о перспективах использования композиции для создания новых профилактических средств от инфекционных заболеваний.
Литература
1. Стенко М.И. Справочник по клиническим методам исследования.- М.,1975.-С.56-57.
2. Shevchenko Z.A., Lebedev L.R., Klimenko V.P. et al. Production methods and properties of virus-like particles of saccharomyces cerevisiae yeast killer strain/Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Т. 51. № 8. С. 812-817.
