CC BY
42Фізика живого, Т. 16, N01, 2008. С.50-55. © Нардід О.А.
УДК 577.325.33
ОСОБЛИВОСТІ ТЕМПЕРАТУРНИХ ЗАЛЕЖНОСТЕЙ ВІДНОВЛЕННЯ СПІНОВОГО ЗОНДА В СУСПЕНЗІЇ МІТОХОНДРІЙ
Нардід О.А.
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська 23, 61015, м. Харків, Україна, е-mail: cryo@online.kharkov.ua; olnard@mail.ru
Надійшла до редакції 09.02.2008
Досліджено процес відновлення спінового зонда ТЕМПОН у суспензіях мітохондрій в залежності від температури. Установлено наявність термічного структурного переходу в мембранах органел в області температури 10°С. Висловлюється припущення, що ініціаторами структурної перебудови в мембранах мітохондрій цілком можуть виступати білкові структури, зокрема, ферментний комплекс ланцюга переносу електрона, зосереджений у внутрішній мембрані мітохондрій. Обговорюється можливість використання отриманих даних при розробці способів довготривалої консервації біологічних структур в умовах низьких температур.
Ключові слова: електронний парамагнітний резонанс, відновлення спінового зонда, мітохондрії, ферменти дихання, структурні перебудови.
ВСТУП
Іміноксильні вільні радикали, що широко використовуються в медико-біологічних
дослідженнях, які проводяться методом електронного парамагнітного резонансу, є досить активними акцепторами електрона. Відновлення іміноксильних радикалів, які застосовуються як спінові зонди й мітки, у біологічних об'єктах спостерігали ще в 1966 р. Кокер, Вівер, і ін. [15,19]. Реакції відновлення іміноксильних радикалів мають ту особливість, що для їхнього здійснення в більшості випадків необхідна присутність не тільки донора електронів, але й донора протонів. Тому відновлення іміноксильних радикалів відбувається в середовищах із присутністю сполук, що володіють достатньою рухливістю водню. До таких середовищ відносяться суспензії клітинних органел, у тому числі мітохондрій, де спостерігається відновлення радикалів не тільки при кислих показниках рН, але й при нейтральних фізіологічних і слабко лужних рН. Очевидно, у цьому полягає каталітична роль окислювально-відновних систем органел, зокрема їхнього дихального ланцюга. На користь цього свідчить той факт, що здатність до відновлення спінового зонда у зруйнованих мітохондрій виявилася менше, ніж у цілих мітохондрій [6]. Висловлювалося припущення, що відновлення нітроксилів значною мірою відбувається за рахунок взаємодії із семихінонами, зокрема, коензима Q. Інгібіторний аналіз дихання мітохондрій, проведений
ще в 1971 році [14] і пізніше підтверджений іншими авторами [17] показав, що спіновий зонд приймає електрони на ділянці дихального ланцюга між місцями дії ротенону й антиміцину А. Із цього витікає, що ферменти, які відновлюють спіновий зонд, локалізовані в зоні електронтранспортного ланцюга між флавіном і цитохромом Ь5.
Цілий ряд процесів, у яких задіяні мембранні структури, у тому числі й електронпереносних мембран, супроводжуються конформаційними перебудовами в них. Такі конформаційні перетворення біомембран, а також і
внутрішньомолекулярна динаміка самих
біомакромолекул можливі при цілому ряді фізико-хімічних процесів і зміні умов середовища. Так, ці процеси протікають при зволоженні ліофілізованих мембран, переході їх в енергізований стан, під впливом ряду катіонів, іонної сили, рН середовища, біологічно активних речовин у фізіологічних концентраціях [6,8,9,11]. Відомо, що зміна температури також приводить до структурних перебудов у біологічних мембранах [1,2]. Такі структурні перебудови мембран стосуються ферментних систем, що беруть участь у переносі електронів і протонів [1,18,20].
Все вищевикладене дозволяє припустити, що структурні перебудови мембран, які відбуваються при зміні температури, можуть впливати на процес відновлення спінових зондів ланцюгом дихання мітохондріальної мембрани.
Відповідно до цього мета даної роботи -вивчення впливу температури на процес відновлення спінового зонда в суспензіях мітохондрій у температурному діапазоні структурних перебудов мембран клітинних органел.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Для виконання роботи використовували білих безпорідних щурів масою 220-250 г. Дослідження проводили згідно з вимогами етичного комітету ІПКіК НАН України і загальних принципів планування експериментів на тваринах. Мітохондрії виділяли за допомогою диференціального центрифугування, використовуючи незначну модифікацію описаного в літературі методу [13]. Шматочки печінки масою близько 4 г переносили на 5 хв в охолоджене до 0°С безкалієве середовище, яке містило 0,3 М сахарози, 1 мМ ЕДТА, 10 мМ трис-НСІ (рН=7,4). Після цього шматочки печінки продавлювали важільним пресом через отвори діаметром 1 мм. До подрібненої тканини додавали середовище виділення у співвідношенні 1 до 10 і гомогенізували ручним гомогенізатором Даунса. Гомогенат центрифугували при 600 g на протязі 10 хв. Отриманий супернатант центрифугували при 10000 g на протязі 15 хв. Осад мітохондрій суспендували в середовище виділення. Отримана таким чином суспензія мітохондрій містила 40-60 мг/мл білка.
Окислювально-відновну активність біологічних суспензій досліджували методом ЕПР спінових зондів [5,6] з використанням водорозчинного зонда ТЕМПОН (2,2,6,6-тетра-метил-4-оксопіперидин-1-оксил) фірми "АМгіеЬ". Даний іміноксильний радикал добре розчинний у воді й інших полярних розчинниках. Кінцева концентрація зонда в зразках становила 0,8х10-4М. Спектри ЕПР реєстрували на спектрометрі "Брукер" ЕЯ 100Б (Німеччина) зі стандартною термоприставкою. Розгортка магнітного поля становила 100 Гс. Постійна часу дорівнювала
0,5 с. Час розгорнення становив 100 с. У дослідженнях використовували скляні капіляри з внутрішнім діаметром 500 нм і об’ємом 0,1 мл. Контрольні досліди показали, що при описаних умовах не відбуваються зміни спектрів у результаті перемодуляції або інерційних ефектів.
Для стандартизації умов експерименту одночасно із сигналом ЕПР зонда реєстрували сигнал стандарту, що представляє собою кристал, решітка якого вміщує іони хрому.
Як параметр кінетики відновлення спінових зондів використовували відносні зміни амплітуди середньопольового компонента спектра ЕПР зонда Ь0 в залежності від часу.
Статистична обробка результатів проводилась за допомогою програм “Statistica v5.0” і “Origin 6.1” (OriginLab Corporation, США). У випадках
лінеарізованих залежностей типове значення
коефіцієнта кореляції r становило 0,996 - 0,999. Результати досліджень було оброблено статистично з використанням параметричного критерію Стьюдента-Фішера. Достовірно відмінними вважали результати при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Авторами більш ранніх робіт [6,7] було виявлено, що у свіжоприготовлених препаратах мітохондрій і субмітохондріальних часток відбувається швидке відновлення іміноксильних радикалів при кімнатній температурі. Реакція такого відновлення протікає по експонентній залежності від часу, а логарифм концентрації зонда в координатах lnc, t - це пряма лінія (напівлогарифмічна анаморфоза), тангенс кута нахилу якої дорівнює ефективній константі швидкості реакції кеф. На рис.1 представлена експериментально отримана напівлогарифмічна анаморфоза відновлення нітроксильного радикала ТЕМПОН у суспензії мітохондрій з печінки щурів при 20°С. По осі ординат відкладені логарифми пікової інтенсивності средньопольового компонента спектра ЕПР спінового зонда h0. Необхідно враховувати, що величина ho за інших рівних умов пропорційна концентрації зонда.
Час, хв
Рис. 1. Відновлення спінового зонда ТЕМПОН у суспензії мітохондрій .
Такі складові процесу відновлення спінового зонда в суспензії мітохондрій як дифузія нітроксильного радикала і водорозчинних субстратів, активність зв’язаних з мембраною ферментних систем дихального ланцюга є температурозалежними. У зв'язку із цим природно, що й сам процес відновлення повинен бути досить сильно залежним від температури. На рис. 2
Нардід О.А.
представлені графіки відновлення спінового зонда від часу при деяких температурах з дослідженого діапазону. У таблиці наведені константи швидкостей відновлення зонда в досліджених біологічних суспензіях обчислені за тангенсом кута нахилу відповідних напівлогарифмічних анаморфоз при температурах, які наведені на рис. 2.
Час, хв
Рис. 2. Відновлення спінового зонда ТЕМПОН від часу в суспензії мітохондрій при різних температурах.
Таблиця
Константи швидкостей відновлення спінового зонда в суспензії мітохондрій при різних температурах (М±т; п=6).
Температура, К кеф, хв-1
273 0,014±0,001
283 0,019±0,003
293 0,033±0,003
303 0,056±0,004
Із представлених даних видно, що швидкість відновлення спінового зонда в значній мірі сповільнюється при зниженні температури. Якщо припустити, що процес відновлення спінового зонда є процесом активаційного типу (а переважна більшість процесів, що відбуваються в природі, відносяться саме до процесів активаційного типу), то можна записати наступне рівняння Ареніуса:
к ^ кеф= — ехр h
- E1
еф
RT
(1)
де Е еф - ефективна енергія активації
відновлення зонда; к - постійна Больцмана; Ь -постійна Планка; Я - газова постійна. Прологарифмувавши рівняння (1), маємо
Іпкеф = Іп-
еф
(2)
h RT
Перший доданок у рівнянні (2) залежить від температури слабко і ним зазвичай нехтують. Таким чином, одержуємо лінійну залежність Іпкеф
від yT. По нахилу цієї прямої можна визначити
енергію активації процесу відновлення спінового зонда Е 1еф , що представляє собою тепловий ефект
реакції переходу системи з вихідного стану в активований.
На рисунку 3 представлена залежність Ареніуса для процесу відновлення спінового зонда ТЕМПОН у суспензії мітохондрій. На залежності в явному вигляді проявляється злам в області 10°С.
-3,6
-3.8
-4,0
-4,2
-4.4
-4,6
•4,8
-5.0
-5,2
3,25 3,30 3,35 3,40 3,45 3,50 3,55 3,60 3,65 3,70
1000/Т (К ’)
Рис. 3. Залежність Ареніуса процесу відновлення спінового зонда ТЕМПОН у суспензії мітохондрій.
Відновлення спінового зонда при температурах нижче 10°С протікає повільно, тоді як вище 10°С швидкість спаду інтенсивності сигналу ЕПР значно збільшується. Злам, який спостерігається на експериментальних залежностях, свідчить про те, що при цій температурі відбуваються структурні перебудови у внутрішній мембрані мітохондрій, де зосереджено ферментний комплекс ланцюга переносу електрона, який спричиняє процес відновлення спінового зонда. Прийнято вважати, що фазово-структурні зміни в біологічних мембранах мають кооперативний характер. Проте, виходячи з того, щ о процес відновлення спінового зонда, який ми спостерігаємо, обумовлений мембран-зв'язаними білками, можна припустити, що ініціація цього переходу належить білковим компонентам. Підтвердженням цього є факт виявлення структурного переходу водорозчинним спіновим зондом, що використовувався для дослідження процесу відновлення, локалізація якого в ліпідній частині мембрани досить невелика
[12]. Для додаткового підтвердження висловленого припущення було досліджено параметр рухливості спінового зонда ТЕМПОН в мітохондріях у тому ж температурному діапазоні. У якості параметра обертальної дифузії використовували величину V, що умовно називається «частотою обертання» радикала й визначається за формулою [10]:
35 X 25 20
v(-1)=1
3,6 -109
c(-1)
\
(3)
h
-1
(-1)
АН 0
де АН 0 - ширина центрального компонента спектра ЕПР у гаусах; і h0 - пікові
інтенсивності високо- і низькопольових
компонентів спектра; тс - час кореляції
обертальної дифузії зонда. Величини АН 0, h0 і
к{=Х) визначаються з експериментальних спектрів
ЕПР. Аналогічно рівнянню (2) можна одержати залежність Ареніуса для «частоти обертання» радикала:
, , kT E4
lnv = ln---------------
h RT
(4)
де E еф - ефективна енергія активації
обертальної дифузії іміноксильних радикалів. Температурна залежність обертання зонда ТЕМПОН у суспензії мітохондрій представлена на рис. 4. З рисунка видно, що залежність Ареніуса «частоти обертання» спінового зонда також, як і його швидкість відновлення, проявляє злам при температурі 10°С, що підтверджує наявність
конформаційної перебудови білків дихального ланцюга мітохондрій. В області температур 10-12°С спостерігається також мінімум солюбілізації
жирнокислотного гідрофобного зонда в мембранах мітохондрій. Було встановлено [2], що в області температур 8-10°С в суспензії мітохондрій
відбувається різка зміна залежності максимуму флуоресценції МБА від температури. Цікаво підкреслити, що подібна різка зміна відсутня на температурній залежності максимуму
флуоресценції зонда в ліпосомах з мітохондріальних ліпідів, що підтверджує висловлене вище припущення про ініціацію переходу білковими компонентами мембрани мітохондрій.
11.1011.0511,0010.95 -
Igv, сек
10,9010.8510,80 -
3.25 3.30 3.35 3.40 3.45 3.50 3.55 3.60 3.65 3.70
1000/Т(К1)
Рис. 4. Залежність Ареніуса параметра обертальної дифузії спінового зонда ТЕМПОН у суспензії мітохондрій.
Поряд із цим, варто підкреслити, що небезпідставно вважається, що фазові переходи ліпідів у біологічних мембранах впливають на кінетику й енергетику дії мембран-зв'язаних ферментів. Функціональна активність мембранних білків значно залежить від динамічних властивостей ліпідного матриксу мембрани, що забезпечують конформаційну рухливість ферменту
- здатність білкової молекули робити конфірмаційний перехід з напруженого стану в розслаблений стан і навпаки [4]. Зміна структурної організації ліпідного бішару може ускладнювати взаємодію ферментів, що перебувають у їхньому оточенні [16]. Найчастіше припускають, що саме фазові переходи ліпідів можуть викликати структурні зміни в біологічних мембранах. Одним з експериментальних доказів цього є дані, одержані при вивченні температурної залежності в'язкості оброблених ультразвуком мембран еритроцитів людини й ліпідів, отриманих з мембран екстракцією. Наведені в статті експериментальні дані дозволяють вважати, що ініціаторами структурних перебудов у біологічних мембранах цілком можуть виступати й білкові структури. При цьому треба враховувати, що взаємодії які визначають структурну організацію ферменту є короткодіючими. Тому різку зміну активаційного бар'єра можуть викликати незначні й необов'язково стрибкоподібні зміни структури активного центра [6]. Безперервні й незначні відмінності структури можуть приводити до стрибків деяких фізичних параметрів системи, наприклад, проникності мембрани. Крім того, різке уповільнення енергетичних процесів у мембранах мітохондрій при зниженні температури, що спостерігається експериментально і проявляється в зменшенні швидкості відновлення спінових зондів й їхньої обертальної дифузії, є підтвердженням загальної
с
Нардід О.А.
закономірності, що постулює уповільнення процесу метаболізму живих організмів зі зниженням температури. Саме ця закономірність використовується при розробці різних способів довготривалої консервації біологічних структур в умовах низьких температур.
ВИСНОВКИ
У роботі для вивчення електронпереносних біомембран мітохондрій використано метод слабко зв’язаних спінових зондів. Аналіз температурної залежності параметрів спектрів ЕПР спінових зондів показав наявність термічного структурного переходу в мембрані органел. Зокрема, у результаті проведених досліджень було показано, що
залежність Ареніуса процесу відновлення
спінового зонда ТЕМПОН у суспензії мітохондрій має злам при 10°С. Аналогічне відхилення залежності Ареніуса від прямолінійної
спостерігається й для «частоти обертання» радикала. Одержані факти однозначно свідчать про наявність структурної перебудови у внутрішній мембрані мітохондрій у досліджуваному діапазоні температур. У цій зоні відбувається стрибкоподібна зміна формальної енергії і ентропії активації мембранних ферментних процесів. Крім того, комплекс даних, представлених у роботі дозволяє висловити припущення про те, що ініціаторами структурної перебудови в мембранах мітохондрій, яка експериментально спостерігається, цілком можуть виступати білкові структури, зокрема ферментний комплекс ланцюга переносу електрона, зосереджений у внутрішній мембрані мітохондрій. Таке поводження біологічних мембран є одним з адаптаційних механізмів біологічних структур до зниження температури [1,3], який необхідно враховувати при розробці технологій кріоконсервування біооб'єктів.
Література
1. Белоус А.М., Бондаренко ВА. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. - Киев: Наук. Думка, 1982.-256 с.
2. Владимиров ЮА., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран.-М.: Наука, 1980.-320 с.
3. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции.- М.: Мир, 1997.-624 c.
4. Гринштейн С.В., Кост ОА. Структурнофункциональные особенности мембранных белков II Успехи биологической химии.-2001.-Т.41.-С. 77-104.
5. Жданов Р.И. Парамагнитные модели биологически активных соединений. - М.: Наука, 1981. - 280 с.
6. Кольтовер В.К. Исследование електрон-переносящих биологических мембран методом молекулярных зондов: Автореф. дис. ... канд. физ.-мат. наук.- М.: ИХФ АН СССР, 1971.
7. Кравцов Ю.В. Исследования методом спинового зонда некоторых структурных и функциональных характеристик биологических систем: Автореф. дис. . канд.биол. наук.- М.: Ин-т.вирусологии АМН СССР, 1977.
8. Левин С.В. Структурные изменения клеточных мембран.
- Л.:-Наука, 1976.-224 с.
9. Ленинжер А.Митохондрия-М.:Мир,1966.-236 с.
10. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии.-М.: Наука, 1974.-256 с.
11. Мажуль В.М., Галец И.В. Внутримолекулярная динамика белков в составе биологических мембран и клеток / Материалы IY съезда фотобиологов России.-Саратов, 26-30 сентября, 2005. - С. 118-120.
12. Метод спиновых меток. Теория и применение Под ред. Л.Берлинера.-М.: Мир,1979.-640 с.
13. Мосолова И.М., Горская А.И., Шольц К.Ф. и др. Выделение интактных митохондрий из печени крыс.: Методы современной биохимии.-М.: Наука, 1975.-С. 4547.
14. Ягужинский Л.С., Чумаков В.М., Иванов В.П. и др. Взаимодействие иминоксильной спин-метки с системой транспорта электронов в митохондриях //Докл. АН СССР.-1971.-Т. 197,№4.-С. 969-972.
15. Corker GA., Klein M.P., Calvin M. Chemical trapping of a primary quantum conversion product in photosynthesis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1966.-Vol. 56, N5.- P. 13651369.
16. Lee A.G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. // Biochim Biophys Acta.- 2004.-Vol.666.- P. 62-87.
17. Quintanilha A.T., Racker L. Surface localization of sites of reduction of nitroxide spin-labeled molecules in mitochondria. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1977.- Vol. 74, N2.- P. 570-574.
18. Watson K., Bertoli E., Griffiths D.T. Phase transitions in yeast mitochondrial membranes. The effect of temperature on the energies of activation of the respiratori enzymes of Saccharomyces cerevisiae // Biochem. J.- 1975.- Vol. 146,N2/-P. 401-407.
19. Weaver E., Chon H.P. Spin label studies in chlamidomonas // Science.- 1966.- Vol.153.- P. 301-305.
20. Wilshut J.C., Sherphof G.L. The effect of partil degradation of mitochondrial phospholipids by phospholipase A on the temperature dependence of succinate - cytochrome c reductase and cytochrome c oxidase // Biochim. Biophis. Acta.- 1974.- Vol.356,N1.- P. 91-99
ОСОБЕННОСТИ ТЕМПЕРАТУРНЫХ ЗАВИСИМОСТЕЙ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СПИНОВОГО ЗОНДА В СУСПЕНЗИИ МИТОХОНДРИЙ
Нардид О.А.
Исследован процесс восстановления спинового зонда ТЕМПОН в суспензиях митохондрий в зависимости от температуры. Установлено наличие термического структурного перехода в мембранах органелл в области 10°С. Высказывается предположение, что инициаторами структурной перестройки в мембранах митохондрий вполне могут выступать белковые структуры, в частности, ферментный комплекс цепи переноса электрона, сосредоточенный во внутренней мембране митохондрий. Обсуждается возможность использования полученных данных при разработке способов длительной консервации биологических структур в условиях низких температур.
Ключевые слова: электронный парамагнитный резонанс, восстановление спинового зонда, митохондрии, ферменты дыхания, структурные перестройки.
PECULIARITIES OF TEMPERATURE DEPRNDENCES OF SPIN PROBE REDUCTION IN MITOCHONDRIA SUSPENSION Nardid O.A.
The process of TEMPON spin probe recovery in mitochondria suspensions depending on temperature has been studied. The presence of structural transition in membrane of organelles in the area of 10°C was found. There is a speculation, that protein structures, in particular, enzyme complex of electron chain transfer, located in inner membrane of mitochondria, may act well as the initiators of structural re-arrangement in mitochondria membranes. The possibility of using the obtained data on development of the ways for long-term preservation of biological structures under low temperatures is under discussion
Key words: electron paramagnetic resonance, recovery of spin probe, mitochondria, respiration enzymes, structural re-arrangements.
