CC BY
40
УДК 616.36-071
Н.П. Судаков 5, М.А. Новикова С.В. Липко 3, И.В. Клименков 2, О.А. Гольдберг С.Д. Ежикеева 5, Т.П. Попкова 5, Е.Г. Белых ‘, П.Ж. Барадиева С.Б. Никифоров ‘,
Ю.М. Константинов 4
УЛЬТРА- И НАНОСТРУКТУРНЫЕ НАРУШЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ДИСЛИПОПРОТЕИДЕМИИ
1 Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (Иркутск)
2Лимнологический институт СО РАН (Иркутск)
3 Институт геохимии им. А.Н. Виноградова СО РАН (Иркутск)
4 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск) 5 Иркутская областная клиническая больница (Иркутск)
Изучены структурно-функциональные нарушения митохондрий гепатоцитов при экспериментальной дислипопротеидемии. (135-е сутки). В крови, экспериментальных животных наблюдали, дисбаланс фракций липопротеинов, возрастание активности, аланинаминотрансферазы.. Показано, что в печени животных с моделью дислипопротеидемии развивается липидная, инфильтрация. Это сопровождается фрагментацией крист, митохондрий печени, набуханием., деструкцией и. вакуолизацией органелл. Митохондрии животных с экспериментальной, дислипопротеидемией также характеризовались изменениями наноархитектоники: возрастанием, рельефности и. уменьшением, площади, мембранных доменов. В целом, зарегистрированные изменения наноархитектоники, мембран служат, одной из причин формирования, наблюдаемых нарушений ультраструктуры, митохондрий и. могут, способствовать развитию митохондриальной, дисфункции. Дальнейшее изучение механизмов развития, структурнофункциональных нарушений митохондрий при. дислипопротеидемии будет, способствовать разработке новых технологий лечебно-профилактического воздействия на атерогенный процесс.
Ключевые слова: митохондриальная дисфункция, нарушения архитектоники микродоменной структуры мембран, оксистеролы, печень, дислипопротеидемия
DISTURBANCES IN ULTRA- AND NANOSTRUCTURE OF LIVER CELLS MITOCHONDRIA UNDER EXPERIMENTAL DISLIPOPROTEIDAEMIA
N.P. Sudakov 5, M.A. Novikova S.V. Lipko 3, I.V. Klimenkov 2, O.A. Goldberg S.D. Yezhiekeyeva 5, T.P. Popkova 5, E.G. Belykh ’, P.G. Baradieva ’, B.G. Pushkarev ‘,
S.V. Nikiforov ’, Yu.M. Konstantinov 4
1 Scientific Center of Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS, Irkutsk
2 Limnological Institute of SB RAS СО РАН, Irkutsk 3 Institute of Geochemistry named after A.N. Vinogradov SB RAS, Irkutsk
4 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry of SB RAS, Irkutsk
5 Irkutsk Regional Clinical Hospital, Irkutsk
Disturbance in structure and function of liver cells mitochondria under experimental dislipoproteidaemia have been studied, (on 135 day). We observed a disbalance in lipoprotein fractions and. an increase in alaninami-notransferase activity in blood. Lipid, infiltration, in liver was shown to occur under experimental dislipoproteidaemia. These are accompanied, by mitochondrial cristae fragmentation, mitochondria undergo swelling, destruction, and vacuolization. We observed the following disturbances in nanostructure of liver cells mitochondria under experimental dislipoproteidaemia: an increase in rough, and a decrease in membrane domains square. On the whole, the observed alterations in mitochondrial membranes nanostructure serve as a cause for ultrastructural disturbances in mitochondria to occur and may lead to mitochondrial dysfunction. The further investigation of the mechanisms responsible for these disturbances in mitochondrial structure and functions will contribute to the development of new techniques to treat atherosclerosis.
Key words: mitochondrial dysfunction, disturbance in nanostructure and membrane microdomain structure, oxysteroles, liver, dislipoproteademia
ВВЕДЕНИЕ
Атеросклероз сосудов различной локализации является сегодня одной из основных причин смертности населения Российской Федерации и других индустриально-развитых стран [1, 2]. Поиск и изучение патогенетических механизмов развития данного заболевания являются актуальным. Одним из перспективных фундаментальных направлений представляется изучение роли молекулярных механизмов возникновения митохондриальной дисфункции сосудов и печени в процессе развития
дислипопротеидемии и атеросклероза. Известно, что формирование структурно-функциональных нарушений митохондрий реализуется под воздействием избытка свободного холестерола, оксисте-ролов, действия окислительного стресса, провоспа-лительных цитокинов при дислипопротеидемии [7,
9, 12]. Реализация митохондриальной дисфункции в печени способствует снижению активности энергозависимых процессов, гибели клеток, увеличению внутриклеточного уровня жирных кислот вследствие угнетения р-окисления липидов в ми-
тохондриях, формированию фиброза, инициации воспалительного процесса [11, 1З]. Таким образом, прогрессирующее течение митохондриальной дисфункция клеток печени способствует необходимым условиям развития дислипопротеидемии и атеросклероза. Целью настоящего исследования являлся анализ структурных изменений в мембранах митохондрий печени при экспериментальной дислипопротеидемии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве экспериментальных животных использовали самцов крыс линии «Вистар», которые были подразделены на группы (по 1О животных в каждой): модель дислипопротеидемии (ежедневная атерогенная диета: 1 г холестерина и 0,2 г метилтиоурацила на 1 кг веса животного в течении 1З5 суток) и контроль (стандартная диета вивария). Анализировали липидный спектр (концентрация общего холестерола, холестерола ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП, триглицеридов), активность аминотрансфе-раз (АЛТ, АСТ) плазмы крови на биохимическом анализаторе Beckman synhron 4 (Beckman coulter, США). Гистохимически оценивали степень инфильтрации липидами печени. Митохондрии фракционировали методом дифференциального центрифугирования по общепринятой методике с использованием высокоскоростных центрифуг с охлаждением Allegra (Beckman Coulter, США) [5]. Очищенную фракцию митохондрий печени анализировали с использованием электронной трансмиссионной (LEO 9О6Е, Германия) и атомно-силовой микроскопии (сканирующий мульти-микроскоп СММ-2ООО, Россия) [6]. Экспериментальные исследования с животных проводили согласно приказу № 755 (12.О8.1977 г.) «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» и Правилам проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» (1999 г.). Для математической обработки результатов исследования использовали непараметрическую статистику. Межгрупповые различия оценивали по критерию Манна-Уитни и считали статистически значимыми при pu < О,О5 [З].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На 1 З5-е сутки моделирования дислипопротеидемии, уровень холестерола в крови экспериментальных животных не отличался от данных группы контроля (рис. 1). Тем не менее, концентрация холестерина ЛПНП возросла в 4,8 раза. Уровень холестерола ЛПОНП экспериментальных животных практически не отличался от контрольной группы. Содержание холестерола антиатероген-ной фракции ЛПВП уменьшилось по отношению к контролю в 1,9 раза. Наблюдаемые нарушения баланса липопротеинов крови крыс с моделью дис-липопротеидемии объективно характеризуются 14-кратным увеличением коэффициента атероген-ности в сравнении с контролем (pu < О,О5).
Активность АСТ крови экспериментальных животных не отличалась от данных группы контроля. В то же время, показано статистически значимое (в 1,6 раза; pu < 0,05) увеличение активности АЛТ крови, что характеризовало активность цитолитических процессов в печени животных с моделируемой дислипопротеидемией.
Дисбаланс липопротеинов крови способствовал развитию липидной инфильтрации печени животных с моделью дислипопротеидемии. На фоне морфологических изменений печени установлено формирование в митохондриях дегенеративных изменений (рис. 2), характеризуемых набуханием (10 %), деструкцией (0,5 %), сжатием (3 %) и вакуолизацией (15 %). Методом атомно-силовой микроскопии установлено, что поверхность митохондрий печени животных с моделью дислипопротеидемии характеризовалась уменьшением площади мембранных доменов (в 2,5 раза) и увеличением их количества. При этом возрастала степень средней (в 2 раза) и максимальной (в 1,9 раза) рельефности поверхности мембран (pu < 0,05). Регистрируемые изменения архитектоники мембран митохондрий являются следствием изменения их липидного состава и возможно отражают их насыщение холестеролом и продуктами его оксидативной модификации, а также активизацию в мембранах процессов перекисного окисления липидов [12, 15].
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, в условиях экспериментальной дислипопротеидемии, на фоне дисбаланса липопротеинов, увеличения активности аминотранс-фераз крови и развития липоидоза печени, наблюдается формирование дегенеративных изменений ультраструктуры и нарушений архитектоники мембран митохондрий. Отмеченные ультраструк-турные изменения митохондриальной фракции клеток печени животных с экспериментальной дислипопротеидемией (набухание, деструкция, сжатие и вакуолизация органелл) являются возможным следствием изменения структуры и проницаемости мембран митохондрий. Это объективно подтверждается данными анализа наноструктурных изменений архитектоники мембран митохондрий с применением атомно-силового микроскопа. Увеличение степени рельефности и уменьшение площади микродоменов мембран митохондрий является возможным следствием их насыщения холестеролом, продуктами его оксидативной модификации и других изменений их липидного состава. Наблюдаемые нарушения архитектоники митохондриальных мембран могут модифицировать структуру мембранных белков (компоненты дыхательных комплексов, различные транспортеры) и изменять характер взаимодействий проапоптотических белков с липидным бислоем [8, 10, 14]. Таким образом, наноструктурные изменения мембран митохондрий печени не только способствуют нарушениям их ультраструктуры, но и, по всей видимости, связаны с формированием митохондриальной
дисфункции. Об этом свидетельствуют данные хондрий печени [4]. Развитие митохондриальной
ранее выполненного исследования, где показано, дисфункции является одним из возможных ме-
что при моделировании дислипопротеидемии на ханизмов активизации в печени цитолитических
кроликах, происходит угнетение дыхания мито- процессов.
Рис. 1. Нарушения биохимических показателей крови при экспериментальной дислипопротеидемии: А - изменения уровня холестерола различных фракций и триглицеридов; Б - возрастание коэффициента атерогенности; В - изменения активности аминотрансфераз (АЛТ, АСТ).
Рис. 2. Ультра- и наноструктурные изменения митохондрий печени животных с экспериментальной дислипопротеидемией: А - нарушения ультраструктуры митохондриальной фракции печени (1 - митохондрии с вакуолями; 2 - фрагментация крист митохондрий; 3 - сжатие митохондрий; 4 - набухание митохондрий; 5 - митохондрии с неизмененной структурой); Б - изменения площади микродоменов митохондриальных мембран; В - изменения средней и максимальной рельефности (rough) митохондриальных мембран.
Универсальность механизмов негативного гиперхолестеринемии позволяет рассматривать
воздействия митохондриальной дисфункции на митохондрии в качестве одного из перспективных
клеточные и тканевые структуры печени при объектов цитопротекции при создании техно-
логий лечебно-профилактического воздействия на клетки печени в условиях гиперхолестерине-мии.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (проект 21.15).
ЛИТЕРАТУРА
1. Дзизинский А.А. Атеросклероз. — Иркутск : Изд-во Иркут. ун-та, 1997. — 280 с.
2. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов, липопротеидов и его нарушения. — СПб. : Питер Ком, 1999. — 512 с.
3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — М. : МедиаСфера, 200З. — З12 с.
4. Судаков Н.П., Новикова М.А., Никифоров С.Б., Клименков И.В. и др. Структурнофункциональные нарушения митохондрий печени при атеросклерозе в эксперименте // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология». — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 15 — 19.
5. Heidrich H.-G., Stahn R., Hanng K. The surface change of rat liver mitochondria and their membranes // J. Cell Biol. — 1970. — Vol. 46. — P. 1З7—150.
6. Layton B.E., Sastry A.M., Lastoskie C.M., Phil-bert M.A. et al. In situ imaging of mitochondrial outer-membrane pores using atomic force microscopy // BioTechniques. — 2004. — Vol. З7. — P. 564 — 57З.
7. Madamanchi N.R., Runge M.S. Mitochondrial dysfunction in atherosclerosis // Circ. Res. — 2007. — Vol. 100. — P. 460 — 47З.
8. Michal P., Rudajev V., El-Fakahany E.E., Dolezal V. Membrane cholesterol content influences
binding properties of muscarinic M2 receptors and differentially impacts activation of second messenger pathways // Eur. J. Pharmacol. — 2009. — Vol. 606. — P. 50-60.
9. Miguet-Alfonsi C., Prunet C., Monier S. et al. Analysis of oxidative processes and of myelin figures formation before and after the loss of mitochondrial transmembrane potential during 7p-hydroxycholesterol and 7-ketocholesterol-induced apoptosis: comparison with various pro-apoptotic chemicals // Biochem. Pharmacol. - 2002. - Vol. 64. - P. 527-541.
10. Olsen B.N., Schlesinger P.H., Baker N.A. Perturbations of membrane structure by cholesterol and cholesterol derivatives are determined by sterol orientation // J. Am. Chem. Soc. - 2009. - Vol. 131. -P. 4854-4865.
11. Parola M., Robino G. Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis // J. Hepatol. - 2001. -Vol. 35. - P. 297-306.
12. Rho M.C., Kim Y.K., Chang J.S. et al. 7-Keto-cholesterol predisposes human aorta smooth muscle cells to Fas-mediated death // J. Mol. Cell Cardiol. -2005. - Vol. 39. - P. 823-832.
13. Skulachev V.P. Programmed death phenomena: from organelle to organism // Ann. N.-Y. Acad. Sci. - 2002. - Vol. 959. - P. 214-237.
14. Staneva G., Momchilova A., Wolf C., Quinn P.J. et al. Membrane microdomains: role of ceramides in the maintenance of their structure and functions // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - Vol. 1788. -P. 666-675.
15. Yao P.M., Tabas I. Free cholesterol loading of macrophages is associated with widespread mitochondrial dysfunction and activation of the mitochondrial apoptosis pathway // J. Biol. Chem. - 2001. -Vol. 276. - P. 42468-42476.
Сведения об авторах
Судаков Николай Петрович - к.б.н., научный сотрудник НЦРВХ СО РАМН (664079, Иркутск, мкр. Юбилейный, 100; тел.: 8 (3952) 40-76-66; e-mail: [email protected]).
Новикова Маргарита Анатольевна - м.н.с. НЦРВХ СО РАМН (664003, г Иркутск, мкр. Юбилейный, 100; тел.: 8 (3952) 40-76-66).
Липко Сергей Викторович - н.с. Института геохимии им. А.Н. Виноградова (664033, г. Иркутск, ул. Фаворского, 1А; тел.: 8 (3952) 42-65-00).
Клименков Игорь Викторович - к.б.н., доцент, с.н.с. ЛИН СО РАН (664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3; тел.: 8 (3952) 42-65-04).
Гольдберг Олег Аронович - к.м.н., зав. отделом патоморфологии НЦРВХ СО РАМН (664003, г. Иркутск, мкр. Юбилейный, 100; тел.: 8 (3952) 40-76-66).
Ежикеева Светлана Дмитриевна - врач КДЛ ГУЗ ИОКБ (664079, г Иркутск, мкр. Юбилейный, 100; тел.: 8 (3952) 45-20-22).
Попкова Татьяна Павловна - биолог КДЛ ГУЗ ИОКБ (664079, г. Иркутск, мкр. Юбилейный, 100; тел. 8 (3952) 45-20-22).
Белых Евгений Георгиевич - студент 5 курса ИГМУ (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1).
Барадиева ПолинаЖамцарановна - студентка 4 курса ИГМУ (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1).
Никифоров Сергей Борисович - д.м.н., с.н.с. НЦРВХ СО РАМН (664079, г. Иркутск, микрорайон Юбилейный, 100; тел.: 8 (3952) 40-76-66).
Константинов Юрий Михайлович - д.б.н., профессор, заведующий лабораторией генетической инженерии растений СИФИБР СО РАН (664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132; тел.: 8 (3952) 42-67-21).
