CC BY
21
Серия «Биология. Экология»
2014. Т. 7. С. 104-109 Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
И З В Е С Т И Я Иркутского государственного университета
УДК 616.36-092.96:612.123
Динамика объёма липидных капель клеток печени при экспериментальной дислипопротеидемии
Н. П. Судаков1'4'5, И. В. Клименков2'4, О. А. Гольдберг1, С. Б. Никифоров1, С. А. Лепехова1'5, Ю. М. Константинов3'4
'Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии
СО РАМН, Иркутск 2Лимнологический институт СО РАН, Иркутск
3Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск 4Иркутский государственный университет, Иркутск 5Иркутский научный центр СО РАМН, Иркутск E-mail: [email protected]
Аннотация. Изучена динамика объёма липидных капель клеток печени на разных сроках экспериментальной дислипопротеидемии (до 90 сут.) на кроликах породы шиншилла методом лазерной конфокальной микроскопии. Анализ препаратов печени, окрашенных DAPI (ядра) и Nile red (липидные капли) показал, что уже с первых недель атерогенной диеты объём липидных капель в клетках печени статистически значимо возрастает. Это создает основу для формирования структурно-функциональных нарушений других внутриклеточных органелл, что способствует прогрессированию дислипопротеидемии. Полученные результаты определяют перспективу использования лазерной конфокальной микроскопии для исследований биоптата печени с целью ранней диагностики её липидной инфильтрации.
Ключевые слова: дислипопротеидемия, жировая инфильтрация печени, липидные капли, лазерная конфокальная микроскопия.
Введение
Известно, что развитие жировой инфильтрации печени способствует нарушению регуляции обмена холестерола крови - дислипопротеидемии, являющейся основной причиной развития одного из самых распространённых социально-значимых заболеваний - атеросклероза [1; 6]. Современные представления о клеточных механизмах развития нарушений липидного обмена в печени не обладают целостностью, достаточной для создания эффективных технологий их ранней диагностики, профилактики и лечения. В настоящее время показано, что роль липидных капель в клетках не ограничивается накоплением липидов - установлена их активная роль как в нормальном функционировании клетки, так и в развитии её повреждений при избыточном накоплении первых [4]. Тем не менее при дислипопротеи-демии не изучены количественные закономерности формирования липид-
ных капель, способных вызывать дисфункцию органелл в клетках печени. Решение данных вопросов будет служить основой для разработки новых технологий диагностики и прогнозирования структурно-функциональных нарушений печени при нарушениях липидного обмена крови, способствующих развитию атеросклероза.
Материалы и методы
В эксперименте использовали самцов кроликов породы щиншилла. Животные были разделены на две группы по 10 особей в каждой: модель дислипопротеидемии (ежедневная атерогенная диета: 350 мг холестерина на 1 кг веса животного в течение 90 сут.) и группа контроля (стандартная диета вивария). Изучали концентрацию общего холестерола, холестерола ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП крови на биохимическом анализаторе Beckman Synhron 4 (Beckman Coulter, США) с использованием наборов реагентов фирмы «Human GmbH» (Германия) согласно инструкции производителя. Индекс атерогенности рассчитывали по формуле Фридвальда [1]. Фрагменты ткани печени фиксировали 2%-ным параформальдегидом. Ядра клеток окрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, США), липидные капли - Nile red (Sigma-Aldrich, США) [8]. Сканирование срезов печени осуществляли с помощью лазерного конфокального микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss, Германия). Полученные при сканировании трёхмерные изображения обрабатывались математически в программной среде Imaris Bitplane 7.2.3. Оценивали общий объём липидных капель в 1*10б ^m3 ткани печени. Все манипуляции с экспериментальными животными осуществлялись согласно правилам проведения работ с использованием животных в эксперименте (Минздрав СССР, приказ 12.07. 1977 г. № 755) и «Правилами проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» (утверждены Минздравом РФ и введены в действие с 1 января 1999 г.). Статистический анализ полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10. Межгрупповые различия оценивали по критерию Манна - Уитни и считали статистически значимыми при pu < 0,05.
Результаты и обсуждение
Установлено, что у экспериментальных животных дисбаланс атеро-генной (ЛПНП и ЛПОНП) и антиатерогенной (ЛПВП) фракций холесте-рола крови формируется уже на 2-е сут. моделирования дислипопротеи-демии и характеризуется двукратным возрастанием индекса атерогенно-сти (pu < 0,05). К 7-м суткам наблюдения данный показатель увеличивается в сравнении с контролем в б раз (pu < 0,05). На 30-е и 90-е сут. эксперимента данный показатель возрастает в 28 и 31 раз соответственно (pu < 0,05), что отражает развитие выраженных нарушений обмена липи-дов крови. С помощью лазерной конфокальной микроскопии показано, что на фоне данных изменений липидного обмена крови в гепатоцитах на 7-е сут. экспериментальной дислипопротеидемии регистрируется статистически значимое (pu < 0,05) трёхкратное возрастание общего объёма
липидных капель в сравнении с контролем (рис.). Зарегистрированная величина липидной инфильтрации в печени животных, получавших ате-рогенную диету, сохраняется и на 30-е сут. эксперимента. Можно предположить, что выявленное сохранение объёма липидных капель клеток печени с 7-х по 30-е сут. атерогенной диеты отражает сохранность механизмов, обеспечивающих резистентность печени к развитию липидной инфильтрации. К данным механизмам можно отнести повышенную экспрессию белка РАТ-1, активизирующего утилизацию жирных кислот, активизацию липофагии, повышение активности 7а-гидроксилазы -ключевого фермента метаболизма холестерола в желчные кислоты [1; 5; 7]. На 90-е сут. наблюдения объём липидных капель клеток печени возрастает в 19 раз (ри < 0,05) по отношению к группе контроля, что отражает развитие выраженных нарушений липидного обмена в печени.
а
мкмэ 30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
б
я Й
;
30 90 сутки
^^ контроль ^^ атерогенная диета
* p < 0,05 в сравнении с контролем
Рис. 1. Изменения общего объёма липидных капель в клетках печени при атерогенной диете: а - трёхмерная реконструкция фрагмента ткани печени при экспериментальной дислипопротеидемии (90 суток): 1 - ядра (DAPI); 2 - липид-ные капли (Nile red); б - динамика общего объёма липидных капель в 1 • 106 цш3 ткани печени под влиянием атерогенной диеты
Наблюдаемое высокое содержание внутриклеточных липидных включений может приводить к возрастанию уровня продуктов перекисного окисления липидов, повреждающих органеллы клетки и, таким образом, способствующих прогрессированию функциональных нарушений печени. Ранее нами были охарактеризованы структурно-функциональные нарушения митохондрий клеток печени, формирующиеся на 135-е сут. атерогенной диеты. Данные нарушения проявляются изменением микрорельефа митохонд-риальных мембран, фрагментацией крист, набуханием митохондрий, а также снижением их дыхательной активности [2; 3]. По всей видимости, зарегистрированная митохондриальная дисфункция клеток печени при экспериментальной дислипопротеидемии является одним из последствий развития липидной инфильтрации данного органа.
Таким образом, метод лазерной конфокальной микроскопии позволяет уже в течение первых недель экспериментальной дислипопротеидемии выявить возрастание объёма липидных капель в клетках печени, что служит основой для формирования их структурно-функциональных нарушений. Это определяет перспективу использования данной технологии для исследований биоптата печени с целью ранней диагностики её липидной инфильтрации. Высокий интерес представляет изучение механизмов обратимости ранних этапов развития жировой инфильтрации печени при дисли-попротеидемии, что будет способствовать созданию новых технологий лечения и профилактики данных патологических процессов.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки -медицине» (проект ФНМ-'5-20'2), стипендии Президента РФ (проект СП-285.20'2.4), гранта Carl Zeiss (проект Prospects of using confocal laser scanning microscopy of the diagnostics and prognosis of fatty liver disease associated with metabolic syndrome, 20'3 г).
Список литературы
1. Климов А. Н. Обмен липидов, липопротеидов и его нарушения / А. Н. Климов, Н. Г. Никульчева. - СПб : Питер Ком, 1999. - 512 с.
2. Структурно-функциональные нарушения митохондрий печени при атеросклерозе в эксперименте / Н. П. Судаков [и др.] // Изв. Иркут. гос. ун-та. Сер. Биология. Экология. - 2008. - Т. 1, № 2. - С. 15-19.
3. Ультра- и наноструктурные нарушения митохондрий клеток печени при экспериментальной дислипопротеидемии / Н. П. Судаков [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - № 5. - С. 197-201.
4. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipo-toxicity / A. Herms [et al.] // Curr. Biol. - 2013. - Vol. 23. - P. 1489-1496.
5. Liu K. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. / K. Liu, M. J. Czaja // Cell Death Differ. - 2013. - Vol. 20. - P. 3-11.
6. Other aspects of bariatric surgery: liver steatosis, ferritin and cholesterol metabolism / A. E. Pontiroli [et al.] // Nutr. Hosp. - 2013. - Suppl. 2. - P. 104-108.
7. OXPAT/PAT-1 is a PPAR-induced lipid droplet protein that promotes fatty acidutilization. / N. E. Wolins [et al.] // Diabetes. - 2006. - Vol. 55. - P. 3418-3428.
8. The effect of simvastatin on lipid droplets accumulation in human embryonic kidney cells and pancreatic cancer cells. / H. Gbelcova [et al.] // Lipids Health Dis. -2013. - Vol. 12. - P. 126.
Dynamics of Lipid Droplets Volume in Liver Cells at Experimental Dyslipoproteinemia
N. P. Sudakov1'4'5, I. V. Klimenkov2,4 O. A. Goldberg1,
S. B. Nikiforov1, S. A. Lepekhova1'5, Yu. M. Konstantinov3'4
'Scientific Center for Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS, Irkutsk 2Limnological Institute SB RAS, Irkutsk
3Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk 4Irkutsk State University, Irkutsk 5Irkutsk Scientific Center, SB RAS, Irkuts
Abstract. The dynamics of lipid droplets volume in liver cells at different periods of experimental dyslipoproteinemia (to 90 days) were studied using Shinshilla rabbits by laser confocal microscopy. The analysis of liver preparations stained with DAPI (nuclei) and Nile red (lipid droplets) showed that as early as from the first weeks of experimental dyslipoproteinemia, the volume of lipid droplets significantly increases in liver cells. This makes the basis for the formation of structural and functional disturbances in the intracellular organelles that enhances dyslipoproteinemia. These results open the possibility of using confocal scanning microscopy for analysis of liver tissue samplings for early diagnostics of liver infiltrations with lipids.
Keywords: dyslipoproteinemia, lipid infiltration of the liver, lipid droplets, laser confo-cal microscopy.
Судаков Николай Петрович кандидат биологических наук, доцент старший научный сотрудник Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН 664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1 Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 Иркутский научный центр СО РАН 664033, гю Иркутск ул. Лермонтова, 134 тел.: (3952) 29-03-39 e-mail: [email protected]
Sudakov Nikolai Petrovich Candidate of Sciences (Biology) Associate Professor, Senior Research Scientist
Scientific Center for Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS ', Bortsov Revolyutsii St., Irkutsk, 664003 Irkutsk State University ', K. Marx st., Irkutsk, 664033 Irkutsk Scientific Center, SB RAS '34, Lermonrovs St., Irkutsk, 664033 tel.: (3952) 29-03-39 e-mail: [email protected]
Клименков Игорь Викторович кандидат биологических наук, доцент старший научный сотрудник Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3
Klimenkov Igor Victorovich Candidate of Sciences (Biology), Associate Professor, Senior Research Scientist Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (395 2) 42-32-80 е-шаП: [email protected]
Гольдберг Олег Аронович
кандидат медицинских наук
ведущий научный сотрудник
Научный центр реконструктивной
и восстановительной хирургии СО РАМН
664003, г. Иркутск, ул. Борцов
Революции, 1
тел.: (3952) 29-03-39
е-шаП: [email protected]
Никифоров Сергей Борисович
доктор медицинских наук
ведущий научный сотрудник
Научный центр реконструктивной
и восстановительной хирургии СО РАМН
664003, г. Иркутск, ул. Борцов
Революции, 1
тел.: (3952) 29-03-39
е-шаП: [email protected]
Лепехова Светлана Александровна доктор биологических наук заведующий отделом Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН 664003, г. Иркутск, ул. Борцов Революции, 1
Иркутский научный центр СО РАМН 664033, г. Иркутск ул. Лермонтова, 134 тел.: (3952) 29-03-39 е-mail: [email protected]
Константинов Юрий Михайлович доктор биологических наук, профессор заведующий лабораторией Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952) 42-49-03 е-mail: [email protected]
Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003 tel.: (395 2) 42-32-80 е-mail: [email protected]
Goldberg Oleg Aronovich Candidate of Sciences (Medicine) Leading Research Scientist Scientific Center for Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS 1, Bortsov Revolyutsii st., Irkutsk, 664003 tel.: (3952) 29-03-39 е-mail: [email protected]
Nikiforov Sergei Borisovich Doctor of Sciences (Medicine) Leading Research Scientist Scientific Center for Reconstructive and Restorative Surgery SB RAMS 1, Bortsov Revolyutsii st., Irkutsk, 664003 tel.: (3952) 29-03-39 е-mail: [email protected]
Lepekhova Svetlana Aleksandrovna
Doctor of Sciences (Biology)
Head of Department
Scientific Center for Reconstructive and
Restorative Surgery SB RAMS
1, Bortsov Revolyutsii st., Irkutsk, 664003
Irkutsk Scientific Center SB RAMS
134, Lermonrovs st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 29-03-39
е-mail: [email protected]
Konstantinov Yurii Mikhailovich
Doctor of Sciences (Biology), Professor
Head of Laboratory
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
'32, Lermontov st., Irkutsk, 664033
Irkutsk State University
', K. Marx st., Irkutsk, 664003
tel.: (3952) 42-49-03
е-mail: [email protected]
