CC BY
24
© 1ванченко М. В.
УДК 611. 127:611. 018:576. 311. 347:611. 061. 1 ¡ванченко М. В.
КОМП'ЮТЕРНИЙ ТРИВИМ1РНИЙ АНАЛ13 УЛЬТРАСТРУКТУРНИХ
ПЕРЕБУДОВ ТА РЕАКЦ1Й М1Т0Х0НДР1Й СКОРОТЛИВИХ КАРД10М10ЦИТ1В ЩУР1В ЗА УМ0В ХР0Н1ЧН0Т ПРЕНАТАЛЬН01" Г1П0КСИ ДЗ «Дншропетровська медична академт М03 УкраУни» (м. Дншропетровськ)
Доошдження проведено у рамках науково-дослщ-ноУ роботи «Структуры перебудови компонен^в сер-цево-судинноУ системи в умовах ii нормального й аномального пстогенезу у людини й експериментальних тварин» (номер державноУ реестрацп 0111U006621).
Вступ. Перил зображення мтохондрм кардюмг оци^в були отриман понад 50 роюв тому з контрас-тованих ультратонких зр1з1в методом трансм1с1йноУ електронноУ м1кроскопп [10]. Результати доошджень м^охондрм доводять Ух функцюнальну та структурну неоднорщнють [9]. Так показники, як площа поверхн внутршньо'У м1тохондр1альноУ мембрани, ступЫь орг ентацп крист, щтьнють м1тохондр1альних крист, ви-значають належнють органели до певного типу [3,7]. Останн 10 роюв застосування найсучаснших методик електронноУ м1кроскоп1У та комп'ютерних алго-ритм1в реконструкцп надали морфологам можливють отримувати справжн тривим1рн1 зображення бю-лопчних об'екпв [5,11]. Хоча результати попередых наших доошджень демонструють зв'язок пол1мор-ф1зму мтохондрм та неоднорщност Ух функцп, шляхи реал1зацп гетерогеытету та ступЫь Ух залежност вщ впливу ппоксп [2] об'емна реконструк^я (створення тривим1рноУ модел^ дозволить в1зуал1зувати накопи-чен експериментальн та теоретичн дан для цтюно-го розумшня патолопчного процесу, що вщбуваеться органелах.
Мета даного дослщження полягала у створен тривим1рних моделей та в1зуал1зацп мтохондрм у норм1 та за умов впливу ппоксп з подальшою оцЫкою внутр1шньом1тохондр1альних реакцп органел.
0б'ект i методи дослщження. При проведены експериментально-морфолопчного анал1зу в якост об'екта доошдження були використан бкж безпородн щури-самки та Ух потомство на р1зних етапах прена-тального i постнатального онтогенезу. Хроычну пре-натальну гiпоксiю моделювали на ваптних самицях шляхом внутрiшньоочеревинного введення 1 %-вого нiтриту натрiю вiд 10-У до 21-У доби вагiтностi в дозi 5 мг/100 г ваги - доз^ що викликае ппоксю середнього ступеня тяжкостi [1]. Контрольним тваринам вводили внутрiшньоочеревинно 1 мл 0,9 %-вого фiзiологiчно-го розчину натрю хлориду. Дослiдження проведене у вщповщност до законодавства УкраУни (закону УкраУни «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» вiд 15.12.2009 року № 1759-VI). Отриман зразки
рiзних дiлянок мiокарда готували для електронно-мг кроскопiчного дослiдження за стандартною методикою [6].
Дослщження проводили в лабораторп електронноУ мiкроскопii ДЗ «ДМА МОЗ УкраУни» за допомо-гою трансмiсiйного електронного мiкроскопа ПЭМ-100-01 («SELMI», УкраУна) при напрузi прискорення 75-80 кВ i первинних збтьшеннях вiд 2000 до 80000.
Зображення з ультратонких та сермних зрiзiв препарату, що вивчався, фксували на монохромну плiв-ку Agfa з подальшою вщцифровкою у JPEG-формат за допомогою сканера Canon CanoScan 9000F. Для створення комп'ютерних моделей використовували програмне забезпечення Photoshop CS5 (подготовка фотографа), Amira for microscopy 5.0 (створення та вирiвнювання контурiв), 3ds max 8.0 (остаточна об-робка та вiзуалiзацiя). Реконструкцiю проводили згщ-но рекомендацiям I. В. Твердохгмба (2007) [4].
Результати дослщжень та Yx обговорення. Eлектронно-мiкроскопiчне доошдження мiокарда щурiв показало, що мiжмiофiбрилярна, субсарко-лемальна та парануклеарна зони кардюмюци^в контрольноУ та експериментальноУ груп на етапах онтогенезу мiстили полiморфнi м^охондрп. Нами була проведена просторова реконструк^я низько-енергетичних та високоенергетичних мтохондрм кардiомiоцита лiвого шлуночка експериментальноУ групи на 30-у добу життя (рис. 1). Ui типи органел ра-нiше вже були описан в Кмц нормального мiокарда [3]. За нашими даними низькоенергетичн органели мали кулясту форму, невеликий об'ем та площу по-верхнi внутршньо'У мiтохондрiальноi мембрани, по-мiрноi щтьност апарат слабко впорядкованих крист. Високоенергетичн мiтохондрii були представленi ортодоксальними та конденсованими формами. Ор-тодоксальнi форми були органелами з вщносно великим об'емом та площею зовышньо'У мiтохондрiальноi мембрани, мали видовжену форму, упорядковану орieнтацiю крист i щтьний матрикс. У свою чергу, конденсован високоенергетичнi органели були представлен кулястими мiтохондрiями невеликого об'ему з високою щтьнютю крист, при цьому площа поверх-нi внутрiшньоi мiтохондрiальноi мембрани та кiлькiсть мiтохондрiальних крист значно перевищували показники характеры для органел низькоенергетичного типу. Тривимiрний аналiз мтохондрм кардiомiоцитiв
Рис. 1. Просторова комп'ютерна модель мггохондрш р1зних титв ско-ротливого кардiомiоцита щура експериментально'Г групи лiвого шлуночка на 30-у добу постнатального онтогенезу. А. Низькоенергетична мгтохон-дрiя. Б. Високоенергетична ортодоксальна мiтохондрiя. В. Високоенер-гетична конденсована мiтохондрiя. Фюлетовий колiр - зовнiшня мембрана; синiй - внутрiшня мембрана; жовтий - мембрана крист.
ùypiB ЦИХ форм органел СВ1дЧИВ про iCTOTHi BiflMiH-HOCTi y Tonoëoriï IX BHyTpirnHix мембран.
У внутршнм мембран мiтoxoндpiй M0pÔ0ë0ri4H0 й фyнкцioнальнo видтяюты два cyбкoмпаpтмента [8]. Перший - внутршня пpикopдoнна мембрана (inner boundary membrane), яка прилягае дo 3oBHii±iHboï мембрани (outer membrane) мiтoxoндpiï i вдокрем-лена вiд не'! мiжмембpанним пpocтopoм. Другий - це мембрана крист (cristae membrane), яка y бтыхюсп мiтoxoндpiй включае значну частину пoвеpxнi вну-TpirnHboï мембрани i yтвopюe чиcленнi iнвагiнацiï piç-hoï фopми. Ocтаннi дocягнення в галyзi електpoннoï тoмoгpафiï пoказyюты, ùo ц мембpаннi cyбдoмени пoeднанi вiднocнo невеликими тpyбчаcтими структурами - cristae junctions [12, 13].
Дocлiдження пoказалo, ùo кpиcти opтoдoкcалы-ниx фopм, як пpавилo, мали плocкi ламели з oдним абo двoма cristae junctions y перифермнм oблаc-Ti BHyTpirnHboï мембрани. Koнденcoванi мiтoxoндpiï мали значну плoùУ мембрани кpиcт. Kpиcти в ниx пoeднyвалиcя з вла^е внyтpiшныoю мембpанoю де-кiлыкoма cristae junctions та чаcтo зливалиcя oдна з oднoю. Звичайнo, взаемна тpанcфopмацiя циx фopм opганел cyпpoвoджyвалаcы перебу^вами y внутрш-нiй мембpанi шляxoм активацiï меxанiзмiв cинтезy та пoдiлy (рис. 1) [11].
Значне ущлынення внyтpiшныoï мембрани cyпpo-вoджyвалocя злиттям oкpемиx кpиcт з yтвopенням
Рис. 2. Просторовi комп'ютернi моделi високоенергетичних мгтохон-дрiй у нормi та у стаж рiзного ступеня ушкодження скоротливого кардi-омiоцита щура лiвого шлуночка на 20-у добу пренатального онтогенезу. А. Норма. Б. Помiрне перенапруження. В. Зворотне ушкодження. Г. Незворотна деградащя.
вiднocнo великиx кoмпаpтментiв, y тoй чаc як зменшення ùiлынocтi ма-тpикcy (пеpеxiд в opтoдoкcалыний cтан) пpизвoдилo дo poзùеплення великиx ламел. Така типoва динамi-ка мopфoлoгiï кpиcт демoнcтpye ба-ланc мiж пpoцеcами злиття та пoдiлy внyтpiшныoï мембрани. Дocлiдження C. A. Mannella та кoлег (2001) cb^-чаты пpo те, ùo пoява та зpocтання кiлыкocтi великиx кpиcтниx гампарт-ментiв пpизвoдиты дo piзкoгo зни-ження piвня yтвopення АТФ [11].
Aналiз мiтoxoндpioмy е^пери-менталынoï групи ùypiB пoказав, ùo xpoнiчна внyтpiшныoyтpoбна гiпoк-ciя пpизвoдила дo фyнкцioналынoгo перенапруження та незвopoтнoï деcтpyкцiï opганел i xoча динамка та cтyпiны виpазнocтi дегенеpативниx змш була piзнoю пpoтягoм ycыoгo перюду патoлoгiч-нoгo впливу ми видтили деякi загалынi закoнoмipнoc-Ti пpoцеciв, ùo були пoв'язанi з реак^ями мiтoxoн-дpiй на дiю xpoнiчнoï пpенаталынoï гiпoкciï.
Eлектpoннo-мiкpocкoпiчне дocлiдження та пpo-cтopoва pекoнcтpyкцiя opганел на етапаx прена-талынoгo (за yмoв впливу гiпoкciï) та дo 7-ï дoби пocтнаталынoгo oнтoгенезy (кoли приеднували^ втopиннi ураження i пocтгiпoкcичний стан opганел, iшемiя, oкиcний cтpеc пpизвoдили дo пpoгpеcyван-ня патoлoгiчнoгo пpoцеcy) пpoдемoнcтpyвали змiни, ùo xаpактеpизyвали пpoцеcи алытеpацiï мiтoxoндpiй (рис. 2, 3).
Bиcoкoенеpгетичнi мiтoxoндpiï були найбiлыш cx^r^Hi дo пoшкoдження, найменш чyтливi - низыга-енеpгетичнi. Патoлoгiчне перенапруження та незвo-poтна деcтpyкцiя opтoдoкcалыниx фopм виcoкoенеp-гетичниx мiтoxoндpiй пpизвoдила дo зcyвy динамiчнoï piвнoваги мiж кoнденcoваними фopмами мiтoxoндpiй та активнoï ïx тpанcфopмацiï в opтoдoкcалынi кoнфi-гурацп. Hавпpoти, збiлышення чаcтки кoнденcoваниx фopм - активний адаптивний пpoцеc.
Пoмipне перенапруження opганел cyпpoвoджyва-лocы збтышенням oб'eмy мiтoxoндpiй, набpякoм, пo-рушенням opieнтацiï кpиcт та ïx чаcткoвoю деcтpyк-цieю, piзким пpocвiтленням матрицу. Пoглиблення пpoцеciв алытеpацiï пpизвoдилo дo пoдалышoгo збiлышення oб'eмy мi-ToxoHqpiï, вимивання матpикcy, poз-ширення мiжмембpаннoгo пpocтo-py кpиcт, ïx вакyoлiзацiï, чаcткoвoгo кpиcтoлiзicy. Пpoте дане утгаджен-ня мiтoxoндpiй бyлo звopoтне та y випадку зменшення iHreH^BHocTi ушщцження y каpдioмioцитi за-веpшyвалаcы пoвним вiднoвленням opганели. На вiдмiнy, неoбopoтна дегpадацiя мiтoxoндpiй xаpактеpи-зyвалаcы фopмyванням y зoвнiшнiй мембpанi тpiùин та poзpивiв, ùo мали тенденцiю дo злиття та при-звoдили дo pyйнацiï великиx дiлянoк
PMC. 3. npOCTOpOBi KOMn'roTepHi MOfle.i HM3bKOeHepreTMHHMX MiTOXOH-Apiü y HOpMi Ta y CTaHi pi3HOrO CTyneHq ymKOfl*eHHfl CKopoT.MBoro Kapfli-OMiOöMTa ^ypa .iBoro w.yHOHKa Ha 20-y floöy npeHaTa.bHoro OHToreHe-3y. A. HopMa. 5. noMipHe nepeHanpyweHHA. B. 3BopoTHe yrnKOA^eHHA. r. He3BopoTHa flerpaflaöiq.
MiToxoHflpia^bHoI MeMÖpaHM i cynpoBOflxyBa^MCb bm-TiKaHHHM MaTpMKcy y ria.non.na3My. PyMHauin 3aBepi±iy-Ba.acb HaKonMHeHH^M y capKon.na3Mi MiToxoHäpiM, iio .nonHy/iM, nycTMx Ta 3Mopi|eHMx opraHe., äpiÖHoäMc-nepcHMx aMop^HMx Mac. Öi o3HaKM cBiäHM.M npo He-3BopoTHi npouecM a/ibTepaui'i y MiToxoHäpioMi.
Bmchobok. XpoHiHHa BHyTpiniHbo-yTpoÖHa rinoKcin npM3BoäMTb äo nepe-HanpyxeHHn MiToxoHäpiM (36i.nbi±ieHHn oö'eMy, HaöpnK, nopyweHHn opieHTaui'i kpmct, HacTKoBMM KpMcTo.ni3ic, pi3Ke npocBrmeHHn MaTpMKcy), 3BopoTHoro yniKoflxeHHn (noäa/ibine 36i.nbi±ieHHn oö'eMy MiToxoHäpii, BMMMBaHHn MaTpMKcy, po3i±mpeHHH MixMeMÖpaHHoro npocTopy kpmct, Ix BaKyo.ni3auin, KpMc-To.i3ic) Ta He3BopoTHoro yniKoflxeHHn MiToxoHflpiM (0opMyBaHH^ y 3oBHii±miM MeMÖpaHi TpiiMH Ta po3pMBiB, pyMHa-uin Be.MKMx fli.^HoK MiToxoHflpia.bHoi' MeMÖpaHM, |o cynpoBoflxyeTbcn bm-TiKaHH^M MaTpMKcy y ria.on.a3My) Ha eTanax npeHaTa.bHoro oHToreHe3y Ta npoTnroM nepwo-ro TMxHn xMTTn.
nepcneKTMBM noAa.bWMX AOc.iAweHb noB'n3aHi 3i cTBopeHH^M TpboxMipHMx KoMn'ioTepHMx Mofle.eM MixMiToxoHflpia.bHMx KoHTaKTiB 3 MeToi Ix Bi3yajii3aui'i Ta nornMÖ.eHoro äoc.iäxeHHn ocoö.MBocTeM öyfloBM.
^iTepaTypa
1. l/BaHMUKan H. MeToäMKa no.yHeHMn pa3Hbix cTaäMM reMMHecKoM rMnoKcMM y Kpbic BBeäeHMeM HMTpMTa HaTpMn /
H. /BaHMUKan // naTo.. 0m3mo.. m 3KcnepMM. TepanMn. - 1976. - № 3. - C. 69-71.
2. /BaHHeHKo M. B. B.MnHMe BHyTpMyrpoÖHoM rMnoKcMM Ha reTeporeHMTeT mmtoxohapmm m nyTM ero pea.M3auMM npM a.bTepa-UMM xe.yäoHKoBoro MMoKapäa Kpbic / M. B. l/BaHHeHKo, l. B. TBepäox.e6 // BecTHMK Bo.rrMV - 2014. - № 4. - C. 13-16.
3. TBepäox.eö l. B. TeTeporeHHocTb MMToxoHäpMa.bHoro annapaTa MMoKapäa m MexaHM3Mb ee 0opMMpoBaHMn b paHHeM oh-ToreHe3e Kpbic / l. B. TBepäox.e6 // ÖMTo.orMn m reHeTMKa. - 1998. - T. 32, № 2. - C. 8-12.
4. TBepäox.iö I. B. npocTopoBa peKoHcTpyKuin öio.oriHHMx oö'eKTiB 3a äonoMoroi KoMn'iTepHoro Moäe.iBaHHn /
I. B. TBepaox.i6 // Mop^o.orin. - 2007. - T. 1, № 1. - C. 135-139.
5. Computerized three-dimensional analysis of the heart and great vessels in normal and holoprosencephalic human embryos / Sh. Yamada, H. Itoh, Ch. Uwabe [et al.] // Anat. Rec. - 2007. - № 290. - P. 259-267.
6. Du X. Computational analysis of three-dimensional epithelial morphogenesis using vertex models / X. Du, M. Osterfield, S. Y Shvartsman // Phys. Biol. - 2014. - Vol. 11, № 6. - P. 1475-1478.
7. Kuznetsov A. V. Heterogeneity of mitochondria and mitochondrial function within cells as another level of mitochondrial complexity / A. V. Kuznetsov, R. Margreiter // Int. J. Mol. Sci. - 2009. - Vol. 10 - P. 1911-1929.
8. Mitofilin complexes: conserved organizers of mitochondrial membrane architecture / R. M. Zerbes, V. D. Klei, M. Veenhuis [et al.] // Biol. Chem. - 2012. - № 11. - P. 1247-1261.
9. Munn E. A. The Structure of Mitochondria / E. A. Munn. - London : Academic Press, 1974. - 465 p.
10. Rasmussen N. Mitochondrial structure and the practice of cell biology in the 1950 s / N. Rasmussen // J. History Biol. - 1995. - № 28. - P. 381-429.
11. Topology of the mitochondrial inner membrane: dynamics and bioenergetic implications / C. A. Mannella, D. R. Pfeiffer, P. C. Bradshaw [et al.] // IUBMB Life. - 2001. - № 5. - P. 93-100.
12. Vogel F. Dynamic subcompartmentalization of the mitochondrial inner membrane / F. Vogel, C. Bornhuvd, W. Neupert // J. Cell Biol. - 2006. - Vol. 175, № 2. - P. 237-247.
13. Zick M. Cristae formation-linking ultrastructure and function of mitochondria / M. Zick, R. Rabl, A. S. Reichert // Biochim. Bio-phys. Acta. - 2009. - Vol. 1793, № 1. - P. 5-19.
YflK 611. 127:611. 018:576. 311. 347:611. 061. 1
KOMn'WTEPHMM TPMBMMiPHMM AHAni3 YnbTPACTPYKTyPHMX nEPE5YßOB TA PEAKUiM MiTOXOH-flPIM CKOPOTnMBMX KAPfliOMIOUMTIB ^yPiB 3AyMOB XPOHIHHOI nPEHATAnbHOI rinOKCN
iBaHHeHKO M. B.
Pe3№Me. npoBeäeHa npocTopoBa peKoHcTpyKuin MiToxoHäpiM KapäioMiouMTiB y HopMi Ta 3a yMoB rinoKcMHHo-ro yniKoflxeHHn. noKa3aHo, |o MiToxoHäpii npeäcTaB.eHi HM3bKoeHepreTMHHMMM Ta BMcoKoeHepreTMHHMMM TMna-mm. OpraHe.M Biäpi3Hn.Mcb 3a n.oiei noBepxHi BHyTpiwHbo'i MiToxoHäpia.bHol MeMÖpaHM, cTyneHeM opieHTaui'i Ta li.bHicTi MiToxoHäpia.bHMx kpmct. TaKox äoc.iäxeHHn cepiMHMx y.bTpa tohkmx 3pi3iB Ta npocTopoBa peKoHcTpyKuin opraHe. äo3Bo.M.a npoäeMoHcTpyBaTM 3MiHM, |o xapaKTepM3yBa.M npouecM yniKoflxeHHn MiToxoHäpiM 3a yMoB xpoHiHHoi npeHaTa.bHol rinoKcii Ta npoTnroM nepworo TMxHn xMTTn.
K.№HOBi c.OBa: iypM, MiToxoHäpii, rinoKcin, TpMBMMipHa peKoHcTpyKuin.
УДК 611. 127: 611. 018: 576. 311. 347: 611. 061. 1
КОМПЬЮТЕРНЫЙ ТРЕХМЕРНЫЙ АНАЛИЗ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ И РЕАКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОЙ ПРЕНА-ТАЛЬНОЙГИПОКСИИ
Иванченко М. В.
Резюме. Проведена пространственная реконструкция митохондрий кардиомиоцитов в норме и в условиях гипоксического повреждения. Показано, что митохондрии представлены низкоэнергетическими и высокоэнергетическими типами. Органеллы отличались по площади поверхности внутренней митохондри-альной мембраны, степени ориентации и плотности митохондриальных крист. Также исследование серии электронограмм и пространственная реконструкция органелл позволила продемонстрировать изменения, характеризующие процессы повреждения митохондрий в условиях хронической пренатальной гипоксии и в течение первой недели жизни.
Ключевые слова: крысы, митохондрии, гипоксия, трёхмерная реконструкция.
иРС 611. 127:611. 018:576. 311. 347:611. 061. 1
Computer Three-Dimensional Ultrastructural Analysis of Rearrangements and Reactions Mitochondria Rats Contractile Cardiomyocytes Under Hypoxic Damage
Ivanchenko M. V.
Abstract. The first images of the internal structure of mitochondria were provided over 50 years ago by transmission electron microscopy (TEM) of thin sections of chemically fixed and plastic-embedded specimens. The research results show their mitochondrial functional and structural heterogeneity. Such factors as the surface area of the inner mitochondrial membrane, orientation and density of cristae determine organelles belonging to a particular type. In the last 10 years, the technique of electron microscopes and computer-based reconstruction algorithms - has afforded morphologists true three-dimensional images of biological objects. Although the results of our previous studies demonstrate polymorphism of mitochondrial heterogeneity and correlation of features and ways to implement heterogeneity depending on the degree of influence of hypoxia volume reconstruction (creating three-dimensional models) will visualize the accumulated experimental and theoretical data for a holistic understanding of the pathological process what happens organelles.
Objective and methods. Analysis of the formation and reactions of the mitochondria network in rat muscle cells during prenatal and postnatal ontogeny under the influence of chronic hypoxia. White rats were used as a material. Intrauterine hypoxia was modelled by intraperitoneal injection of sodium nitrite from 10th to 21st day of pregnancy. Tissue of different parts of the myocardium was used for electron microscopic examination by the standard method. Image of serial ultrathin sections that has been studied, recorded on monochrome film Agfa followed digitized in JPEG-format with a scanner Canon CanoScan 9000F. To create computer models used software Photoshop CS5 (training pictures), Amira for microscopy 5.0 (creation and Contour), 3ds max 8.0 (final processing and visualization). The reconstruction was performed according to the recommendations Tverdokhlib I. V. (2007).
Results. Electron-microscopic examination of the myocardium of rats showed that intermyofibrillar, subsarcole-mal and paranuclear zone of cardiomyocytes control and experimental groups containing polymorphic mitochondria. We have performed a spatial reconstruction of organelles different areas. The results of computer analysis of mitochondrial apparatus has shown that mitochondria were represented by high and low energy mitochondria. Electron-microscopic study and 3D reconstruction of organelles during ontogeny were show typical changes that characterized the process of alteration of mitochondria. High-energy mitochondria are most prone to injury, the least sensitive - low-energy. Pathological strain or irreversible destruction of orthodox forms of high mitochondria led to a shift in the dynamic equilibrium between condensed forms of mitochondria and their transformation to the orthodox configuration, increasing the proportion of condensed forms - active adaptive process.
Moderate strain was accompanied by a volume increase of organelles mitochondria swelling, cristae disorientation and their partial degradation, sudden enlightenment matrix. Enhancing processes of alteration led to a further increase in the volume of mitochondria, leaching matrix expansion intermembrane cristae space, vacuolization. However, this degradation of mitochondria and the reverse in the case of reducing the intensity of damage in cardiomyocytes completed full restoration organelles. Degradation of mitochondria led to the formation in the outer membrane gaps and large areas of mitochondrial membrane.
Keywords: rats, mitochondria, hypoxia, 3D reconstruction.
Рецензент - проф. Врошенко Г. А.
Стаття надшшла 19. 09. 2014 р.
