CC BY
52
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2013 УДК 615.03:577.164.2
К МЕХАНИЗМУ АНТИГИПОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НОВОГО КОМПЛЕКСНОГО СОЕДИНЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
В.Е. Новиков,1 Е.О. Маркова,1 Э.А. Парфенов 2
ГБОУ ВПО Смоленская Государственная Медицинская Академия, г. Смоленск (1) Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва (2)
В эксперименте на крысах изучено новое производное аскорбиновой кислоты с антигипоксической активностью. Показано, что в дозе 100 мг/кг в условиях нор-моксии и после воздействия острой гипоксии оно уменьшает активность свободно-радикального окисления, не оказывает влияния на гемограмму, но приводит к существенному снижению активности АлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ, уровня мочевой кислоты и общего белка после воздействия острой гипоксии, что имеет определенное значение в его антигипоксическом эффекте.
Ключевые слова: антигипоксанты, свободнорадикальное окисление, гемограмма, биохимические показатели.
Комплексное соединение ванадила с аскорбатом и рибофлавином - L-аскорбаторибофлавинатованадил(П) трисе-мигидрата(Г) - под лабораторным шифром nQ 1968, синтезированное д.х.н. Э.А. Парфеновым в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, является антигипоксантным средством [5]. Механизм антигипоксического действия данного соединения, возможно, обусловлен снижением интенсивности метаболических процессов в клетке, его оптимизирующим влиянием на функциональное состояние ЦНС [4]. Важным и информативным объектом исследования является кровь, т.к. кровь, как жидкая соединительная ткань организма, не только обеспечивает взаимосвязь всех органов и систем, являясь индикатором состояния организма, но и сама непосредственно реагирует на дефицит кислорода [7, 8]. В условиях недостаточного для удовлетворения потребностей метаболизма снабжения тканей кислородом начинается цепь физиологических и биохимических изменений, цель которых обеспечить оптимальную функцию и по возможности интактное восстановление организма после окончания периода гипоксии. Перспективным при ги-
поксии является применение лекарственных средств, способных тормозить активацию процессов свободнорадикального окисления в клетке, уменьшать образование токсических метаболитов и снижать их повреждающее действие.
Как известно, аскорбиновая кислота относится к числу наиболее активных проок-сидантов, а также заметно усиливает действие истинных биоантиокислителей. Исходя из этого, представляло интерес изучить действие комплексного производного аскорбиновой кислоты лQ 1968 на процессы свободнорадикального окисления (СРО), гемограмму и биохимические показатели крови крыс в условиях нормоксии и после воздействия острой гипоксии, что позволит расширить представления о механизме антигипоксиче-ского действия соединения.
Материалы и методы
Исследование проведено на 240 крысах-самцах линии Wistar массой 180-200 г в соответствии с «Руководством по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ» [6]. Анализируемое соединение nQ 1968 вводили однократно внутрибрюшинно за 1 час до эксперимента
в дозе 100 мг/кг (эффективная доза при гипоксии). Контрольным животным вводили равный объем дистиллированной воды. В качестве препаратов сравнения выступали антигипоксант мексидол (ООО «ФАРМА-СОФТ», Россия) и природный антиоксидант аскорбиновая кислота (ООО «ОЗОН», Россия) в дозах 100 мг/кг. Кровь для исследования брали из сосудов шеи декапитиро-ванного животного через час после введения исследуемого соединения в группе животных, содержащихся в условиях нормок-сии, и при появлении признаков острой гипоксии (беспокойное поведение, подергивание лап, попытка выбраться) в группе животных, подвергшихся воздействию острой гипоксии с гиперкапнией (ОГсГк). ОГсГк моделировали помещением крыс в герметичные индивидуальные камеры объемом 1 л до появления признаков острой гипоксии. Сыворотку крови получали путем центрифугирования цельной крови в течение 15 минут при 3000 об/мин.
Оценку показателей СРО окисления в сыворотке крови проводили методом хеми-люминесценции на биохемиолюминометре 3606 М (разработка конструкторско-технологического бюро «Наука», Россия) с помощью программного обеспечения к прибору. Для инициации перекисного окисления липидов в исследуемый материал (0,1 мл плазмы, 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4), 0,1 мл 12,5 мМ двухвалентного железа в виде соли FeSO4x7H2O), помещенный в темную камеру биохемиолюминометра, на 10 цикле вводили 0,1 мл 3% раствора перекиси водорода с последующей регистрацией хемилю-минесценции в течение 50 циклов (1 цикл -0,1 секунды), при 370С с учетом фоновой хемилюминесценции. В качестве оценочного показателя использовалась величина свето-суммы, рассчитываемой как площадь под кривой свечения в относительных единицах. Данный показатель отражает интенсивность образования свободных радикалов и участие в процессе свободно-радикального окисления антиоксидантных систем.
Показатели гемограммы крови крыс (уровень гемоглобина, число эритроцитов и гематокрит) определяли на минифотометрах DP 300, DP 310 (DIALAB G.m.b.H., Австрия), используя
реактивы DIALAB GPT (ALT), mod. IFCC фирмы DIALAB (Австрия). Подсчет числа лейкоцитов проводили в камере Горяева.
При биохимическом исследовании определяли активность ферментов: ала-нинаминотрансферазы (АлАТ), аспарта-таминотрансферазы (AcAT), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уровень креатинина, мочевой кислоты, мочевины, общего белка. Исследования проведены на биохимическом анализаторе «Ultra» фирмы «Kone» (Финляндия) с использованием наборов реактивов фирмы Olvex (Россия).
Статистическую обработку результатов опытов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica Version 6.0.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования показали, что в условиях нормоксии величина светосуммы у контрольных животных составляла 67138,11 ± 9906 условных единиц. Соединение nQ 1968 в условиях нормоксии достоверно снижало показатель свечения до 51109 ± 7277. Препараты сравнения в условиях нормоксии не вызывали достоверных изменений величины светосуммы (табл. 1).
После воздействия ОГсГк в сыворотке крови контрольных животных наблюдалось угнетение хемилюминесцентного свечения по сравнению с интактными животными (нормоксия), что выразилось в снижении величины светосуммы в 1,3 раза, что может быть обусловлено адаптационным напряжением антиоксидантной системы сыворотки крови, проявляющимся в повышении содержания и активности биоантиоксидантов (су-пероксиддисмутазы, каталазы, церулоплаз-мина, а-токоферола и др.), способствующих компенсаторному повышению антирадикальной устойчивости липидов в условиях гиперпродукции прооксидантов. Выраженное снижение активности свободно-радикального окисления в сыворотке крови наблюдалось после воздействия острой гипоксии при введении соединения nQ 1968 (уменьшение величины светосуммы в 1,25 раза). Действие соединения nQ 1968 соответствует по эффективности мексидолу и несколько уступает аскорбиновой кислоте (снижение - в 1,28 раза).
Таблица 1
Влияние жQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на интенсивность процессов _свободнорадикального окисления_
Группа животных (П = 10) Величина светосуммы, усл. ед.
Нормоксия Гипоксия с гиперкапнией
Контроль 67138,11 ± 9906 51480±6658*
^ 1968 51109±7277* 41191± 40893
Аскорбиновая кислота 59114±3151 40087 ± 9308Л
Мексидол 62483 ± 12217 41160±6118Л
Примечание: * — р<0,05 по отношению к контрольной группе. А — р < 0,05 по сравнению с контролем при гипоксии
В ходе изучения гемограммы, было выявлено, что у контрольных животных значения показателей в условиях нормок-сии соответствовали физиологическим величинам [1]. Введение соединения под лабораторным шифром ^ 1968 в условиях нормоксии не оказывало влияния на общее содержание лейкоцитов и гематок-
рита, но наблюдалось некоторое увеличение показателей содержания эритроцитов (на 5,36%) и гемоглобина (на 5,26%) (табл. 2). Однако эти изменения находились в пределах физиологической нормы для крыс. Препараты сравнения в условиях нормоксии достоверных изменений в гемограмме не вызывали.
Таблица 2
Влияние жQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на показатели гемограммы _крыс в условиях нормоксии_
Группа животных (п = 10) Контроль ^ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол
Значение показателей, абс.(%)
Эритроциты х 1012/л 7,74±0,16 (100%) 8,16±0,27* (105,36%) 7,47±0,37 (96,53%) 7,58±0,43 (97,86%)
Гемоглобин г/л 141,49±2,15 (100%) 148,94±0,91* (105,26%) 139,28±1,77 (98,43%) 139,05±2,17 (98,27%)
Лейкоциты х 109/л 9,77±0,42 (100%) 9,69±0,45 (99,18%) 9,34±0,40 (95,58%) 9,23±1,00 (94,44%)
Гематокрит % 43,02±0,56 (100%) 44,18±1,23 (102,68%) 43,30±0,80 (100,65%) 42,23±1,00 (98,16%)
Примечание: * — р<0,05 по отношению к контрольной группе.
После воздействия острой гипоксии у животных наблюдалось достоверное увеличение содержания эритроцитов и гемоглобина на 8,80% и 7,82% (табл. 3). Возможно, изменения количества эритроцитов и гемоглобина обусловлены колебаниями гематокритного числа, что может свидетельствовать о перераспределении крови в организме животного. Так, показатель ге-матокрита у животных в группе гипоксия увеличивался на 7,98% относительно контроля, свидетельствуя о сгущении крови и нарушении гемодинамики. Выявленные изменения показателей гемограммы после воздействия ОГсГк согласуются с данными
литературы, из которых следует, что одним из срочных компенсаторных механизмов адаптации к гипоксии является увеличение кислородной емкости крови за счет усиления гемопоэза и выброса депонированной крови [2].
На фоне введения лекарственных веществ не происходило достоверных изменений гемограммы крыс в условиях гипоксии. Но после введения ^ 1968 наблюдалась тенденция к увеличению содержания эритроцитов и гемоглобина, что, вероятно, способствует лучшей доставке кислорода к тканям и увеличивает время жизни мышей при ОГсГк.
Таблица 3
Влияние жQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на показатели гемограммы
Группа животных (п = 10) Контроль Гипоксия ^ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол
Значение показателей, абс.(%)
| % к контролю | % к гипоксии
Эритроциты х 1012/л 7,74±0,16 (100%) 8,42±0,25* (108,80%) 9,18± 1,10 (108,94%) 8,02±0,51 (107,36%) 8,12±0,48 (96,44%)
Гемоглобин г/л 141,49±2,15 (100%) 152,55±1,61* (107,82%) 155,69±2,71 (102,06%) 154,33±2,37 (101,16%) 152,64±2,82 (100,06%)
Лейкоциты х 109/л 9,77±0,42 (100%) 9,13±0,86 (93,45%) 9,50±0,58 (104,02%) 9,18±0,75 (100,48%) 9,27±1,10 (101,54%)
Гематокрит % 43,02±0,56 (100%) 46,46±0,48* (107,98%) 46,27±1,65 (99,60%) 47,20±0,86 (101,59%) 46,31±0,80 (99,67%)
Примечание: * — р<0,05 по отношению к контрольной группе.
Изучение биохимических показателей показало их соответствие у контрольных животных в условиях нормоксии значениям физиологической нормы для крыс [1]. Предварительное введение соединения ^ 1968 и препаратов сравнения в условиях нормоксии не приводило к достоверному изменению рассматриваемых показателей (табл. 4).
Данные, полученные при исследовании биохимических показателей сыворотки крови экспериментальных животных после воздействия ОГсГк, представлены в таблице 5, из которой следует, что ОГсГк вызывала повышение активности АлАТ и АсАТ животных на 52,23% и 70,05% соответственно, щелочной фосфатазы в 2
раза, что вероятно связано с нарушением функции печени и активизацией цитолиза. Показатель ЛДГ был увеличен на 56,75% по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о значительной активации процесса гликолиза в условиях недостатка кислорода, вследствие чего в крови не разрушается до нейтральных продуктов лактат, что и приводит к накоплению ЛДГ. Уровень мочевой кислоты повышался в 4 раза, что вероятно, обусловлено тем, что гипоксическое повреждение тканей индуцирует разрушение нуклеиновых кислот, сопровождающееся образованием пуриновых оснований, с последующей их модификацией. Кроме того, увеличился и уровень общего белка на 22,43%.
Таблица 4
Влияние жQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на биохимические показатели
Группа животных (п = 10) Контроль ^ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол
Значение показателя, абс.(%)
АлАТ, ед/л 112,20±16,20 135,00±22,60 123,00±13,06 106,70±19,27
(100%) (120,32%) (109,63%) (95,10%)
АсАТ, ед/л 159,60±22,80 173,80±41,84 162,10±12,00 178,90±45,35
(100%) (108,90%) (101,57%) (112,09%)
ЩФ, ед/л 158,30±7,30 133,60±34,24 161,50±2,12 136,30±25,63
(100%) (84,40%) (102,02%) (86,10%)
ЛДГ, ед/л 735,80±78,56 796,30±60,50 793,30±56,45 732,10±54,33
(100%) (108,22%) (107,81%) (99,50%)
Мочевина, 8,50±1,00 8,17±1,37 8,40±1,06 8,30±0,69
ммоль/л (100%) (96,12%) (98,82%) (97,65%)
Мочевая кислота, 67,40±3,40 64,70±11,10 67,40±3,27 67,50±6,82
мкмоль/л (100%) (95,99%) (100%) (100,15)
Креатинин, 79,00±0,80 84,80±5,44 81,00±2,00 79,90±2,61
мкмоль/л (100%) (107,34%) (102,53%) (101,14%)
Общий белок, г/л 60,20±0,64 61,90±2,54 59,70±3,31 62,50±2,94
(100%) (102,82%) (99,17%) (103,82%)
Примечание: * — р<0,05 по отношению к контрольной группе.
Таблица 5
Влияние жQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на биохимические показатели _крови крыс после воздействия ОГсГк_
Группа животных (П = 10) Контроль Гипоксия ^ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол
Значение показателя, абс.(%)
абс. % к контролю % к гипоксии
АлАТ, ед/л 112,20±16,20 170,80±17,20* (152,23%) 101,20±18,20А (59,25%) 140,10±20,41Л (82,03%) 131,70±27,22Л (77,11%)
АсАТ, ед/л 159,60±22,80 271,40±48,28а (170,05%) 190,30±29,90а* (70,12%) 195,80±26,20л (72,14%) 200,00±26,60Л (73,69%)
ЩФ, ед/л 158,30±7,30 349,40±64,20* (220,72%) 219,00±49,20а (62,68%) 323,90±40,88 (92,70%) 273,60±65,40 (78,31%)
ЛДГ, ед/л 735,80±78,56 1153,40±219,76* (156,75%) 776,90±104,92а (67,36%) 850,40±72,60л (73,73%) 772,30±141,36Л (66,96%)
Мочевина, ммоль/л 8,50±1,00 9,04±1,44 (106,35%) 8,15±0,42 (90,15%) 8,51±0,33 (94,14%) 8,07±0,40 (89,27%)
Мочевая кислота, мкмоль/л 67,40±3,40 275,90±19,10* (409,35%) 234,40±23,24а (84,96%) 247,00±9,80л (89,53%) 244,70±5,56Л (88,69%)
Креатинин, мкмоль/л 79,00±0,80 80,50±4,40 (101,90%) 71,40±8,16л (88,70%) 66,20±1,68л (82,24%) 67,80±2,08Л (84,22%)
Общий белок, г/л 60,20±0,64 73,70±2,22* (122,43%) 64,40±5,00л (87,38%) 59,20±1,60л (80,33%) 64,00±2,40Л (86,84%)
группе
Примечание: *- р<0,05 по отношению к контрольной А — р<0,05 по отношению к группе гипоксия
При применении лекарственных веществ на фоне ОГсГк наблюдалось снижение указанных показателей. Наиболее значительно предупреждало повышение активности АлАТ (на 40,75%), АсАТ (на 29,88%), ЛДГ (на 32,64%), мочевой кислоты (на 15,04%) и общего белка (на 12,62%) комплексное соединение аскорбиновой кислоты под лабораторным шифром ^ 1968. Мексидол и аскорбиновая кислота в меньшей степени, но также достоверно уменьшали концентрацию указанных показателей в сыворотке крови опытных животных. Так, мексидол способствовал снижению АлАТ, АсАТ, ЛДГ, мочевой кислоты и общего белка на 22,89; 26,31; 33,04; 11,31 и 13,16% соответственно, а аскорбиновая кислота -на 17,97; 27,86; 26,27; 10,47 и 19,67% соответственно. Следует отметить, что только при применении соединения ^ 1968 достоверно снижался уровень ЩФ на 37,32%. Кроме того, применение ^ 1968 препятствовало повышению АлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ и общего белка выше показателей физиологической нормы крыс.
Выводы
Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что
комплексное соединение аскорбиновой кислоты под шифром ^ 1968, обладающее выраженным антигипоксантным действием, проявляет антиоксидантные свойства в условиях нормоксии, и особенно в условиях гипоксии, о чем свидетельствует снижение величины светосуммы хемилю-минисцентного свечения. Наблюдаемый антиоксидантный эффект данного соединения, возможно, является не только результатом его прямого влияния на процессы пероксидации липидов, но и опосредован стабилизацией энергетического обмена клетки, что было подтверждено нами ранее [3]. ОГсГк существенно изменяет показатели гемограммы (возрастает уровень эритроцитов, гемоглобина, гема-токрита) и биохимические показатели крови экспериментальных животных (возрастает активность АлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ,уровень мочевой кислоты и общего белка), что свидетельствует о том, что гипоксия является мощным стрессорным фактором и запускает каскад срочных механизмов адаптации к гипоксии, проявляющиеся усилением гемопоэза, выброса депонированной крови, увеличением гликолиза, активацией симпато-адреналовой системы. Исследуемое соединение ^
1968 не оказывает выраженного влияния на показатели гемограммы в условиях гипоксии, но приводит к достоверному снижению активности АлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ и уровня мочевой кислоты, общего белка. Положительная динамика показателей АлАТ, АсАТ, ЩФ может свидетельствовать о замедлении процессов цитолиза и возможном гепатопротекторном действии изучаемого соединения.
Литература
1. Ананич И. В. Биохимические характери-
стики крови крыс / И.В. Ананич, М.А. Дерхо, С.Ю. Концевая // Ветеринарная клиника. - 2008. - №10. - С.18-19.
2. Зюзьков Г.Н. Гуморальные механизмы регуляции эритропоэза при гипоксии / Г.Н. Зюзьков, А.М. Дыгай, Е.Д. Гольд-берг // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2005. - № 2. - С. 133-137.
3. Производные аскорбиновой кислоты как антигипоксанты природного происхождения / Е.О. Маркова [и др.] // Патогенез: науч.-практ. журн. - 2011. -Т. 9, №3. - С. 45. - (Сод. журн.: Тез. докл. VI Рос. конф. с Междунар. участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». - М., 2011).
4. Антигипоксическая активность комплексных соединений на основе аскорбиновой кислоты / В.Е. Новиков [и др.] // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. -СПб., 2011. - Т. 9, №2. - С. 35-41.
5. Пат. 2461376 РФ, МПК. Антигипок-сантное средство / В.Е. Новиков, Е.О. Маркова, Э.А. Парфенов. - опубл. 20.09.2012, бюл. 26.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - М., 2005. - 832 с.
7. Титов В.Н. Методические вопросы и диагностическое значение определения перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности. Олеиновая жирная кислота как биологический антиоксидант (обзор литературы) / В.Н. Титов, Д.М. Лисицын, С.Д. Разумовский // Клинич. лаб. диагностика. - 2005. - №4. - С. 3-10.
8. Улитко М.В. Роль моноцитов-макрофагов в адаптивных реакциях кроветворной ткани при действии на организм экстремальных факторов: ав-тореф. дис. ... канд. биол. наук / М.В. Улитко. - Екатеринбург, 2008. - 24 с.
TO THE MECHANISM OF ACTION OF NEW ANTIHYPOXIC COMPLEX COMPOUND OF ASCORBIC ACID
V.E. Novikov, E. O. Markova, E.A. Parfenov
In the experiment on rats a new derivative of ascorbic acid with antihypoxic activity was learned. It is shown that a dose of 100 mg / kg in normoxia and after exposure to acute hypoxia, it reduces the activity of free radical oxidation, has no effect on the hemogram, but leads to a significant reduction of ALT, AST, alkaline phosphatase, LDG, the level of uric acid and total protein after acute hypoxia, which is of some importance in its hypoxic effect.
Key words: antihypoxants, free radical oxidation, hemogram, biochemical parameters.
Новиков Василий Егорович - д-р мед. наук, проф., заведующий кафедрой фармакологии с курсом фармации ФПК и ППС, ГБОУ ВПО Смоленская Государственная Медицинская Академия Минздрава России.
214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д. 28. E-mail: [email protected].
Маркова Екатерина Олеговна - ст. преподаватель кафедры общей и медицинской химии, соискатель кафедры фармакологии с курсом фармации ФПК и ППС, ГБОУ ВПО Смоленская Государственная Медицинская Академия Минздравсоцразвития РФ.
214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д. 28.
E-mail: [email protected].
Парфенов Эдгар Андреевич - д-р хим. наук, вед. научный сотрудник, Российский Онкологический Научный Центр имени Н.Н. Блохина Российской Академии Медицинских Наук.
115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24.
E-mail: [email protected].
