CC BY
74
УДК 616.832:599.323.3
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ
В ИШЕМИЗИРОВАННОМ СПИННОМ МОЗГЕ КРЫС
ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА
Р.У. Гиниатуллин, А.М. Володченко, А.И. Козель, Г.К. Попов, Л.В. Астахова
Результаты морфометрического исследования препаратов спинного мозга показали, что при применении рекомбинантного эритропоэтина увеличивалось содержание нормальных нейронов и кровеносных сосудов, а число нейронов с хроматолизом, клеток-теней уменьшалось на всех сроках экспериментов по сравнению с 1-й серией опыта. У всех животных, которым вводился рекомбинантный эритропоэтин, наблюдалась ранняя активизация поведения. Через 36 ч после моделирования ишемии спинного мозга и в последующие сроки наблюдения у них отсутствовали неврологические расстройства и они активно обращались к пище и воде.
Ключевые слова: спинной мозг; экспериментальная ишемия; патоморфологические и функциональные нарушения; рекомбинантный эритропоэтин.
Введение. Рядом авторов показано, что развитие некроза в зоне ишемии спинного мозга (СМ) можно избежать с помощью реперфузии и применения нейропротективных препаратов, в частности под воздействием альфа-вРС, церебролизина, пи-роцетама, винпоцетина [1]. В то же время эффективность нейромедиаторной терапии ишемических повреждений ЦНС после введения указанных препаратов является различной и остаётся невысокой, что диктует необходимость поиска новых методов лечения данной патологии.
В связи с этим, в последние годы большой интерес вызывает рекомбинантный эритропоэтин (РЭП), как средство базисной терапии хронической почечной недостаточности, плейотропные эффекты которого являются объектом пристального внимания исследователей различных специальностей. В частности, установлены нейропротек-торные свойства рекомбинантного эритропоэтина, связанные с антиапоптотическим и антигипокси-ческим действиями [4, 6-8]. Показано, что плейо-тропные эффекты РЭП реализуются за счёт наличия специфических рецепторов на различных клетках, в том числе на нейронах [5]. Поэтому выяснение возможной патогенетической роли РЭП в коррекции ишемических нарушений в СМ представляется весьма перспективным и актуальным исследованием.
Цель работы: исследование динамики патоморфологических и функциональных изменений в ишемизированной области СМ крыс под воздействием РЭП.
Материалы и методы. Работа выполнена на 40 беспородных половозрелых крысах обоего пола линии «Вистар» массой 220-250 г. Животные содержались в условиях вивария, регламентируемых приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.09.1977 г. и № 701 от 27.07.1978 г. об обеспечении принципов гуманного обращения
с животными. Все оперативные вмешательства проводились в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики под внутримышечным обезболиванием препаратом золитил (2 мг/кг массы тела животного). Выведение животных из эксперимента осуществлялось путём внутрисердечного введения 3 мл 7,5 % раствора хлористого калия. Все животные были разделены на 2 серии опытов.
В первой серии экспериментов на 20 животных (группа сравнения) моделировали ишемию СМ по методике, предложенной Г.З. Суфиановой и др. [3]. Транзиторную ишемию поясничного отдела СМ создавали путём тотальной интравазаль-ной окклюзии и последующим клипированием бедренных артерий. С этой целью в обе бедренные артерии по направлению к сердцу вводили окклю-деры (стерильную нить из хромированного кетгута 3.0), глубину введения которых определяли расстоянием от мечевидного отростка до основания хвоста. Через 45 мин окклюдеры извлекали, а бедренные артерии затем клипировали. Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.
Во второй серии эксперимента на 20 животных моделировали ишемию СМ, по методике описанной выше (1-я серия эксперимента). Через 3 ч после операции каждому животному вводили внутрибрюшинно 1000 МЕ РЭП («ЭПОКРИН 2000 МЕ») из расчёта 5000 МЕ на 1 кг массы тела животного по международному протоколу. Затем введение препарата повторяли через 24 и 48 ч по 1000 МЕ после создания ишемии. Выведение животных из опыта осуществляли на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.
После выведения животных из экспериментов СМ извлекали и фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах
с возрастающей концентрацией и заливали в парафины. С парафиновых блоков готовили серийные фронтальные срезы толщиной 3-5 мкм. Серийные срезы СМ окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Бильшовского для выявления миелино-вых волокон, по методу Ниссля для верификации-тигроидного вещества Ниссля, глиальных клеток. Морфометрические исследования проводили с помощью компьютерной программы анализа цветового изображения «ДиаМорфСИо^» (Россия) при увеличении микроскопа х 400 в десяти случайно отобранных полях зрения. Подсчитывали на условной единице площади количество нормальных нейронов, нейронов с хроматолизом, клеток-теней, мелких кровеносных сосудов (капилляров, арте-риол).
Количественную оценку состояния и поведения животных проводили по интегральному показателю в баллах (табл. 1), предложенному С.С. Пашиным и И.В. Викторовым [2].
Полученные результаты обрабатывали с помощью лицензионного пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoftIns, USA). Применялись методы вариационной статистики. Статистическая значимость различий сравниваемых признаков в группах оценивалась с использованием непараметрического U-теста Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне P < 0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. При гистологическом исследовании препаратов поясничного утолщения СМ у крыс 1-й серии опытов на третьи сутки наиболее выраженные изменения отмечались в передних рогах - хроматолиз цитоплазмы, пикноз ядер, растворение глы-бокбазофильного вещества Ниссля в нейронах с превращением их в клетки-тени. Встречались неизменённые и гиперхромные нейроны, отмечалась нейронофагия, перицеллюлярный и периваскуляр-ный отёк в белом веществе.
Морфологические изменения в тканях СМ на
7, 14, 30-е сутки опытов были сходными. В центральной зоне ишемического очага определялись деструктивные изменения в нейронах, а в перифо-кальной зоне отмечались также неповреждённые нейроны. Увеличивалось содержание астроцитов
с признаками их гипертрофии, наблюдалась активизация микроглии, появлялись макрофаги.
Результаты количественного исследования препаратов СМ показали, что число нормальных нейронов на 7-е сут опыта существенно уменьшилось, а нейронов с хроматолизом, клеток-теней и глиальных клеток - увеличилось по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. На 14-е сут количество нормальных нейронов, а также содержание глиальных клеток и кровеносных сосудов на 30-е сут достоверно увеличилось по отношению к предыдущим срокам эксперимента (табл. 2).
При исследовании гистологических препаратов СМ животных на 3-и и 7-е сут опыта, а также в последующие сроки наблюдения (14-е, 30-е сут) отмечалась хорошая сохранность нейронов, среди
которых встречались отдельные гиперхромные клетки и лишь единичные были с признаками набухания и сморщивания. Определялась активная пролиферация глиоцитов и эндотелиоцитов капилляров, артериол. Это свидетельствовало о слабо выраженных ишемических повреждениях, без формирования зоны некроза в тканях СМ.
Результаты морфометрического исследования препаратов СМ показали (табл. 2), что содержание нормальных нейронов, в зависимости от предыдущих сроков наблюдения увеличивалось незначительно, за исключением 7-х сут, а число нейронов с хроматолизом на 7, 14, 30-е сут существенно уменьшалось. Наряду с этим, число клеток-теней достоверно уменьшалось, начиная с 7-х сут. Коли-чествоглальных клеток и кровеносных сосудов значительно увеличивалось на 7-е и 30-е сут. Кроме того, содержание нормальных нейронов, глиальных клеток и кровеносных сосудов было значительно больше, а число нейронов с хроматолизом и клеток-теней - меньше на всех сроках экспериментов по сравнению с 1-й серией опыта (группа сравнения).
Результаты исследования показали, что ишемическое повреждение поясничного утолщения СМ приводит к выраженным нарушениям моторных функций, о чем наглядно свидетельствует динамика изменений интегрального показателя поведенческих реакций в разные сроки наблюдения
Таблица 1
Шкала оценки поведенческих реакций у крыс по интегральному показателю в баллах [2]
Критерий оценки Балл
Отсутствие двигательной активности и рефлекса позы 0
Отсутствие двигательной активности и реакции на раздражитель задних конечностей и хвоста, но сохранение
рефлекса позы 1
Двигательная активность только за счет передних конечностей, слабая реакция на раздражитель задних
конечностей и хвоста 2
Имитация восстановления функции одной из задних конечностей 3
Имитация восстановления функции обеих конечностей 4
Восстановление функции задних конечностей, но сниженная реакция на тепловой раздражитель (более 8 с) 5
Восстановление скорости реакции на тепловой раздражитель (8 с и менее) 6
Проблемы здравоохранения
Таблица 2
Динамика количественных изменений клеточных элементов и мелких кровеносных сосудов в ишемизированных тканях СМ крыс 1-и и 2-й серий опытов (на условной единице площади М ± 1те)
Исследованный Серия опыта Срок наблюдения (сут)
показатель 3-и 7-е 14-е 30-е
Количество
нормальных нейронов 1-я 2-я 30.2 ± 2,1 69.3 ± 3,1** 24,3 ± 1,1* 81,8 ± 2,8*,** 27,8 ± 1,3* 87,7 ± 2,5** 29,9 ± 2,5 90,8 ± 3,5**
Число нейронов 1-я 29,3 ± 0,6 36,4 ± 0,9* 43,6 ± 2,1* 53,8 ± 1,2*
с хроматолизом 2-я 25,2 ± 0,4** 20,1 ± 0,8*,** 17,1 ± 0,5*,** 12,2 ± 0,3*,**
Число 1-я 36,2 ± 2,3 58,1 ± 2,5* 63,8 ± 2,8 67,9 ± 2,2
клеток-теней 2-я 15,2 ± 0,3** 10,1 ± 0,2*,** 8,3 ± 0,4*,** 3,8 ± 0,5*,**
Количество 1-я 92,3 ± 1,9 115,5 ± 2,1* 123,4 ± 2,2* 112,2 ± 1,9*
глиальных клеток 2-я 124,7 ± 2,2** 135,8 ± 3,2*,** 143,9 ± 3,1** 156,8 ± 3,4*,**
Количество 1-я 2-я
мелких кровеносных сосудов 4,3 ± 0,2 7,9 ± 0,1** 6,2 ± 0,4 11,9 ± 0,2*,** 8,1 ± 0,7 16,8 ± 0,5*,** 10,2 ± 0,6* 17,3 ± 0,3**
Примечание. 1-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга (группа сравнения); 2-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга, леченная РЭП; * - р < 0,05 по сравнению с предыдущим сроком опыта в каждой серии; ** - р < 0,05 по отношению к 1-й серии опыта.
(табл. 3). В то же время применение РЭП способствует достоверному увеличению интегрального показателя.
Таблица 3
Динамика изменений интегрального показателя поведенческих реакций в первой и второй группах опытов (М ± 1^
Примечание. 1-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга (группа сравнения); 2-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга, леченная РЭП; * - р < 0,05 по сравнению с 1-й серией опыта.
Таким образом, результаты проведенного экспериментального исследования показали, что использование для лечения ишемических поражений спинного мозга РЭП увеличивает толерантность нейронов к гипоксическому повреждению. Данные изменения можно объяснить тем, что РЭП обладает антиапоптотическим и антигипоксическим действием, стимулирует ангио- и нейрогенез [4, 6-8].
Заключение. Результаты исследования свидетельствуют, что применение РЭП, как одного из способов лечения экспериментальной ишемии спинного мозга у крыс, способствует на ранних сроках наблюдения значительному предотвращению деструктивных изменений в нейронах, усиливает пролиферацию глиоцитов, эндотелиоцитов сосудов с образованием нового кровеносного русла. Это сопровождается в динамике наблюдения более ранним регрессом неврологических расстройств, восстановлением поведенческих реакций у животных.
Литература
1. Онищенко, Л.С. Изменения в очаге экспериментального ишемического инсульта под воздействием нейротропных препаратов / Л. С. Онищенко, О.Н. Гайкова, С.Н. Янишевский // Морфология. - 2006. - № 6. - С. 40-46.
2. Пашин, С.С. Морфофункциональные изменения в спинном мозге крыс после фокального флеботромбоза / С. С. Пашин, И.В. Викторов // Морфология. - 2008. - Т. 133, № 1. - С. 35-38.
3. Суфианова, Г.З. Новая малоинвазивная модель ишемии спинного мозга у крыс / Г.З. Суфианова, Л.А. Усов, А.А. Суфиано // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - Т. 133, № 1. -С. 116-120.
4. Celik, M. Erythropoietin prevents motor neuron apoptosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury /M. Celik, N. Gokmen, S. Erbayraktar // Proc Natl Acad Sci USA. - 2002. -Vol. 99. - Р. 2258-2263.
5. Masuda, S. Functional erythropoietin receptor of the cells with keuralcharacteristies. Comparison with receptor properties of erythroid cells / S. Masuda, M. Nagan, K. Takahata // J. Biol. Chem. - 1993. -Vol. 268. - P. 11208-11216.
6. Santhanam, A.V. Erythropoietin and cerebral vascular protection: role of nitric oxide / A.V. Santhanam, Z.S. Katusic // Acta Pharmacol Sin. - 2006. -Vol. 27. - P. 1389-1394.
7. Siren, A.L. Erythropoietin prevent neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress / A.L. Siren, M. Fratelli, M. Brines // Proc Natl Acad Sci USA. - 2001. - Vol. 98. - P. 4044-4049.
8. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats / L. Wang, Z. Zhang, Y. Wang et al. // Stroke. - 2004. - Vol. 35. -P. 1732-1737.
Серия Сроки наблюдения (сут)
опыта 3-и 7-е 14-е 30-е
1-я 0,9 ± 0,4 1,5 ± 0,6 2,6 ± 0,7 2,9 ± 0,5
2-я 5,2 ± 0,4* 5,5 ± 0,5* 5,7 ± 0,4* 5,8 ± 0,3*
Гиниатуллин Равиль Усманович, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора, Челябинский государственный институт лазерной хирургии по научно-исследовательской работе, [email protected].
Володченко Алексей Михайлович, врач-нейрохирург нейрохирургического отделения № 2, Областная клиническая больница № 3, [email protected].
Козель Арнольд Израилевич, доктор медицинских наук, профессор, директор, Челябинский государственный институт лазерной хирургии, [email protected].
Попов Геннадий Константинович, доктор медицинских наук, профессор, Челябинский государственный институт лазерной хирургии.
Астахова Людмила Витальевна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, Челябинский государственный институт лазерной хирургии, [email protected].
Bulletin of the South Ural State University Series “Education, Healthcare Service, Physical Education” ______________________________________________________2013, vol. 13, no. 4, pp. 100-103
PATHOLOGICAL AND FUNCTIONAL CHANGES
IN THE ISCHEMIC SPINAL CORD OF RATS
AFTER APPLICATION OF RECOMBINANT ERYTHROPOIETIN
R.U. Giniatullin, Chelyabinsk State Institute of Laser Surgery on research work, Chelyabinsk,
Russian Federation, [email protected],
A.M. Volodchenko, Regional Clinical Hospital № 3, Chelyabinsk, Russian Federation, volodchenkol [email protected],
A.I. Cosel, Chelyabinsk State Institute of Laser Surgery, Chelyabinsk, Russian Federation, volodchenkol [email protected],
G.K. Popov, Chelyabinsk State Institute of Laser Surgery, Chelyabinsk, Russian Federation,
L.V. Astakhova, Chelyabinsk State Institute of Laser Surgery, Chelyabinsk, Russian Federation, volodchenkol [email protected]
Results morphometric study spinal cord showed that the application of recombinant erythropoietin increased content of normal neurons and blood vessels, and the number of neurons with chromatolysis, cell-shade at all stages of the experiments as compared to the 1st series of experiments. All animals injected with recombinant erythropoietin was observed early activation of behavior. Within 36 hours after spinal cord ischemia model and subsequent observation periods they had no neurological disorders and are actively turned to food and water.
Keywords: spinal cord, experimental ischemia, pathological and functional disorders, recombinant erythropoietin.
Поступила в редакцию 9 сентября 2013 г.
