CC BY
16
2017, том 19 [5]
УДК 616-092.9
КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СПИНАЛЬНОМ ИНСУЛЬТЕ: МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВЗАИМОСВЯЗИ
Осиков М.В., Володченко А.М., Гиниатуллин Р. У., Федосов А.А.
ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет, г. Челябинск, Российская Федерация.
Аннотация: Цель работы - изучить морфофункциональные взаимосвязи при комбинированном применении эритропоэтина (ЭПО) и лазерного излучения (ЛИ) при экспериментальном спинальном инсульте (СИ) - реализована на 54 нелинейных крысах, СИ моделировали тотальной интравазальной окклюзией брюшной аорты и ее ветвей, через 2 ч проводили накожное ЛИ диодным лазером (длина волны 980 нм), через 3, 24 и 48 ч применяли ЭПО в дозе 5000 МЕ/кг. Микроциркуляцию в спинном мозге (СМ) оценивали с помощью лазерной доплеровской флоуметрии. При экспериментальном СИ в СМ снижается микроциркуляция, количество интактных нейронов, кровеносных сосудов, увеличивается количество нейронов с хроматолизом, клеток-теней, глиальных клеток. При комбинированном применении ЭПО и ЛИ увеличивается микроциркуляции в зоне ишемии СМ как по отношению к контрольной группе, так и к интактным животным; морфологическим субстратом эффектов ЭПО и ЛИ выступают увеличение в СМ количества нормальных нейронов, глиальных клеток, кровеносных сосудов и снижение количества клеток с хроматолизом, клеток-теней. При СИ изменение показателя микроциркуляции ассоциированы с количеством кровеносных сосудов, интактных нейронов, нейронов с хроматолизом, клеток-теней, глиоцитов.
Ключевые слова: спинальный инсульт, морфология спинного мозга, эритропоэтин, лазерное излучение.
Плейотропные эффекты эритропоэтина (ЭПО) являются объектом пристального внимания многих исследователей. Наличие рецепторов к ЭПО на неэритроидных клетках (нейроны, кар-диомиоциты, эндотелиоциты, лейкоциты и др.) позволяет предположить новые эффекты ЭПО [24, 7]. В частности, ЭПО играет большую роль в эмбриональном развитии мозга, восстановлении когнитивной функции и препятствии атрофии
мозга при экспериментальном сотрясении, аутоиммунном энцефаломиелите [70, 275]. В связи с этим, возникает вопрос о нейропротекторном действии ЭПО при ишемических поражениях ЦНС, например, спинальном инсульте (СИ), эффективность терапевтических подходов при котором остается невысокой, поэтому поиск и введение в практику новых подходов лечения является актуальным для практической медицины. В настоя-
—--—
Since 1999
e-ISSN 2226-7417
On line scientific & educational Bulletin "Health and Education Millennium", 2017. Vol. 19. No 5
щее время хорошо изучены биологические эффекты лазерного излучения (ЛИ), в том числе стимуляция неоангиогенеза в облученных тканях при низкоинтенсивном и высокоинтенсивном ЛИ [1]. Цель исследования - изучить морфофункцио-нальные взаимосвязи при комбинированном применении ЭПО и ЛИ при экспериментальном СИ.
Материалы и методы исследования. Проведён эксперимент на 54 нелинейных крысах, которые содержались в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных (ETSIN 123, 18 марта 1986 г.). Для анестезии использован препарат «Золетил-100» (Virbac «Sante Animale», Франция). Все животные случайным образом разделены на 3 группы: группа 1 (n=6) -интактные (контроль), группа 2 (n=24) - с СИ, который моделировали тотальной интравазальной окклюзией брюшной аорты и ее ветвей по методике Суфиановой Г.З. и соавт. [5], группа 3 (n=24) - с СИ, которым через 2 ч от индукции СИ проводили накожное облучение диодным лазером (длина волны 980 нм в непрерывном режиме, мощность 2 Вт, экспозиция 3 мин) и внутрибрю-шинно вводили ЭПО («Эпокрин», ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург) в дозе 5000 МЕ/кг через 3, 24 и 48 ч от индукции СИ. Исследования проводили на 3, 7, 14 и 30 сутки. Микроциркуляцию в интактных и ишеми-зированных тканях поясничного отдела спинного мозга (СМ) оценивали после вскрытия позвоночника с помощью лазерной доплеровской фло-уметрии на приборе «ЛАКК-01» (Россия) с комплектом программ ООО «Лазма» (Россия) и расчетом показателя микроциркуляции (ПМ в перфу-зионных единицах (пф. ед.)), который является функцией от усредненной скорости эритроцитов и их концентрации в зондируемом объеме тканей, зависящей от гематокрита и количества функционирующих сосудов. Срезы СМ окрашивали гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии, по методу Бильшовского - для выявления ми-елиновых волокон, по методу Ниссля - для верификации тигроидного вещества Ниссля, глиаль-
ных клеток. Морфологические исследования выполнены на микроскопе «Leica DMRXA» (Germany) с помощью программы анализа изображений «ДиаМорф Cito-W» (Россия); оценивали количество неизменённых нейронов; нейронов с хроматолизом; клеток-теней; глиоцитов; мелких кровеносных сосудов. Результаты обрабатывали с помощью пакета программ Statistica 6.0 («S^SoM^.», USA). Значимость различий в группах оценивали с помощью критериев Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса, связь между признаками - коэффициента корреляции Спирмена.
Результаты исследования и их обсуждение. Результаты морфометрической оценки препаратов и микроциркуляции поясничного утолщения спинного мозга при СИ представлены в табл. 1. На 3 сутки в передних рогах СМ наблюдались выраженные изменения: хроматолиз цитоплазмы, пикноз ядер, растворение глыбок базо-фильного вещества Ниссля в нейронах с превращением их в клетки-тени, встречались неизмененные и гиперхромные нейроны, отмечалась нейро-нофагия, перицеллюлярный и периваскулярный отек в белом веществе. К 7 суткам в центральной зоне ишемического очага количество нормальных нейронов прогрессивно уменьшалось, на 14 и 30 сутки СИ - значимо увеличивалось, но было ниже, чем в контрольной группе. Число нейронов с хроматолизом, клеток-теней значительно увеличивалось в динамике на всех сроках эксперимента. Представительство глиальных клеток, капилляров и артериол было низким на всех сроках СИ, значимо возрастало начиная с 7 суток эксперимента. Оценка кровоснабжения выявила, что ПМ в тканях СМ статистически значимо снижался во все сроки наблюдения по сравнению с контрольной группой: на 3 и 5 сутки СИ более чем в 2 раза и незначительно возрастал на 14 и 30 сутки. В условиях комбинированного применения ЭПО и ЛИ при СИ в СМ уже на 3 сутки отмечена сохранность нейронов (табл. 1). Так, количество нормальных нейронов в СМ было более чем в два раза выше по сравнению с группой животных с СИ. На 14 и 30 сутки сохранялось увеличение
The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2017. Vol. 19. No 5
—--—
числа интактных нейронов, отмечалось отсутствие глиосоединительных рубцов, что свидетельствовало о слабо выраженных ишемических повреждениях, без формирования зоны некроза в тканях СМ. Клеточные элементы спинного мозга выглядели более сохранными. Со стороны микро-циркуляторного русла отмечалась выраженная пролиферативная реакция, количество кровеносных сосудов статистически значимо увеличивалось при сравнении со второй группой животных на всех сроках эксперимента, а к 30 суткам наблюдения увеличилось в среднем в 2 раза и достигло значений в группе интактных животных. Последний факт нашел отражение в ПМ в поясничном отделе СМ, который был значимо выше на всех сроках наблюдения по сравнению с группой 2, а на 3, 7, 14 сутки - превышал значения ПМ в группе интактных животных.
Полагаем, что обнаруженный нейропротек-торный эффект комбинированного применения ЭПО и ЛИ является многофакторным. В частности у ЭПО он реализуется за счет препятствия апоптозу нейронов и глиоцитов в условиях гипоксии, стимуляции функции нейронов, улучшения их жизнеспособности через активацию Са-кана-лов и высвобождение нейромедиаторов [6]. ЭПО является антагонистом глутамата, регулирует продукцию нейромедиаторов, увеличивает активность антиоксидантных ферментов, тормозит N0-зависимые свободнорадикальные процессы, стимулирует неоангиогенез, действуя на рецепторы в церебральных сосудах, регулирует созревание и дифференцировку олигодендроглии и пролиферацию астроцитов. Механизм активации неоангио-генеза после лазерного воздействия на ткани связан с повышением экспрессии в тканях фактора роста сосудистого эндотелия - VEGF [1].
При проведении корреляционного анализа установлено, что при СИ количество нормальных нейронов в СМ на 3, 7, 30 сутки наблюдения снижается по мере падения ПМ в поясничном отделе СМ (табл. 2). Количество нейронов с хроматолизом увеличивается по мере снижения ПМ на 3 и 7
сутки СИ, аналогичная зависимость наблюдается между ПМ и количеством клеток-теней на 7 сутки, ПМ и количеством глиальных клеток на 7, 14, 30 сутки СИ. Показательно, что при СИ на 3, 7, 14 и 30 сутки снижение ПМ происходит по мере снижения количества кровеносных сосудов в СМ. В условиях комбинированного применения ЭПО и ЛИ при СИ обнаружена ассоциация между ПМ и количеством кровеносных сосудов и нормальных нейронов в СМ на 3, 7, 14, 30 сутки эксперимента, количеством глиальных клеток на 3 и 14 сутки, количеством нейронов с хроматолизом - на 14 сутки, количеством клеток-теней - на 14, 30 сутки.
Выводы.
1. При экспериментальном СИ в тканях СМ на 3, 7, 14, 30 сутки снижается микроциркуляция, уменьшается представительство нормальных нейронов, кровеносных сосудов, глиальных клеток, увеличивается количество нейронов с хроматолизом, клеток-теней.
2. Комбинированное применении ЭПО в суммарной дозе 15000 МЕ/кг и ЛИ с длиной волны 980 нм приводит к увеличению микроциркуляции в зоне ишемии СМ как по отношению к контрольной группе, так и к интактным животным; морфологическим субстратом эффектов ЭПО и ЛИ выступают увеличение в СМ количества нормальных нейронов, глиальных клеток, кровеносных сосудов и снижение количества клеток с хроматолизом, клеток-теней.
3. При СИ снижение ПМ происходит по мере снижения количества кровеносных сосудов, интактных нейронов, увеличение ПМ - по мере увеличения представительства нейронов с хроматолизом, клеток-теней, глиоцитов; при СИ на фоне комбинированного применения ЭПО и ЛИ увеличение ПМ также ассоциировано с количеством кровеносных сосудов, интактных нейронов, нейронов с хроматолизом, клеток-теней, глиоцитов.
—---
Таблица 1.
Влияние комбинированного применения ЭПО и ЛИ на микроциркуляцию и морфометрические показатели в поясничном отделе СМ при СИ (М±m)
Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3
3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
ПМ, пф. ед. 4,3 ±0,3 2,1±0,3 * 2,3±0,3 * 2,5±0,2 * 3,1±0,2 * 7,5±0,5 *# 6,9±0,4 *# 5,6±0,4 # 4,5±0,3 #
НН, кол-во 104,3 ±2,1 30,2±2,1 * 24,3±1,1 * 27,8±1,3 * 29,9±2,5 * 80,3±1,8 *# 88,2±1,1 *# 95,4±2,3 *# 99,1±2,2 #
НХ, кол-во 4,3 ±0,3 29,3±0,6 * 36,4±0,9 * 43,6±2,1 * 53,8±1,2 * 14,2±0,8 *# 12,1±0,5 *# 10,1±0,3 *# 7,0±0,2 *#
КТ, кол-во 1,2 ±0,4 36,2±2,3 * 58,1±2,5 * 63,8±2,8 * 67,9±2,2 * 9,3±0,1 *# 6,2±0,2 *# 5,2±0,4 *# 2,1±0,3 #
ГК, кол-во 192,3 ±4,2 92,3±1,9 * 115,5±2,1 * 123,4±2,2 * 112,2±1,9 * 138,8±2,5 *# 150,1±3,1 *# 167,9±3,4 *# 179,9±4,1 #
КС, кол-во 38,2 ±1,2 4,3±0,2 * 6,2±0,4 * 8,1±0,7 * 10,2±0,6 * 16,7±0,5 *# 24,8±0,4 *# 33,9±0,7 *# 34,7±0,6 #
Примечание: НН- нормальные нейроны, НХ - нейроны с хроматолизом, КТ- клетки-тени, ГК- глиальные клетки, КС - кровеносные сосуды; * - р<0,05 при сравнении с группой 1, # - при сравнении с группой 2.
Таблица 2.
Корреляция между показателями морфометрии и микроциркуляции
Показатели Показатель микроциркуляции, пф. ед.
3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
Кол-во нормальных нейронов R=0,46 R=0,37 R=0,54 R=0,77 R=0,43 R=0,86 R=0,87 R=0,48
Кол-во нейронов с хроматолизом R=-0,74 R=-0,15 R=-0,49 R=-0,31 R=-0,34 R=-0,54 R=-0,39 R=-0,29
Кол-во клеток-теней R=-0,29 R=-0,32 R=-0,57 R=-0,20 R=-0,37 R=-0,43 R=-0,35 R=-0,89
Кол-во глиальных клеток R=-0,11 R=0,94 R=-0,77 R=0,20 R=-0,54 R=0,60 R=-0,81 R=0,43
Кол-во кровеносных сосудов R=0,46 R=0,86 R=0,50 R=0,52 R=0,60 R=0,57 R=0,55 R=0,83
Примечание. В таблице приведены значения коэффициента корреляции Спирмена (Я): в числителе - в группе 2, в знаменателе - в группе 3. Полужирным шрифтом выделена статистически значимая (р<0,05) связь.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
—---
The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2017. Vol. 19. No 5
—--—
[1] Головнева, Е.С. Механизм универсальной активации неоангиогенеза после воздействия высокоинтенсивного лазерного излучения на ишемизиро-ванные ткани / Е.С. Головнева // Вест. новых мед. технологий. - 2003. - Т. 10, N 1-2. - С. 15-17.
[2] Осиков М.В., Патофизиологический анализ влияния эритропоэтина на психологический статус у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, К.В. Ахматов, Л.В. Кривохижина // Человек. Спорт. Медицина. - 2010. - № 19 (195). - С. 110116.
[3] Осиков М.В., Плейотропные эффекты эритропоэ-тина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.Ф. Телешева, А.А. Федосов, Ю.И. Агеев, Л.Г. Суровяткина // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 7-1. - С. 218-224.
[4] Осиков М.В., Влияние эритропоэтина на процессы свободнорадикального окисления и экспрессию гликопротеинов в тромбоцитах при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157, № 1. - С. 30-33.
[5] Суфианова Г.З., Шапкин А.Г. Повреждение нервной ткани: механизмы, модели, методы оценки. М.: Издательство РАМН, 2014. 288 с.
[6] Kim, M.S. The neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin via an antiapoptotic mechanism on hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats / M.S. Kim, Y.K. Seo, H.J. Park // Korean J. Pe-diatr. - 2010. - Vol. 53, № 10. - P. 898-908.
[7] Lombardero M., Kovaes K., Schethauer B.W. Erythropoietin: a hormone with multiple function. // Patho-biology - 2011. - Vol.78. - P. 41-53.
COMBINED USE OF ERYTHROPOIETIN AND LASER RADIATION IN EXPERIMENTAL SPINAL STROKE: MORPHOLOGICAL AND FUNCTIONAL RELATIONSHIPS
Osikov M.V., Volodchenko A.M., Giniatullin R.U., Fedosov A.A.
South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation.
Annotation: The aim of this work was to study the morphofunctional relationships in the combined use of erythropoietin (EPO) and laser irradiation (LR) in experimental spinal stroke (SS) is implemented on the nonlinear 54 rats , SS was modeled intravasal total occlusion of the abdominal aorta and its branches, after 2 h LR carried out cutaneous diode laser (wavelength 980 nm) after 3, 24 and 48 hours, EPO was used at a dose of 5000 IU/kg. Microcirculation in the spinal cord (SC) was assessed using laser Doppler flowmetry. At the experimental SS in SC reduced microcirculation, the number of intact neurons, blood vessels, increasing the number of neurons with chromolysis, cell shades, glial cells. The combined use of EPO and LR increases microcirculation in the ischemic zone SC as against the control group and the intact animal; the morphological substrate of the effects of EPO and LR are the increase in SC number of normal neurons, glial cells, blood vessels and decreasing the number of cells chromolysis, cell shadows. In SS index of microcirculation associated with quantity of blood vessels, intact neurons, neurons with chromolysis, cell shades, gliocytes. Key words: spinal stroke, spinal cord morphology, erythropoietin, laser radiation
REFERENCES
[1] Golovneva, E.S. Mehanizm universalnoy aktivatsii neoangiogeneza posle vozdeystviya vyisokointen-sivnogo lazernogo izlucheniya na ishemizirovannyie
tkani / E.S. Golovneva // Vest. novyih med. tehnologiy. - 2003. - T. 10, N 1-2. - S. 15-17. [2] Osikov M.V., Patofiziologicheskiy analiz vliyaniya eritropoetina na psihologicheskiy status u bolnyih hronicheskoy pochechnoy nedostatochnostyu, na-hodyaschihsya na gemodialize / M.V. Osikov, K.V. Ahmatov, L.V. Krivohizhina // Chelovek. Sport. Meditsina. - 2010. - # 19 (195). - S. 110-116.
[3] Osikov M.V., Pleyotropnyie effektyi eritropoetina pri hronicheskoy pochechnoy nedostatochnosti / M.V. Osikov, V.Yu. Ahmatov, L.F. Telesheva, A.A. Fedo-sov, Yu.I. Ageev, L.G. Surovyatkina // Fundamental-nyie issledovaniya. - 2013. - # 7-1. - S. 218-224.
[4] Osikov M.V., Vliyanie eritropoetina na protsessyi svobodnoradikalnogo okisleniya i ekspressiyu glikoproteinov v trombotsitah pri hronicheskoy pochechnoy nedostatochnosti / M.V. Osikov // Byulleten eksperimentalnoy biologii i meditsinyi. -2014. - T. 157, # 1. - S. 30-33.
[5] Sufianova G.Z., Shapkin A.G. Povrezhdenie nervnoy tkani: mehanizmyi, modeli, metodyi otsenki. M.: Iz-datelstvo RAMN, 2014. 288 s.
[6] Kim, M.S. The neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin via an antiapoptotic mechanism on hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats / M.S. Kim, Y.K. Seo, H.J. Park // Korean J. Pe-diatr. - 2010. - Vol. 53, # 10. - P. 898-908.
[7] Lombardero M., Kovaes K., Schethauer B.W. Erythropoietin: a hormone with multiple function. // Patho-biology - 2011. - Vol.78. - P. 41-53.
—--—
