CC BY
36
УДК 616.831-005.4-085.357-085.849.19
ОЦЕНКА НЕВРОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА И МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА В УСЛОВИЯХ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Осиков1 М.В., Гиниатуллин2Р.У., Кузьмин1 А.Н.
ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», г. Челябинск, Российская Федерация. 2ГБУЗ «Многопрофильный центр лазерной медицины», г. Челябинск, Российская Федерация.
Аннотация. Цель работы - в экспериментальных условиях in vivo оценить комбинированное воздействие эритропоэтина (ЭПО) и лазерного излучения (ЛИ) на неврологический статус и микроциркуляцию при ишемии коры головного мозга (ИКГМ). ИКГМ моделировали у крыс диатермокоагуляцией пиальных сосудов в проекции сагиттального шва между лобно-теменным и теменно-затылочным швами. Через 2 часа после индукции ИКГМ проводили облучение области ишемии диодным лазером (длина волны 970 нм) в течение 2 мин; через 3, 24 и 48 ч вводили ЭПО в дозе 5000 МЕ/кг. Неврологический статус животных оценивали по шкале Garcia J. H. Микроциркуляцию в тканях коры головного мозга определяли с помощью лазерной допплеровской флуориметрии. Установлено, что при экспериментальной ИКГМ на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения развивается неврологический дефицит в виде двигательных, чувствительных и стато-координаторных расстройств, на 7, 14 и 30 сутки снижается микроциркуляция в области ишемии. Комбинированное однократное применение ЛИ области ишемии коры головного мозга и ЭПО приводит к частичному восстановлению неврологического статуса у животных на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения, а также полному восстановлению микроциркуляции в области ишемии головного мозга на 7, 14 и 30 сутки.
Ключевые слова: ишемия головного мозга, эритропоэтин, лазерное излучение.
В настоящее время в мире отмечается неуклонный рост числа больных с ишемическим инсультом. На долю ишемического инсульта приходится до 85% от всех случаев инсульта, в 2013 г. в мире зафиксировано 6,9 миллионов случаев ишемического инсульта. Основным методом специфической терапии ишемического инсульта являются адекватная и своевременная реперфузионная терапия, немаловажная роль уделяется нейропротекторной терапии. Постоянно разрабатываются новые средства, оказывающие нейропротек-тоное воздействие на пораженные структуры ЦНС. В этом отношении обращает на себя внимание эндогенные регуляторы гомеостаза, например, эритропоэтин (ЭПО), который не только регулирует эритропоэз, но и обладает рядом плейотропных свойств, в том числе нейротропными. Стимулами для продукции ЭПО выступают гипоксия, активные формы кислорода, инсулин, инсулиноподобный фактор роста, ИЛ-1, ИЛ-6, ТНФ-а, 17в-эстрадиол и др. [1]. Структура рецептора ЭПО на неэритроидных клетках (защищающие ткань рецепторы) отличается от рецептора ЭПО на клетках-предшественницах эритроцитов, а для его активации требуются наномолярные концентрации ЭПО, что снижает вероятность перекрестных эффектов ЭПО. Ранее
нами продемонстрировано влияние ЭПО на аффективный статус, психофизиологический статус, функциональное состояние вегетативной нервной системы, иммунный статус, гемостаз при хронической почечной недостаточности в клинических и экспериментальных условиях [2,3,4]. Повышение содержания ЭПО в ам-ниотической жидкости при гипоксии плода, преэк-лампсии и у беременных женщин с сахарным диабетом оказывает нейропротекторный эффект, снижает повреждение клеток сетчатки у плода [5]. ЭПО играет роль в эмбриональном развитии мозга, у эмбрионов животных с дефицитом ЭПО наблюдается гипоплазия мозга за счет апоптоза нейронов [6]. Введение ЭПО способствует восстановлению когнитивной функции и препятствует атрофии мозга при экспериментальном сотрясении мозга, экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите. В ряде экспериментальных работ показано, что действие лазерного излучения (ЛИ) на ткани способствует неоангиогенезу [7]. В зонах, подвергшихся воздействию ЛИ, увеличивается экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), что приводит к восстановлению перфузии тканей, в том числе при ишемии головного мозга [8, 9] В связи с вышеска-
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
занным, изучение нейротропных эффектов комбинированного применения ЭПО и ЛИ представляется актуальным и перспективным в клиническом плане. Цель работы - в экспериментальных условиях in vivo оценить комбинированное воздействие ЭПО и ЛИ на неврологический статус и микроциркуляцию при ишемии коры головного мозга (ИКГМ).
Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 70 нелинейных половозрелых крысах обоего пола массой 220-250 г. под общей анестезией препаратом «Золетил» (Virbac «Sante Animale», Франция; 20 мг/кг). Все животные были разделены на 3 группы: 1 группа - ложнооперированные животные; 2 группа - модель ИКГМ, 3 группа - животные с ИКГМ, у которых применяли ЭПО и ЛИ. Животным 2 группы под общей анестезией разрезали мягкие ткани головы в проекции сагиттального шва в промежутке между лобно-теменным и теменно-затылочным швами, кость скелетировали, формировали трепана-ционное отверстие до 7 мм в диаметре, твердую мозговую оболочку вскрывали крестообразно. С помощью электродов под оптическим увеличением (х 3,5) производили диатермокоагуляцию пиальных сосудов поверхности коры по периметру трепанационного отверстия. Животным 1 группы проводили оперативное вмешательство без диатермокоагуляции сосудов. Животным 3 группы через 2 ч после ИКГМ проводили дистанционное (2-3 см от поверхности) накожное облучение области ишемического очага в непрерывном режиме диодным лазером «ИРЭ-ПОЛЮС» (Россия) с длиной волны 970 нм через моноволоконный световод 0,6 мм мощностью 1 Вт, экспозиция 2 минуты. Через 3, 24 и 48 ч после моделирования ИКГМ внут-рибрюшинно вводили ЭПО («Эпокрин», ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург) из расчета 5000 МЕ/кг. Исследования выполнены на 1, 7, 14, 30 сутки. Неврологический статус животных оценивали по шкале Garcia J. H. [10] по следующим параметрам: 1) спонтанная активность в клетке за 5 мин; 2) симметричность вытягивания передних конечностей; 3) симметричность движений; 4) способность забираться по стенке проволочной клетки; 5) реакция на прикосновение к каждой стороне туловища; 6) ответ на прикосновение к вибриссам. Для оценки микроциркуляции применялся прибор «ЛАКК-01» (Россия) на основе инфракрасного лазера, показатели снимали через трепанационное отверстие с помощью датчика в течение 5 мин. Определялся показатель микроциркуляции (ПМ в относительных перфузионных единицах (пф.ед.)), который является функцией от усредненной скорости эритроцитов (V ср) и концентрации эритроцитов в зондируемом объеме тканей (N эр.), зависящей от показателя гематокрита и количества функционирующих сосудов. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ «SPSS Statistics 19». Показатели представлены в виде
медианы (Ме) и квартилей Значимость разли-
чий оценивали при помощи критериев Крускалла-Уо-лиса, Манна-Уитни, Фридмана и парного критерия Вилкоксона.
Результаты исследования. В группе ложноопери-рованных животных не наблюдается значимых отличий показателя неврологического статуса между 1, 3, 7, 14 и 30 сутками наблюдений (табл. 1). В группе животных с ИКГМ на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки зарегистрированы поведенческие нарушения и очаговый неврологический дефицит в виде двигательных, чувствительных и стато-координаторных расстройств, которые не полностью регрессируют к 30 суткам эксперимента. Отмечены правосторонний гемипарез, атаксия, сопровождавшиеся гиподинамией, заторможенностью, отказом от приема пищи и воды. Обнаружены значимые отличия показателя неврологического статуса у животных с ИКГМ на 7 сутки по сравнению с 1 сутками, на 14 сутки по сравнению с 1 и 3 сутками, на 30 сутки по сравнению с 1, 3 и 7 сутками. В группе ИКГМ отмечается снижение ПМ на 7, 14, 30 сутки по сравнению с группой ложнооперированных (табл. 2). Не обнаружено значимых отличий ПМ на 7 сутки по сравнению с 14 и 30 сутками и на 14 сутки по сравнению с 30 сутками ИКГМ. Зафиксированные неврологические изменения при ИКГМ обусловлены ограничением кровоснабжения поверхности коры головного мозга в сенсо-моторной зоне.
Комбинированное применение ЭПО и ЛИ приводит к увеличению показателя неврологического статуса во все сроки наблюдения по сравнению с группой животных с ИКГМ. Уже через 2-3 часа после однократного введения ЭПО и ЛИ улучшались поведенческие реакции и неврологические функции, животные активно пили воду и принимали пищу. Показатель неврологического статуса на 3 и 7 сутки значимо отличался от 1 суток, на 14 и 30 сутки - от 1 и 3 суток ИКГМ на фоне комбинированного применения ЭПО и ЛИ. Показатель неврологического статуса у крыс с ИКГМ на фоне применения ЭПО и ЛИ значимо отличался и от группы ложнооперированных, что позволяет говорить только о частичном восстановлении неврологического статуса. ПМ в группе крыс с ИКГМ на фоне комбинированного применения ЭПО и ЛИ повышается на 7, 14 и 30, отличий показателя на 7 сутки по сравнению с 14 и 30 сутками и на 14 сутки по сравнению с 30 сутками не обнаружено. На 7 сутки отмечено значимое увеличение ПМ у животных с ИКГМ на фоне применения ЭПО и ЛИ по сравнению с группой ложнооперирован-ных [11].
Полагаем, что установленный нейропротекторный эффект комбинированного применения ЭПО и ЛИ при ИГКМ является многофакторным. В частности, действие ЭПО реализуется за счет препятствия апоптозу нейронов в условиях в условиях гистотоксической или
циркуляторной гипоксии [12]. В эксперименте с введением растворимого рецептора к ЭПО животным, подвергшимся ишемии мозга, происходило ухудшение состояния, что указывает на важность эндогенного ЭПО для реализации функциональной активности нейронов [13]. ЭПО обладает способностью активировать функцию и жизнеспособность нейронов через активацию Са-каналов и высвобождение нейромедиаторов, является антагонистом глутамата, регулирует продукцию нейромедиаторов, увеличивает активность антиокси-дантных ферментов, тормозит NO-зависимые свобод-норадикальные процессы, регулирует созревание и дифференцировку олигодендроглии и пролиферацию астроцитов, оказывает антиапоптический эффект на
клетки микроглии [14]. В целом, систему ЭПО - рецептор ЭПО рассматривают как эндогенный механизм, защищающий нейроны от гипоксического повреждения, доказана его защитная роль в процессах ишемического прекондиционирования, а высвобождение ЭПО из аст-роцитов является механизмом, защищающим мозг от апоптоза, индуцированного гипоксией. Кроме этого, ЭПО стимулирует неоангиогенез, действуя на рецепторы в церебральных сосудах [15]. Учитывая, что ЛИ стимулирует неоангиогенез за счет экспрессии VEGF, можно говорить о синергическом эффекте комбинированного применения ЭПО и ЛИ при ИКГМ в отношении восстановления перфузии ишемизированной области.
Таблица 1.
Влияние применения ЭПО и ЛИ на показатель неврологического статуса при экспериментальной
ИКГМ ^ ^1^3])
Группы животных 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
1. Контроль 17 [17,00-18,00] 18 [17,00-18,00] 18 [18,00-18,00] 18 [18,00-18,00] 18 [18,00-18,00]
2. ИКГМ 5 6 9 12 15
[4,00-5,25] [5,00-7,25] [8,00-10,5] [11,0-13,0] [14,0-16,25]
3. ИКГМ+ 8 13 15 16,5 17,5
ЭПО+ЛИ [6,0-9,0] [11,50-14,00] [13,75-16] [15,0-17,0] [16,75-18,0]
Различия по кри- P<0,001 P<0,001 P<0,001 P<0,001 P<0,001
терию Фридмана
Различия по кри- P1-2<0,001 P1-2<0,001 P:-2<0,001 P:-2<0,001 P1-2<0,001
терию Манна- P1-3<0,001 P:-3<0,001 P:-3<0,001 P:-3<0,001 P:-3=0,03
Уитни P2-3<0,001 P2-3<0,001 P2-3<0,001 P2-3<0,001 P2-3=0,003
Таблица 2.
Влияние применения ЭПО и ЛИ на показатель микроциркуляции при экспериментальной
ИКГМ ^ ^1^3])
Группы животных 7 сутки 14 сутки 30 сутки
1. Контроль 5,29 [4,87-6,95] 5,19 [4,57-6,95] 5,21 [4,53-6,95]
2. ИКГМ 2,75 [0,89-3,87] 2,57 [1,36-5,48] 3,77 [2,93-4,38]
3. ИКГМ+ ЭПО+ЛИ 7,86 [6,65-8,78] 6,62 [5,71-7,67] 6,38 [5,77-6,81]
Различия по критерию Крускалла-Уолиса P<0,001 P=0,001 P<0,006
Различия по критерию Манна-Уитни P1-2=0,001 P1-3=0,008 P2-3<0,001 P1-2=0,016 P1-3=0,059 P2-3=0,001 P:-2=0,001 P:-3=0,545 P2-3=0,001
Выводы.
1. Установлено, что при экспериментальной ИКГМ на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения развивается неврологический дефицит в виде двигательных, чувствительных и стато-координаторных расстройств, на 7, 14 и 30 сутки наблюдения снижается микроциркуляция в области ишемии.
2. Комбинированное однократное применение ЛИ области ИКГМ через 2 ч и ЭПО в дозе 5000 МЕ/кг трехкратно через 3, 24 и 48 ч после моделирования ИКГМ приводит к частичному восстановлению неврологического статуса у животных на 1, 3, 7, 14 и 30
сутки наблюдения, а также полному восстановлению микроциркуляции в области ишемии головного мозга на 7, 14 и 30 сутки.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] M. Lombardero, K. Kovacs, B.W. Scheithauer. Erythropoietin: A hormone with multiple functions // Pathobiology. -2011. - Vol. 78. - P. 41-53.
[2] Осиков М.В., Ахматов К.В., Кривохижина Л.В. Патофизиологический анализ влияния эритропоэтина на психологический статус у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе //
Человек. Спорт. Медицина. 2010. № 19 (195). С. 110116.
[3] Осиков М.В., Ахматов В.Ю., Телешева Л.Ф., Федосов А.А., Агеев Ю.И., Суровяткина Л.Г.Плейотропные эффекты эритропоэтина при хронической почечной недостаточности // Фундаментальные исследования. 2013. № 7-1. С. 218-224.
[4] Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на процессы сво-боднорадикального окисления и экспрессию гликопро-теинов в тромбоцитах при хронической почечной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. Т. 157. № 1. С. 30-33.
[5] M.M. Loeliger, A. Mackintosh, R. de Matteo [et al.] Erythropoietin protects the developing retina in an ovine model of endotoxin-induced retinal injury // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2011. - Vol. 52. - P. 2656-2661.
[6] R.J. McPherson, S.E. Juul Erythropoietin for infants with hypoxic-ischemic encephalopathy // Curr. Opin. Pediatr. -2010. - Vol. 22, № 2. - P. 139-145.
[7] Chung H., Dai T., Sharma S.K., Huang Y.Y., Carroll J.D., Hamblin M.R. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy // Ann Biomed Eng. - 2012. - V. 40(2). - P.516-533.
[8] Головнева Е.С., Попов Г.К. Механизмы формирования нового сосудистого русла в ответ на высокоинтенсивное лазерное воздействие // Обоснование применения лазерных технологий в хирургии (экспериментальные исследования с внедрением их в клиническую практику) / Под. ред. А.И. Козеля, Р.У. Гиниатуллина, Е.С. Головневой, Ж.А. Голощаповой. - Челябинск: ООО фирма «Пирс», 2009. - С.125- 165.
[9] Guo H., Zhou H., Lu J., Qu Y., Yu D., Tong Y. Vascular endothelial growth factor: an attractive target in the treatment of hypoxic/ischemic brain injury// Neural Regeneration Research. 2016; 11(1):174-179.
[10] Garcia, J.H. Early reperfusion as a rationale form of therapy in ischemic stroke. // Rev. Neurol. 1995. - Vol. 23, № 123. -pp. 1067-1073.
[11] Кузьмин А.Н., Гиниатуллин Р.У., Козель А.И., Астахова Л.В. Влияние рекомбинантного эритропоэтина и лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона на особенности течения ишемического инсульта у крыс // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2015. - № 4(55). - С. 63-67.
[12] M.S. Kim, Y.K. Seo, H.J. Park The neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin via an antiapoptotic mechanism on hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats // Korean J. Pediatr. - 2010. - Vol. 53, № 10. - P. 898908.
[13] M. Sakanaka, T.C. Wen, S. Matsuda et al. In vivo evidence that erythropoietin protects neurons from ischemic damage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95, № 8. - P. 4635-4640.
[14] M. Sugawa, Y. Sakurai, Y. Ishikawa-Ieda [et al.] Effects of erythropoietin on glial cell development; oligodendrocyte maturation and astrocyte proliferation // Neurosci. Res. -2002. - Vol. 44, № 4. - P. 391-403.
[15] R. Yamaji, T. Okada, M. Moriya et al. Brain capillary endothelial cells express two forms of erythropoietin receptor mRNA // Eur. J. Biochem. - 1996. - Vol. 239, № 2. - P. 494-500.
ASSESSMENT OF NEUROLOGICAL STATUS AND MICROCIRCULATION IN EXPERIMENTAL ISCHEMIA OF THE CEREBRAL CORTEX IN CONDITIONS OF COMBINED USE OF ERYTHROPOIETIN AND LASER RADIATION
Osikov1 M.V., Giniatullin2R.U., Kuzmin1 A.N.
1 South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Fderation.
2 Multidisciplinary Center for Laser Medicine, Chelyabinsk, Russian Federation.
Annotation: The steady increase in number of patients with ischemic brain lesions and the insufficient effectiveness of the therapeutic approaches used are the prerequisites for the search and preclinical evaluation of the effectiveness of new neuroprotective agents and techniques.
The aim of the study was to evaluate the combined effect of erythropoietin (EPO) and laser radiation (LR) on neurological status and microcirculation in cerebral ischemia (CI) under experimental conditions in vivo. The study was performed on 70 nonlinear rats. CI was modeled on rats by diathermocoagulation of the pial vessels in the projection of the sagittal seam between the fronto-parietal and parieto-occipital sutures. Two hours after CI induction, the area of ischemia was irradiated with a diode laser (wavelength 970 nm) for 2 min; After 3, 24 and 48 hours, EPO was administered at a dose of 5000 IU / kg. Neurological status of the animals was assessed according to the Garcia J.H scale. Microcirculation in the tissues of the cerebral cortex was determined using laser Doppler fluorimetry. It was established that at the 1st, 3rd, 7th, 14th and 30th day of the observation, the neurologic deficit develops in the form of motor, sensory and stato-coordinative disorders, microcirculation in the ischemic region decreases on 7, 14 and 30 days. Combined application of the LR and EPO to the cerebral cortex ischemia leads to partial restoration of the neurological status in animals on the 1st, 3rd, 7th, 14th and 30th day of observation, as well as complete recovery of microcirculation in the brain ischemia on the 7th, 14th and 30th days.
Key words: cerebral ischemia, erythropoietin, laser radiation
REFERENCES
[1] M. Lombardero, K. Kovacs, B.W. Scheithauer. Erythropoietin: A hormone with multiple functions // Pathobiology. -2011. - Vol. 78. - P. 41-53.
[2] Osikov M.V., Akhmatov K.V., Krivokhizhina L.V. Pathophysiological analysis of the effect of erythropoietin on psychological status in patients with chronic renal failure who are on hemodialysis // Human. Sport. Medicine. 2010. № 19 (195). Pp. 110-116.
[9] Guo H., Zhou H., Lu J., Qu Y., Yu. D., Tong Y. Vascular endothelial growth factor: an attractive target in the treatment of hypoxic / ischemic brain injury // Neural Regeneration Research. 2016; 11 (1): 174-179.
[10] Garcia, J.H. Early reperfusion as a rational form of therapy in ischemic stroke. // Rev. Neurol. 1995. - Vol. 23, No. 123. - pp. 1067-1073.
[11] Kuzmin A.N., Giniatullin R.U., Kozel A.I., Astakhova L.V. Influence of recombinant erythropoietin and near-infrared laser radiation on the features of ischemic stroke in rats // Bulletin of the Ural Medical Medical Science. - 2015. - No. 4 (55). - P. 63-67.
[12] M.S. Kim, Y.K. Seo, H.J. Park The neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin via an antiapoptotic mechanism on hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats // Korean J. Pediatr. - 2010. - Vol. 53, No. 10. - P. 898908.
[13] M. Sakanaka, T.C. Wen, S. Matsuda et al. In vivo evidence that erythropoietin protects neurons from ischemic damage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95, No. 8. - P. 4635-4640.
[14] M. Sugawa, Y. Sakurai, Y. Ishikawa-Ieda [et al.] Effects of erythropoietin on glial cell development; Oligodendrocyte maturation and astrocyte proliferation // Neurosci. Res. -2002. - Vol. 44, No. 4. - P. 391-403.
[15] R. Yamaji, T. Okada, M. Moriya et al. Brain capillary endothelial cells express two forms of erythropoietin receptor mRNA // Eur. J. Biochem. - 1996. - Vol. 239, No. 2. - P. 494-500.
[3] Osikov M.V., Akhmatov V.Yu., Telesheva L.F., Fedosov A.A., Ageev Yu.I., Surovyatkina L.G. Pleiotropic effects of erythropoietin in chronic renal insufficiency // Fundamental research. 2013. No. 7-1. Pp. 218-224.
[4] Osikov, M.V. Influence of erythropoietin on the processes of free radical oxidation and expression of glycoproteins in platelets in chronic renal failure // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. № 1. P. 30-33.
[5] M.M. Loeliger, A. Mackintosh, R. de Matteo [et al.] Eryth-ropoietin protects the developing retina in an ovine model of endotoxin-induced retinal injury // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2011. - Vol. 52.-P. 2656-2661.
[6] R.J. McPherson, S.E. Juul Erythropoietin for infants with hypoxic-ischemic encephalopathy // Curr. Opin. Pediatr. -2010. - Vol. 22, No. 2. - P. 139-145.
[7] Chung H., Dai T., Sharma S.K., Huang Y.Y., Carroll J.D., Hamblin M.R. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy // Ann Biomed Eng. - 2012. - V. 40 (2). - P.516-533.
[8] Golovneva E.S., Popov G.K. Mechanisms of formation of a new vascular bed in response to high-intensity laser exposure // Justification of the use of laser technologies in surgery (experimental studies with their introduction into clinical practice) / Pod. Ed. A.I. Kozelya, R.U. Giniatullina, E.S. Golovnevoy, Zh.A. Holoschapovoy. - Chelyabinsk: Open Company firm "Pierce", 2009. - C.125-165.
