CC BY
134
УДК 615.03:577.164.2
КОМПЛЕКСНОЕ СОЕДИНЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ С АНТИГИПОКСАНТНЫМИ И АНТИОКСИДАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ
© Маркова Е.О.1, Новиков В.Е.1, Парфенов Э.А.2, Пожилова Е.В1.
1 Смоленская Государственная Медицинская Академия, Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28 2Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН, Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24
Резюме: В эксперименте на мышах изучено новое производное аскорбиновой кислоты под лабораторным шифром nQ1968. Установлена высокая защитная эффективность вещества на моделях острых гипоксии с гиперкапнией, гипобарической гипоксии, гемической гипоксии и гистотоксической гипоксии. Показано, что в дозе 100 мг/кг в условиях нормоксии и после воздействия острой гипоксии оно уменьшает активность свободнорадикального окисления.
Ключевые слова: антигипоксант, острая экзогенная гипоксия, антиоксидант, свободно-радикальное окисление
COMPLEX COMPOUND OF ASCORBIC ACID WITH ANTIOXIDANT AND ANTIHYPOXANTH PROPERTIES
Markova E.O.1, Novikov V.E.1, Parfenov E.A.2, Pozhilova E.V.1
1Smolensk State Medical Academy, Russia, 214019, Smolensk, Krupskoy st., 28
2Russian Oncological Scientific Centre named after N.N. Blokhin of the RAMS, Russia, 115478, Moscow, Kashirskoye Highway, 24
Summary: In the experiment on mice it was learnt a new derivative of ascorbic acid under laboratory code nQ1968. The high protective effectiveness of the substance on the models of acute hypoxia with hypercapnia, hypobaric hypoxia, hemic hypoxia and gistotoksicheskoy hypoxia was established. It is shown that in dose of 100 mg/kg in normoxia and after exposure of acute hypoxia, it reduces the activity of free radical oxidation.
Key words: antihypoxant, acute exogenous hypoxia, antioxidant, free radical oxidation
Введение
Гипоксические состояния могут возникнуть при внутриутробном развитии плода и рождении ребенка, заболеваниях сердечно-сосудистой системы и органов дыхания, нарушении функции желез внутренней секреции, отравлении сильнодействующими и ядовитыми веществами, при обвалах в шахтах, при больших физических нагрузках, при нахождении высоко в горах, а также при нарушении штатной работы в системе кислородообеспечения наземных и подземных помещениях закрытого типа. Ухудшающиеся экологические условия, загрязнение окружающей среды, экстремальные условия, с которыми связана профессиональная деятельность очень широкого круга специалистов, могут стать причиной функциональных нарушений, сопровождающихся гипоксическими состояниями разного генеза. В связи с этим одной из важнейших задач современной экспериментальной и клинической фармакологии является разработка новых лекарственных средств - антигипоксантов, повышающих выживаемость человека в условиях острой гипоксии [12]. Несмотря на то, что современная фармацевтическая индустрия предлагает широкий выбор лекарственных средств, обладающих свойствами антигипоксантов, поиск высокоэффективных антигипоксантов по-прежнему продолжается, причем движущим фактором этого процесса выступают повседневные потребности клинической практики [13, 14].
Синтезированные на базе НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ РАМН металлсодержащие антиоксиданты, представляющие собой комплексные соединения биометаллов с природными антиоксидантами, открыли новые возможности для изыскания антигипоксических средств. Вещества этой группы оказались эффективными при коррекции у животных различных видов острой экзогенной гипоксии [6]. Целью нашего исследования явилось изучение антигипоксантной и антиоксидантной активности нового производного аскорбиновой кислоты -Ь-аскорбаторибофлавинатованадил(П)трисемигидрат(П) под лабораторным шифром л^1968.
Методика
Исследование проведено на 425 мышах-самцах массой 18-25 г и 80 крысах-самцах массой 180-200 г линии Wistar в соответствии с «Руководством по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ» [9]. Изучаемое соединение вводили однократно внутрибрюшинно за 1 час до моделирования гипоксии. Контрольным животным вводили равный объем дистиллированной воды. В качестве препаратов сравнения использовали применяемый в клинической медицине антигипоксант мексидол («ФАРМАСОФТ», Россия) и природный антиоксидант аскорбиновую кислоту (ООО «ОЗОН», Россия) в дозах 100 мг/кг. Для оценки антигипоксического действия соединения воспроизводились модели острой гипоксии с гиперкапнией (ОГсГк), острой гипобарической гипоксии (ОГбГ), острой гемической гипоксии (ОГеГ) и острой гистотоксической гипоксии (ОГтГ) [7]. Острую токсичность определяли, вычисляя LD50 [8]. Потребление кислорода определяли с помощью откалиброванного датчика кислорода ДК-16 «ИНСОВТ» (Россия). Показатель потребления кислорода (мл/мин/100 г массы) оценивали в условиях нормоксии (через 1, 3, 6, 24 часа после введения препарата), и в динамике развития острой экзогенной гипоксии. В условиях нормоксии через 1, 3, 6, 24 часа после введения препаратов измеряли ректальную температуру электронным термометром «OMRON» (Япония). Рассчитывали стандартный энергетический обмен (СтЭО) по методу Крога [16].
Для исследования свободно-радикального окисления (СРО) забирали кровь из сосудов шеи при декапитации животных. Сыворотку получали путем центрифугирования крови в течение 15 минут при 3000 об/мин. Оценку показателей СРО проводили методом хемилюминесценции на биохемиолюминометре 3606 М (разработка конструкторско-технологического бюро «Наука», Россия) с помощью программного обеспечения к прибору. Для инициации перекисного окисления липидов в исследуемый материал (0,1 мл плазмы, 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4), 0,1 мл 12,5 мМ двухвалентного железа в виде соли FeSO4x7H2O), помещенный в темную камеру биохемиолюминометра, на 10 цикле вводили 0,1 мл 3% раствора перекиси водорода с последующей регистрацией хемилюминесценции в течение 50 циклов (1 цикл - 0,1 секунды), при 37оС с учетом фоновой хемилюминесценции. В качестве оценочного показателя использовалась величина светосуммы, рассчитываемой как площадь под кривой свечения в относительных единицах. Данный показатель отражает интенсивность образования свободных радикалов и участие в процессе свободно-радикального окисления антиоксидантных систем.
Статистическую обработку результатов опытов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica Version 6.0.
Результаты исследования
Было установлено, что в условиях ОГсГк л^1968 проявляло протекторные свойства в широком диапазоне доз от 5 до 200 мг/кг. Выраженное антигипоксическое действие регистрировалось в дозах 50, 100, 150 мг/кг (увеличение продолжительности жизни на 51,81; 140,45; 207,81%), в связи с чем дальнейшее изучение на других моделях острой гипоксии проводилось в этих дозировках. В условиях ОГбГ л^1968 повышало продолжительность жизни опытных животных на 37, 89, 67% в дозах 50, 100, 150 мг/кг соответственно. Кроме того, предварительное введение данного соединения приводило к повышению выживаемости животных на 30, 58, 30%. На модели ОГтГ соединение л^1968 достоверно увеличивало продолжительность жизни животных в дозах 50 и 100 мг/кг на 23 и 45% соответственно. Сравнение антигипоксической активности исследуемого соединения с препаратами сравнения во всех указанных выше моделях гипоксии показало его более высокую эффективность. В условиях ОГеГ было установлено, что л^1968 обладает антигипоксической активностью только в дозе 150 мг/кг, увеличивая продолжительность жизни животных на 73%, превосходя при этом действие аскорбиновой кислоты и не уступая мексидолу.
Исследование острой токсичности данного соединения показало, что ЛД50 для мышей составляет 515 (450 - 590) мг/кг, что позволяет отнести его к классу малотоксичных по классификации К.К. Сидорова [1].
В следующей серии опытов мы изучали влияние л^1968 на показатели СтЭО мышей. С этой целью нами была выбрана доза в 100 мг/кг, т.к. она занимала среднее положение в ряду доз с антигипоксическим действием на четырех моделях острой экзогенной гипоксии. В ходе исследования было установлено, что через 1 час после введения лQ 1968 снижались моторная активность животных, ректальная температура на 4,5оС, потребление кислорода на 3,5 мл/мин и величина СтЭО в 1,85 раза. Через 3 и 6 часов изучаемые показатели оставались сниженными, а спустя сутки возвращались к исходному уровню. Изменение данных параметров под влиянием препаратов сравнения носило менее выраженный характер (табл. 1).
Таблица 1. Влияние ^1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на показатели основного обмена мышей в условиях нормоксии
Потребление кислорода, Ректальная Энергозатраты,
мл/мин/100 г массы тела температура оС ккал/сут/кг
ВРЕМЯ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол
Исходное 7,51 + 8,07+ 6,89+ 37,0+ 36,7+ 37,3+ 524,45+ 563,66+ 481,01 +
(контроль) 0,60 0,39 0,74 0,35 0,35 0,64 42,18 27,40 51,87
через 4,05± 6,99+ 5,70+ 32,5+ 35,8+ 35,7+ 283,20+ 488,44+ 398,25+
1 час 0,47* 0,56* 0,43* 0,39* 0,39* 0,84* 32,84* 39,16* 29,91*
через 5,04+ 7,02+ 6,07+ 34,3+ 36,1 + 36,0+ 351,81 + 490,36+ 423,60+
3 часа 0,39* 0,43* 0,72* 0,46* 0,30* 1,04* 27,04* 30,38* 50,07*
через 5,98+ 7,10+ 6,78+ 35,2+ 36,4+ 36,1 + 417,83+ 495,74+ 473,43+
6 часов 0,51* 0,64 0,34* 0,33* 0,49 0,99* 35,42* 44,57* 23,69
через 7,94+ 8,37+ 6,94+ 36,6+ 37,1 + 36,7+ 554,40+ 584,91 + 484,47+
24 часа 0,70 1,06 0,77 0,38 0,42 0,71 49,19 74,06 53,68
Примечание: * - р<0,05 по отношению к контролю
При изучении динамики потребления кислорода мышами в условиях ОГсГк было установлено, что характер потребления кислорода во всех экспериментальных группах животных был одинаковым (уменьшался), однако, под влиянием соединения ^1968 потребление кислорода снижалось в большей степени, что обеспечивало более высокую его концентрацию в гермообъеме и способствовало продлению жизни животных по сравнению с контролем - в 2,4 раза, в то время как мексидол - в 1,9 раза, а аскорбиновая кислота - в 2,0 раза. Смерть животных, получивших ^1968, наступала при более низкой концентрации кислорода в гермообъеме (4,75%), чем в контроле (6,25%) и в группах сравнения (мексидол - 5,81%, аскорбиновая кислота - 5,67%) (рис. 1).
20,00
И,
| ЩЩо
0
5
1 10ДЮ
х
гг
К
С:.
$ ь,00 0,00
0 10 20 30 40 50 60
Продолжительность жизни Тж, мин
Рис. 1. Влияние соединения ^1968 на содержание кислорода (%) в гермообъеме в условиях острой гипоксии с гиперкапнией у мышей
В серии опытов посвященных изучению влияния ^1968 на интенсивность процессов СРО было установлено, что в условиях нормоксии величина светосуммы у контрольных животных
составляла 67091,11±10954,54 условных единиц. Соединение ^1968 в условиях нормоксии достоверно снижало величину светосуммы в 1,31 раза (табл. 2).
Таблица 2. Влияние ^1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на интенсивность процессов свободно-радикального окисления
ГРУППА НОРМОКСИЯ ГИПОКСИЯ С ГИПЕРКАПНИЕЙ
Контроль 67091,11+10954,54 50093,64+7126,94
^1968 51075,00±7589,29* 41607,93+2843,50*
Мексидол 62805,00±13695,00 42047,50+6349,47*
Аскорбиновая кислота 59192,44+2220,73 38068,00+8730,40*
* - р<0,05 по отношению к контрольной группе
Препараты сравнения в условиях нормоксии не вызывали достоверных изменений величины светосуммы. После воздействия ОГсГк в сыворотке крови контрольных животных наблюдалось угнетение хемилюминесцентного свечения по сравнению с интактными животными (нормоксия), что выразилось в снижении величины светосуммы в 1,34 раза. Более выражено снижение активности свободно-радикального окисления в сыворотке крови после воздействия острой гипоксии при введении соединения ^1968 (уменьшение величины светосуммы в 1,61 раза). Действие соединения ^1968 соответствует по эффективности мексидолу, но несколько уступает аскорбиновой кислоте (снижение в 1,76 раза).
Обсуждение результатов исследования
Результаты проведенного нами исследования антигипоксической активности нового комплексного соединения аскорбиновой кислоты под лабораторным шифром ^1968 на моделях ОГсГк, ОГбГ, ОГтГ и ОГеГ позволяют отнести его к группе антигипоксантов, т.к. антигипоксическая направленность действия данного вещества подтверждена его способностью увеличивать продолжительность жизни мышей, находящихся в условиях остро нарастающей экзогенной гипоксии различной этиологии.
Известно, что некоторые вещества с антигипоксантным действием уменьшают температуру тела, снижают интенсивность обмена веществ в тканях, что ведет к уменьшению потребления кислорода [6, 12]. В наших экспериментах ^1968 тоже уменьшало показатели ректальной температуры в среднем на 4,5; 2,7 и 1,8оС спустя 1, 3 и 6 часов соответственно, что свидетельствует о замедлении обменных процессов под воздействием данного соединения. Явное торможение обменных процессов, проявившееся через час после введения изучаемого вещества, хорошо объясняет его противогипоксический эффект при острой гипоксии.
В ходе изучения потребления мышами кислорода в условиях нормоксии было установлено, что после введения вещества ^1968 животные потребляли кислород менее интенсивно, чем в контроле. Следует отметить, что снижение ректальной температуры и потребления животными кислорода совпадали по срокам наблюдения, что подтверждает наше предположение о реализации антигипоксического эффекта производного аскорбиновой кислоты за счет замедления обменных процессов. После помещения животных в условия ОГсГк скорость потребления кислорода в группе мышей, получавших ^1968, была существенно ниже в сравнении с контрольными показателями и препаратами сравнения, что способствовало экономному расходованию кислорода по мере нарастания у мышей состояния гипоксии. Так у животных, получавших ^1968, в первые 25 мин. нахождения в гермобъеме концентрация кислорода снизилась с 21,27% до 11,13%. За это же время в контрольной группе содержание кислорода снизилось до 6,38%, в группе животных, получавших мексидол - до 7,30%, аскорбиновую кислоту - до 7,28%. Таким образом, производное аскорбиновой кислоты обеспечивало более экономное расходование мышами кислорода, что повышало вероятность переживания животными экстремального состояния, и заметно увеличивало продолжительность жизни мышей. Это подтверждается анализом показателей конечной концентрации кислорода, т.е. концентрации, при которой наступила гибель животных.
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что вещество ^1968 в сравнении с аскорбиновой кислотой и антигипоксантом мексидолом эффективнее оптимизирует процессы потребления кислорода тканями организма в условиях ОГсГк. Согласно данным литературы, фармакологические вещества, защитный эффект которых увеличивается по мере усугубления гипоксического состояния, принято относить в разряд так называемых истинных антигипоксантов
[3, 12]. Согласно полученным нами результатам, вещество л^968 наиболее заметно ограничивало интенсивность потребления кислорода экспериментальными животными в период, когда их состояние становилось особенно тяжелым. В связи с этим его можно рассматривать как истинный антигипоксант, применение которого способствует выживанию организма в экстремальных условиях за счет рационального использования кислородного ресурса.
Так как потребности организма в кислороде напрямую зависят от интенсивности метаболических процессов и, в первую очередь, скорости протекания энергоемких реакций, мы проведили расчет энергетических затрат контрольной и опытных групп мышей. Исходная величина стандартного энергетического обмена для мышей колебалась в пределах 481-564 ккал/сут/кг, что соответствует литературным данным [12]. Предварительное введение ^1968 приводило к снижению энергозатрат мышей, что в итоге, вероятно, и обеспечивало более экономное расходование кислородных запасов организма.
Одним из ключевых механизмов повреждения клеток при гипоксии является чрезмерная активация СРО, обусловленная повышенным уровнем образования активных форм кислорода (АФК). Однако известно, что повышение уровня АФК вызывает не только повреждение мембранных структур клеток, но и является стимулом для индукции защитных систем организма. В ответ на внешний сигнал в клетке повышается стационарный уровень АФК, что является сигналом для мобилизации метаболических возможностей клетки для адаптации к новым условиям [4]. В физиологических условиях образование АФК регулируется целым рядом факторов антиоксидантной защиты, таких как супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, а-токоферол, глутатион и др. [10]. В наших экспериментах воздействие ОГсГк приводило к снижению величины светосуммы в 1,34 раза, что может быть обусловлено адаптационным напряжением антиоксидантной системы сыворотки крови, проявляющимся в повышении содержания и активности биоантиоксидантов, способствующих компенсаторному повышению антирадикальной устойчивости липидов в условиях гиперпродукции прооксидантов.
Предварительное введение аскорбиновой кислоты достоверно снижало активность свободно-радикального окисления в сыворотке крови после воздействия ОГсГК (снижение - в 1,76 раза), что вполне может быть объяснено, т.к. она выступает одним из регуляторов процессов перекисного окисления липидов [2]. Именно она подвергается окислению в тканях организма, находящихся в экстремальных условиях, участвует в связывании свободных радикалов и разрушении перекисей [5]. В этом качестве аскорбиновая кислота, молекула которой содержит и полярные, и неполярные группировки, проявляет тесное функциональное взаимодействие с 8И-глутатионом и вместе с тем с липидными антиоксидантами, усиливая действие последних и препятствуя перекисному окислению липидов [15]. Аскорбиновая кислота может участвовать в антиоксидантной защите тканей от повреждающего действия радикалов, как непосредственно выполняя роль ловушки активных кислородсодержащих радикалов, включая О2-, НО-, И02-, так и опосредованно путем восстановления токоферильных радикалов до важнейшего липидного антиоксиданта организма - витамина Е. Кроме того, важным фактором в условиях гипоксии является необходимость поддерживать ионы металлов (Бе2+, Си2+ и др.), встроенные с помощью хелатных связей в структуру оксигеназ и гидроксилаз в восстановленном состоянии, обеспечивающем нормальную функцию ферментов. Веществом, способным восстанавливать ионы металлов в подобного рода структурах является аскорбиновая кислота [10].
Предварительное введение соединения ^1968 и мексидола также снижало величину светосуммы, но в меньшей степени, чем аскорбиновая кислота (в 1,20 и 1,19 раза соответственно по сравнению с группой «гипоксия»). Одной из важных регуляторных функций антиоксидантов является ограничение чрезмерной активации свободнорадикальных процессов, и поддержание способности системы антиоксидантной защиты противодействовать окислительному стрессу, развивающемуся в организме при патологических процессах, действии неблагоприятных факторов внешней среды, в том числе гипоксии [11]. Результаты наших экспериментов по изучению СРО в сыворотке крови крыс под влиянием ^1968 свидетельствуют о замедлении процессов перекисного окисления липидов и активации антиоксидантной системы, что позволяет сделать вывод о том, что соединение ^1968 обладает выраженными антиоксидантными свойствами.
Вывод
Новое комплексное соединение аскорбиновой кислоты - Ь-аскорбаторибофлавинатованадил (П)трисемигидрат(П) - проявляет выраженный антигипоксический эффект на различных моделях острой гипоксии и может рассматриваться как истинный антигипоксант с антиоксидантными свойствами.
Литература
1. Беляева Н.Н. Сравнительная оценка показателей при определении степени токсичности и опасности веществ // Гигиена и санитария. - 1998. - №4. - С.54-56.
2. Бринкевич С.Д., Шадыро О.И. Влияние аскорбиновой кислоты и её производных на радиационнохимические превращения гидроксилсодержащих органических соединений // Химия высоких энергий. - 2008. - Т.42, №4. - С. 297-302.
3. Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Молекулярная фармакология антигипоксантов. - СПб.: Н-Л, 2004. - 368 с.
4. Кислин М.С., Тюлькова Е.К. Характер активации прооксидантных систем при действии умеренной гипобарической гипоксии в режиме прекондиционирования // Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды: Мат. Всерос. конф. - СПб., 2010. - С.135-136.
5. Кочергин Б.А., Соломонов А.В., Румянцев Е.В., Антина Е.В. Билирубин и аскорбиновая кислота в реакциях окисления и взаимодействия с альбумином // Мат. ХХХ Всерос. симпозиума молод. ученых по хим. кинетике. - М., 2012. - С.17.
6. Левченкова О.С. Антигипоксанты как эффективные средства защиты организма при гипоксических состояниях // Актуальные проблемы клинической медициныю. - Смоленск, 2009. - С. 225-229.
7. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств / Под. ред. Л.Д. Лукьяновой. - М., 1990. -18 с.
8. Прозоровский В.Б. Практическое пособие по ускоренному определению средних эффективных доз и концентраций биологически активных веществ. - Байкальск, 1994. - 46 с.
9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармаколгических веществ // под ред. Р.У. Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.
10. Собакарь М.С., Ших Е.В. Антиоксидантная терапия и метаболические подходы к лечению заболеваний сердечно-сосудистой системы // Биомед. - 2010. - №3. - С. 10-21.
11. Срубилин Д.В., Еникеев Д.А., Мышкин В.А. Антирадикальная и антиоксидантная активность комплексного соединения 5-окси-6-метилурацила с янтарной кислотой и его эффективность при гипоксических состояниях // Мед. науки. - 2011. - №6. - С. 166-170.
12. Шабанов П. Д., Зарубина И.В., Новиков В.Е., Цыган В.Н. Фармакологические корректоры гипоксии // под ред. А. Б. Белевитина. - СПб: Информ-Навигатор. - 2010. - 912 с.
13. Hsieh C.H., Lee C.H., Liang J.A., Yu C.Y., Shyu W.C. Cycling hypoxia increases U87 glioma cell radioresistance via ROS induced higher and long-term HIF-1 signal transduction activity // Oncol. Rep. - 2010. - V.24, N6. - P. 1629-1636.
14. Li L.H., Qu Y., Zhang L., Mao M., Mu D.Z. The role of HIF-1alpha in neuronal apoptosis after hypoxia/hypoxia ischemia brain damage in neonatal rats // Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. - 2008. - V.39, N6. - P. 912917.
15. Patel N., Joseph C., Corcoran G.B. Ray S.D. Silymarin modulates doxorubicin-induced oxidative stress, Bcl-xL and p53 expression while preventing apoptotic and necrotic cell death in the liver // Toxicol. and Applied Pharmacol. - 2010. - V.245, N.2. - P.143-152.
16. Prosser C.L., Brown F.A. Comparative animal physiology. - Philadelphia, London, 1962. - 632 p.
Информация об авторах
Маркова Екатерина Олеговна - старший преподаватель кафедры общей и медицинской химии, соискатель кафедры фармакологии с курсом фармации ГБОУ ВПО «Смоленская Государственная Медицинская Академия» Минздрава России. E-mail: smeshik-kate@mail.ru
Новиков Василий Егорович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии с курсом фармации факультета повышения квалификации и переподготовки специалистов ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России. E-mail: novicov.farm@yandex.ru
Парфенов Эдгар Андреевич - доктор химических наук, заведующий лабораторией ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН. E-mail: phcao@yandex.ru
Пожилова Елена Васильевна - ассистент кафедры ортопедической стоматологии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России. E-mail: novicov.farm@yandex.ru
