CC BY
56
Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, № 4-5, стр 583-592 О 2002, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
КОМБИНИРОВАННАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ В ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА
Черных Е.Р., Ступак В.В.*, Центнер М.И.*, Хонина Н. А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Никонов С.Д., Останин А.А.
Лаборатория клеточной иммунотерапии, ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск * НИИ травматологии и ортопедии М3 РФ, г. Новосибирск
Резюме. Целью работы явилось изучение иммунитета, а также оценка эффективности комбинированной иммунотерапии (КИТ) у больных со злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ). Иммунологические исследования выявили снижение относительного количества ЫК-клеток, экспрессии НЬА-ОЛ молекул на моноцитах и угнетение пролиферативной активности Т-клеток, что свидетельствовало о наличии у больных ЗОГМ иммунодепрессии. КИТ была проведена по разработанному ранее патенту у 65 больных ЗОГМ, которые составили основную группу. Контрольную группу составили 90 пациентов, которым проводилось стандартное лечение, включающее хирургическое удаление опухоли и лучевую терапию. Иммунотерапия по предложенному протоколу была хорошо переносима и характеризовалась клинической эффективностью. По сравнению с контрольной группой, у пациентов, получивших КИТ, на момент выписки регистрировались более высокие значения индекса качества жизни и достоверно чаще отмечалось компенсированное состояние. Показатели двухлетней выживаемости у больных основной группы в два раза превысили таковые в контрольной группе (50 vs 25,9%). При этом стойкая ремиссия длительностью более 3 лет была зарегистрирована у 14,3 % больных, получавших КИТ, в то время как в контрольной группе - только в 6,9% случаев. Эффективность КИТ зависела от гистологического варианта опухоли, пола, возраста пациентов и исходного состояния иммунитета. Таким образом, включение в комплексное лечение КИТ позволяет повысить эффективность лечения больных с внутримозговыми опухолями.
Ключевые слова: иммунитет, иммунотерапия, цитокины, злокачественные глиомы человека.
Chernykh Ye.R., Stupak V.V., Centner M.I., Khonina N.A., Leplina O.Yu., Tichonova M.A., Nikonov S.D., Ostanin A.A.
COMBINED IMMUNOTHERAPY OF HUMAN MALIGNANT BRAIN TUMORS
Abstract. The purpose of the present research was to evaluate the immunity and the efficiency of combined immunotherapy (CIT) in patients with malignant gliomas. We revealed that patients with malignant gliomas were characterized by inhibition of cellular immunity, that was evidenced by decreased count of NK cells, HLA-DR expression on monocytes and proliferative response of T cells. CIT in addition to current treatment was performed in 65 patients (investigated group) according to the earlier developed patent. The control group included 90 patients that were undergone to surgery and postoperative radiation therapy. The protocol of CIT was safe, well tolerated and displayed good efficacy. Thus, patients of investigated group had higher index of life quality and more frequently achieved compensated neurological status. Besides, CIT led to 2-fold increase of two-year survival rate (50 vs 25,9%) in comparison with control group. Whereas stable remission during 3 years in control group was observed in 6,9% of cases, 3 years event-free survival in patients with CIT accounted for 14,3% of cases. Efficacy of immunotherapy dependent of histological type, patient’s age, gender and initial T cell mitogen reactivity. Thus, CIT allows to enhance the efficiency of current treatment of brain malignancies. (Med.Immunol., 2002, vol.4, N4-5, pp 583-592)
Адрес для переписки: Введение
630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская 14, Среди первичных опухолей головного мозга 55-
Институт клинической иммунологии СО РАМН, 60 % приходится на долю злокачественных опухолей
Черных Е.Р. - анапластических астроцитом (АА) и глиобластом
Тел.: (3832) 49-43-29. Факс: (3832) 22-70-28. (ГБ) [7, 9]. Традиционное лечение злокачественных
E-mail: [email protected]. опухолей головного мозга (ЗОГМ) включает хирур-
гическое удаление опухоли, радиотерапию и химиотерапию. За последние годы отмечен значительный прогресс в развитии новых хирургических технологий и методов радиотерапии, благодаря чему удается достичь более радикальной элиминации опухолевых клеток. Тем не менее, в силу особенностей опухолей головного мозга (инфильтрирующий рост, отсутствие капсулы, радио/химиорезистентность) оставшиеся опухолевые клетки часто являются причиной рецидива, несмотря на проводимую радио- и химиотерапию. Поэтому прогноз при ЗОГМ остается крайне неблагоприятным [1,6]. Медиана выживаемости при глиобластомах, по данным разных авторов, варьирует в диапазоне 9-12 месяцев, а при анапластических астроцитомах - в диапазоне 20-27 месяцев [28, 34].
В отличие от солидных опухолей внемозговой локализации, глиомы характеризуются слабым иммунным ответом, что обусловлено низкой иммуногеннос-тью опухолевых клеток, наличием гематоэнцефали-ческого барьера и развитием неспецифической иммунодепрессии [27, 35]. Проявления иммунных дисфункций и механизмы их формирования остаются во многом неисследованными. Тем не менее, состояние иммунодепрессии расценивается как важный патогенетический фактор неблагоприятного течения ЗОГМ, а перспективы лечения злокачественных опухолей головного мозга связывают с разработкой и внедрением в практику методов иммунотерапии. Современные иммунотерапевтические стратегии включают как неспецифический, так и антигенспецифический варианты проведения иммунотерапии. К первому варианту относится применение цитокинов (интерфероны, интерлейкин-2), полиадъювантов, а также лимфокин-активированных киллерных (ЛАК) клеток [14,22]. Ко второму - различные протоколы иммунизации опухолевыми антигенами, а также использование анти-генспецифических цитотоксических Т-клеток, полученных при активации лимфоцитов ex vivo в присутствии опухолевых антигенов [15, 25, 26]. При этом, учитывая зависимость противоопухолевого ответа от многих факторов, включая исходное состояние иммунитета, возможность проникновения эффекторных клеток через гематоэнцефалический барьер и их способность преодолевать супрессию со стороны опухолевых клеток, предполагается, что комбинация различных подходов может существенно повысить эффективность проводимой иммунотерапии.
Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы явилось исследование состояния иммунитета у больных ЗОГМ и апробация комбинированного метода иммунотерапии в лечении ЗОГМ.
Материалы и методы
Характеристика больных
Представленные в работе результаты получены при обследовании 155 пациентов со злокачественны-
ми глиомами головного мозга, которые были прооперированы и наблюдались в клинике нейрохирургии НИИ травматологии и ортопедии в период с 1998 по 2002 г. В 58% случаях у больных диагностировалась гистологически верифицированная анапласти-ческая астроцитома 3 степени анаплазии, в 42% - гли-областома. Возраст пациентов варьировал от 14 до 69 лет (в среднем 45,7 ± 1,0 лет). Из 155 больных 119 (76,8%) оперированы первично, 36 пациентов (23,2%)
- по поводу рецидива опухоли. Поражение левого и правого полушария мозга отмечено с одинаковой частотой (50,3 и 49,7% соответственно). Наиболее часто опухоль локализовалась в одной доле (71,6%). Поражение двух долей встречалось в 26,5%, трех долей - в 1,9% случаях. В зависимости от вида комплексного лечения больные были разделены на две группы. Первую (контрольную группу) составили 90 человек, которым проводилось стандартное комплексное лечение, включающее операцию с удалением опухоли в пределах видимых границ и проведение лучевой терапии в стандартной дозе на область удаленной опухоли (55-60 Грэй). Вторую (основную) группу составили 65 человек, которым стандартное лечение в послеоперационном периоде было дополнено проведением курса комбинированной иммунотерапии (КИТ). У всех пациентов до операции и перед выпиской оценивался неврологический статус.
Комбинированная иммунотерапия
Комбинированную иммунотерапию проводили в режиме пилотных исследований в соответствии с разработанным патентом [5]. Кратко, на предварительном этапе из фрагмента удаленной опухоли получали аутологичные опухолевые клетки, которые после соответствующей инактивации и консервации использовали в дальнейшем в качестве источника опухолевых антигенов. На 3-4 сутки послеоперационного периода с целью ранней иммунокоррекции проводили индукторную фазу КИТ, которая включала использование комплексного цито-кин-содержащего препарата «Лейкинферона». Основной этап КИТ заключался в последовательном проведении 6 процедур выделения из крови пациента мононуклеарных клеток (МНК) и их культивирования в течение 48 ч с рекомбинантным интерлейкином-2 (1Ь-2) (препарат «Ронколейкин», производства ООО «Биотех», С-Петербург) и аутологичными опухолевыми антигенами. Полученные после активации клетки в комбинации с Ронколей-кином вводили через установленный катетер в ложе удаленной опухоли. Средняя курсовая доза клеток составила 2,5 ± 0,12 х 109/больного. Завершающий этап КИТ включал 10-15 подкожных инъекций смеси аутологичных цитокинов, полученных при культивировании лимфоцитов больного с опухолевым антигеном в присутствии 1Ь-2.
Эффективность терапии оценивали по срокам выживаемости больных. Кроме того, до операции и перед выпиской оценивали общее состояние пациентов по пятистепенной шкале, основанной на учете и выраженности дислокационного синдрома, очаговых симптомов, витальных нарушений [4]. Особое внимание отводилось также оценке индекса качества жизни (ИКЖ) по модифицированной нами шкале Карновского [18].
Иммунологическое исследование
Больным, получавшим КИТ, проводилось иммунологическое исследование. МНК выделяли из ге-паринизированной, венозной крови стандартно в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации 0,1 х 106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma), дополненной 0,3 мг/мл глютамина, 5мМ Нерев-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров AB(IY) группы. Для стимуляции клеток использовали конканава-лин А (СопА, 15 мкг/мл, Sigma) и моноклональные анти-СБЗ антитела (CD3-mAT, 1 мкг/мл, Медбиос-пектр, Москва). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа по включению 3Н-тимидина
Табл. 1. ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ ЗОГМ
(1 мкКю/лунку), добавленного за 18 часов до окончания культивирования.
Содержание различных субпопуляций клеток (CD3+, CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лим-фоцитов, CD16+ NK-клеток), относительное количество моноцитов с высокой экспрессией HLA-DR антигенов (HLA-DRhigh), а также средний уровень экспрессии (mean fluorescence, MF) HLA-DR-моле-кул на моноцитах определяли методом проточной цитофлуориметрии (FACS, Becton Dickinson) с помощью соответствующих моноклональных антител (ТОО «Сорбент», Москва).
Уровень апоптоза определяли методом проточной цитометрии с помощью окрашивания клеток пропи-диумом иодидом в конечной концентрации 50 мкг/ мл. Процентное содержание апоптотических лимфоцитов рассчитывалось по одномерной гистограмме оранжевой флюоресценции клеток (FL2-A), отнесенных к лимфоцитарному облаку. Содержание апоптотических клеток среди моноцитов и нейтрофилов -соответственно по одномерной гистограмме оранжевой флюоресценции клеток, отнесенных к моноци-тарному и нейтрофильному облаку. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик.
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, пара-
Показатель Доноры (п=56) Больные с ЗОГМ (п=44)
Лимфоциты х 107л 1,84 ±0,1 1,87 ± 0,1
CD3 Т-лимфоциты % 67,1 ± 1,0 67,3 ± 2,0
CD4 Т-лимфоциты % 39,0 ± 1,5 41,7 ± 1,8
CD8 Т-лимфоциты % 25,7 ± 1,1 26,2 ± 1,3
CD4/CD8 индекс 1,8 ± 0,1 1,7 ± 0,1
CD20 В-лимфоциты % 14,6 ± 0,9 11,4 ± 1,2
CD16 NK-клетки % 16,2 ± 1,3 11,1 ± 1,3 **
HLA-DRhiel' моноциты % 44,2 ± 2,0 31,1 ± 2,1 **
Уровень HLA-DR экспрессии (MF) 642 ± 49 293 ± 33 **
Пролиферация (имп/мин):
Спонтанная 2045 ± 154 1580 ± 104 *
СопА - индуцированная 58020 ± 4026 36435 ± 4181 **
CD3-MAT- индуцированная 28961 ± 1964 11207 ± 2842 **
Апоптоз лимфоцитов in vitro (%):
В культурах нестимулированных МНК 6,5 ± 0,6 13,0 ± 3,6 *
В культурах СопА-стимулированных МНК 9,4 ± 1,2 17,8 ± 5,0 *
Апоптоз свежевыделенных клеток лейковзвеси (%): Моноцитов 3,1 ± 0,34 4,6 ± 1,0
Нейтрофилов 7,5 ± 1,1 12,9 ± 2,2 **
Примечания: * ри<0,05, ** ри<0,01 - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (U -критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
метрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы “БТАТКТЮА 5.0”.
Результаты
Исследование состояния иммунитета, выполненное в группе 44 больных злокачественными глиомами до проведения оперативного вмешательства, показало, что развитие опухолевого процесса в головном мозге сопряжено с изменениями количественных и функциональных показателей иммунной системы (табл. 1). По сравнению со здоровыми донорами у больных отмечалось статистически достоверное снижение относительного содержания С016+>1К-клеток, НЬА-В11Ы8Ьмоноцитов, уровня экспрессии НЬА-ВИ молекул на поверхности моноцитов, а также пролиферативного ответа в культурах СопА- и анти-СОЗ-стимулированных МНК, что свидетельствовало об угнетении функциональной активности Т-клеток. Снижение пролиферативного ответа ассоциировалось с увеличением процентного содержания апоптотических лимфоцитов в культурах интактных (нестимулированных) и СопА-активированных МНК. При этом наряду с повышенным уровнем спонтанного и активационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов развитие опухолевого процесса сопровождалось значимым усилением апоптоза нейтрофилов.
Сравнение средних значений отдельных параметров иммунитета в подгруппах с различным гистологическим вариантом опухоли (ГБ га АА) не выявлено достоверных различий (данные не представлены). Тем не менее, анализ частоты встречаемости больных с наиболее выраженными изменениями показателей иммунитета (т.е. с такими изменениями, при которых регистрируемые параметры выходили за установленную границу нормативного диапазона) показал, что угнетение пролиферативного ответа на СопА (менее 24000 имп/мин) у больных с ГБ регистрировалось достоверно чаще, чем у больных АА (53 га 19%, Рртмф“0,03). Аналогичным образом, снижение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов при стимуляции через Т-клеточный рецептор (менее 17500 имп/мин) при ГБ выявлялось в 75% случаев, тогда как у больных с АА только в 33% случаев (Рртмф=0,05). Кроме того, в группе больных с ГБ частота встречаемости пациентов с низким уровнем НЬЛ-БИ экспрессии (менее 200 МБ) составила 60%, в то время как в группе больных с АА - только 20% (Рртмф=0,045). Таким образом, нарушения иммунитета в виде глубокой иммунодепрессии чаще выявлялись при глиобластомах, представляющих более злокачественный гистологический вариант ЗОГМ.
Курс комбинированной иммунотерапии был проведен в группе 65 больных ЗОГМ после хирургического удаления опухоли. Контролем служили 90 пациентов, которым проводилось стандартное ле-
Габл. 2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ КОНТРОЛЬНОЙ И ОСНОВНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ГРУППЫ
Признак Контрольная группа Основная группа Р
Количество больных 90 65
Средний возраст 46,6 ± 1,2 41,4 ±1,7
Мужчин 41 (45,6%) 41 (63,1%) 0,03
Женщин 49 (54,4%) 24 (36,9%)
Соотношение АА / ГБ 1,3 1,4
Поражение левого полушария 47 (52,2%) 31 (47,7%)
Поражение правого полушария 43 (47,8%) 34 (52,3%)
Поражение одной доли 58 (67,8%) 47 (76,9%)
Поражение двух долей 26 (28,9%) 15 (23,1%)
Поражение трех долей 3 (3,3%) 0
Оперированы первично 78 (86,7%) 41 (63,1%) 0,0006
Оперированы повторно 12 (13,3%) 24 (36,9%)
Объем опухоли (см3) 116 ± 14 176 ± 16 0,004
Исходный ИКЖ (баллы) 55,2 ± 1,9 58,6 ± 1,9
Общее состояние:
Компенсированное 8 (8,9%) 5 (7,7%)
Субкомпенсированное 46(51,1%) 31 (47,7%)
Декомпенсированное 33 (36,7%) 20(41,5%)
Крайне тяжелое 3 (3,3%) 2 (з;і%)
Примечания: достоверность различия частот подсчитана методом х2; достоверность различий средних значений -с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
чение. Сформированные группы (табл. 2) были однородны по большинству параметров - возрасту больных, соотношению пациентов с АА и ГБ, локализации опухоли, общему состоянию и уровню качества жизни. Имеющиеся различия проявлялись в преобладании в основной клинической группе мужчин и большей частоте пациентов, оперированных повторно по поводу рецидива ЗОГМ. Кроме того, больные основной группы характеризовались несколько большим объемом опухолевого субстрата. Учитывая худший прогноз выживаемости у пациентов с рецидивирующими формами ЗОГМ и данные о сопряженности иммунодепрессии с размером опухоли, выявленные различия свидетельствуют о большей тяжести группы больных, комплексное лечение которых было дополнено проведением КИТ.
Курсовое лечение по предложенному протоколу было хорошо переносимым и не сопровождалось развитием каких-либо серьезных побочных или токсических реакций. Более того, оценка качества жизни показала, что при равных исходных показателях ИКЖ в контрольной и основной группах (55,2 ± 1,9 и 58,6 ±1,9 баллов соответственно), через 1 мес после оперативного лечения больные, получившие КИТ, характеризовались более высоким значением индекса качества жизни (77,6 ± 1,6 63,5 ±1,5;
Ри<0,001) и отличались от пациентов контрольной группы по общему состоянию. В частности, компенсированное состояние в контрольной группе регистрировалось только у 16 из 90 (17,8%) пациентов, в то время как в основной группе - у 38 из 65 (58,8%) больных (Р 12=0,0001).
Анализ кривых выживаемости у пациентов со сроком наблюдения не менее 6 мес. показал, что проведение КИТ достоверно (Р=0,0001) улучшало результаты комплексного лечения больных ЗОГМ (рис 1). На настоящее время среди всех больных основной группы живы 66,7%, в то время как в контрольной группе - 15%. При этом стойкая ремиссия длительностью более 3 лет зарегистрирована у 14,3 % больных основной группы и только в 6,9% случаев среди больных контрольной группы. Медиана выживаемости в контрольной группе составила 11 месяцев, т.е. к этому сроку умерло 50% больных. В то же время в основной группе к исходу 11 месяцев число умерших больных составило 21%.
Результаты более детального анализа эффективности КИТ, в том числе с учетом гистологического варианта, возраста, пола и т.д., представлены в таблице 3, где проанализированы показатели выживаемости больных к исходу одного и двух лет наблюдения. Видно, что в контрольной группе к исходу 12 месяцев выживает половина больных, а к исходу 24 месяцев только 25,9% пациентов. При этом у пациентов старше 40 лет показатели выживаемости на период 12 и 24 месяцев были достоверно ниже, чем в группе больных в возрасте до 40 лет (Р?2 =0,001
Рис.1. Кривые выживаемости у пациентов контрольной и основной групп. Сплошная линия - больные контрольной группы, пунктирная линия - больные основной клинической группы. По оси абсцисс - продолжительность жизни (мес).
и Рх2=0,0003 соответственно). К исходу 2 года выявлялись также различия выживаемости в зависимости от пола. Так, число выживших мужчин было достоверно ниже, чем женщин (Рх2=0,004).
По сравнению с контрольной группой показатели одно- и двухлетней выживаемости в основной клинической группе были достоверно выше и составили соответственно 74,4 и 50%. При этом наиболее выраженные и достоверные различия наблюдались в подгруппах мужчин и пациентов старше 40 лет, т.е. у тех категорий больных, которые в контрольной группе имели худшие показатели выживаемости. Сравнительный анализ больных с различными гистологическими вариантами ЗОГМ показал, что уровень выживаемости у больных ГБ был существенно ниже, чем у пациентов с АА. Тем не менее, именно у этой категории больных регистрировалась наибольшая эффективность КИТ. Так, если в контрольной группе на период 12 месяцев выжило 27% больных ГБ, а на период 24 месяцев - 2,8%, то в основной группе эти показатели составили 66,7 и 40%. При этом прирост показателей выживаемости формировался преимущественно за счет увеличения числа выживших пациентов в подгруппе больных мужского пола и пациентов старше 40 лет.
Показатели выживаемости на период 12 и 24 месяцев у больных с АА были значительно выше, чем у больных ГБ, и составляли в контрольной группе соответственно 68 и 42,8%. Поведение КИТ сопровождалось увеличением выживаемости, которое было значимым у пациентов мужского пола и в группе больных старше 40 лет.
Увеличение показателей выживаемости при проведении КИТ регистрировалось как у первично, так и у повторно оперированных больных, однако в силу малой выборки больных с рецидивом ЗОГМ, результаты в этой подгруппе не были статистически значимы.
Анализ иммунологических параметров у больных ЗОГМ после завершения комплексного лечения
показал, что состояние иммунитета пациентов оставалось стабильным (данные не представлены). При этом отмечалась умеренно выраженная тенденция к усилению пролиферативной активности МНК. Полная нормализация измененных показателей иммунного статуса (относительного количества НЬА-БК+моноцитов, митогенной реактивности клеток) происходит у больных, по-видимому, в более поздние сроки. Высказанное предположение подтверждается данными рисунка 2, где показана динамика восстановления уровня СопА-индуцирован-ного пролиферативного ответа МНК трех пациентов в ближайшем и отдаленном периоде после проведения курса КИТ.
Чтобы оценить возможную взаимосвязь между исходным состоянием иммунитета и эффективностью КИТ, на завершающем этапе работы был проведен корреляционный анализ между исходными показателями иммунитета и продолжительностью жизни больных. При этом уровень митогенной реактивности Т-клеток оказался единственным иммунологическим параметром, который коррелировал
с выживаемостью больных. Так, между уровнем пролиферативного ответа на СопА и продолжительностью жизни пациентов была выявлена обратная взаимосвязь (г5= -0,37), которая была более выражена и статистически значима в подгруппе больных с глиобластомами (г5= -0,54; р<0,05). Полученные результаты позволяют заключить, что пациенты с более выраженными Т-клеточными дисфункциями лучше отвечают на проведение КИТ.
Обсуждение
Проведенные нами исследования показали, что возникновение злокачественных опухолей головного мозга ассоциировано с иммунной недостаточностью, в частности, с угнетением Т-клеточного иммунитета, что согласуется с данными литературы [21, 11]. В настоящее время обсуждается две возможные причины подавления Т-клеточного иммунитета при злокачественных глиомах. Во-первых, иммунная недостаточность может быть обусловлена супрессорной активностью глиомных клеток [27,35,10]. Имен-
Табл. 3. ПОКАЗАТЕЛИ ВЫЖИВАЕМОСТИ ПАЦИЕНТОВ В ГРУППАХ С РАДИЦИОННОЙ СХЕМОЙ ЛЕЧЕНИЯ И С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМБИНИРОВАННОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
Относительное количество выживших больных
Группа Общая группа АА ГБ
ТЛ ТЛ+КИТ ТЛ ТЛ+КИТ ТЛ ТЛ+КИТ
Выживаемость на 12 месяцев
Все больные 51,1% (45/88) 74,4% * (32/43) 68% (35/51) 80% (20/25) 27% (10/37) 66,7% * (12/18)
Мужчины 48,7% (19/39) 81% * (26/32) 65% (15/23) 83% (15/18) 25% (4/16) 78,6% * (11/14)
Женщины 53% (26/49) 54,5% (6/11) 71% (20/28) 71,4% (5/7) 28,6% (6/21) 25% (1/4)
До 40 лет 81,5% (22/27) 72,2% (13/18) 95% (20/21) 81,8% (9/11) 33,3% (2/6) 57% (4/7)
Старше 40 лет 37,7% (23/61) 76% * (19/25) 50% (15/30) 78,6% * (11/14) 25,8% (8/31) 72,7% * (8/11)
Первично
оперированные 51,9% (40/77) 88,5% * (23/26) 68% (30/44) 87,5% (14/16) 30,3% (10/33) 90% * (9/10)
Повторно
оперированные 45,5% (5/11) 53% (9/17) 71,4% (5/7) 66,7% (6/9) 0% (0/4) 37,5% (3/8)
Выживаемость на 24 месяца
Все больные 25,9% (22/85) 50% * (17/34) 42,8% (21/49) 57,8% (11/19) 2,8% (1/36) 40% * (6/15)
Мужчины 18,4% (7/38) 55,5% * (15/27) 30% (7/23) 60% * (9/15) 0% (0/15) 50% * (6/12)
Женщины 31,9% (15/47) 28,6% (2/7) 53,8% (14/26) 50% (2/4) 4,8% (1/21) 0% (0/3)
До 40 лет 51,8% (14/27) 57% (8/14) 66,7% (14/21) 57% (4/7) 0% (0/6) 57% (4/7)
Старше 40 лет 13,85 (8/58) 45% * (9/20) 25% (7/28) 58% (7/12) 3,3% (1/30) 25% (2/8)
Первично
оперированные 28% (21/75) 66,6% * (14/21) 46,5% (20/43) 69% (9/13) 3,1% (1/32) 62,5% * (5/8)
Повторно
оперированные 10% (1/10) 30% (3/10) 16,7% (1/6) 33% (2/6) 0% (0/4) 14,3% (1/7)
Примечания: в скобках - число наблвдений, * отмечены статистически достоверные различия частот, рассчитанные точным методом Фишера или методом х2
но поэтому после оперативного вмешательства показатели Т-клеточного иммунитета, по данным некоторых авторов, частично восстанавливаются, а при рецидиве опухоли вновь подавляются [8]. С другой стороны, высказывается предположение о наличии внутреннего дефекта Т-клеток, проявляющегося анергией и апоптозом Т-лимфоцитов [23]. В наших исследованиях нормализация показателей пролиферативной активности наблюдалась только в отдаленном периоде после удаления опухоли и завершения курса КИТ, что ставит под сомнение роль прямого супрессорного действия опухолевых клеток в угнетении функции циркулирующих Т-лим-фоцитов. С другой стороны, нами обнаружено, что одним из универсальных проявлений иммунодепрессии у больных 30 ГМ является дефект моноци-тарного звена, проявляющийся снижением уровня экспрессии НЬА-ОЫ молекул на моноцитах. Это позволило предположить, что угнетение клеточного иммунитета связано не столько с прямым действием супрессорных факторов опухолевых клеток на Т-лимфоциты, сколько с индуцированным опухолью стойким дефектом клеток моноцитарного ряда. Известно, что снижение экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса сопряжено с изменением функционального состояния антигенпрезентирующих клеток и может как обусловливать дефект митогенной реактивности, так и предопределять негативный исход клеточной активации [2, 30]. Действительно, наряду с угнетением пролиферативной активности Т-клеток на СопА нами выявлено глубокое угнетение пролифе-
рации Т-клеток при стимуляции через Т-клеточный рецептор и повышенный уровень активационного апоптоза лимфоцитов.
Поскольку выявленные дефекты иммунной системы могут негативно сказываться на эффективности генерации NK-клеток и антигенспецифических Т-лимфоцитов in vitro, на первом этапе КИТ предусматривалось проведение индуктивной фазы, направленной на коррекцию иммунных дисфункций. Для этого использовался препарат лейкинферон, содержащий в своем составе комплекс провоспалитель-ных цитокинов, которые, согласно данным литературы, способны через восстановление костимулятор-ной активности моноцитов/макрофагов усиливать митогенную реактивность Т-клеток и протектировать развитие анергии и программированной гибели Т-лимфоцитов [3, 32, 30]. Чтобы повысить активность эффекторных клеток мы также посчитали целесообразным комбинированное использование ЛАК-кле-ток и антигенспецифических Т-лимфоцитов, активированных опухолевыми антигенами в присутствии IL-2. Так, известно, действие NK-клеток может подавляться продуцируемым опухолевыми клетками TGF-p. В то же время эффект цитотоксических Т-клеток, опосредованный Fas/FasL взаимодействиями, резистентен к действию TGF-(3 [31]. С другой стороны, показано, что стимуляция МНК IL-2 при генерации NK-клеток сопровождается продукцией достаточно широкого спектра цитокинов, среди которых IL-1 и IFN-y способны подавлять продукцию IL-10, ослабляя тем самым супрессорное действие опухоли на эффекторные клетки [24].
Время
Рис.2. Динамика восстановления пролиферативной активности МНК больных 30ГМ. По оси ординат - интенсивность СопА-индуцированного пролиферативного ответа (имп/мин х 10 3). По оси абсцисс - иммунологические обследования: 1 - до операции; 2 - после операции; 3 - после окончания КИТ; 4 - через 12 мес после завершения комплексного лечения. Отдельно представлены нормативные значения СопА-стимулированной пролиферации МНК здоровых доноров в виде М ± Б.Е. и доверительного интервала (ДИ).
Сравнительная оценка выживаемости пациентов в исследуемых нами основной и контрольной группах показала, что предложенный вариант КИТ оказался эффективным. В целом по группе проведение КИТ приводило к двукратному увеличению уровня двухлетней выживаемости. Причем наиболее выраженный прирост показателей выживаемости наблюдался среди пациентов с менее благоприятным прогнозом, а именно, у пациентов с ГБ. Так, в контрольной группе из 39 больных с ГБ только один пациент пережил срок 24 месяца после оперативного лечения. В то же время из 27 пациентов, получивших КИТ, четверо на сегодняшний день пережили 36 месячный безрецидивный период. Значительное увеличение показателей выживаемости наблюдалось также среди пациентов старше 40 лет и в группе мужчин. В наших исследованиях двухлетняя выживаемость в группе мужчин, получивших КИТ, была в 3 раза выше, чем в контрольной группе. Аналогичным образом, показатель двухлетней выживаемости пациентов старше 40 лет в основной группе более чем в 3 раза превышал аналогичный показатель в контрольной группе. Из данных литературы известно, что частота возникновения ЗОГМ регистрируется чаще у мужчин. Также известно, что показатели выживаемости обратно пропорциональны возрасту больных [17]. Возможно, это связано с более выраженными дисфункциями иммунитета, обусловленными возрастными изменениями в иммунной системе и иммунодепрессивным действием андрогенов. Поэтому данная категория больных оказывается наиболее чувствительной к иммунотерапии. Действительно, анализ эффективности иммунотерапии в зависимости от исходных показателей иммунитета выявил наличие обратной зависимости между исходным уровнем митогенной реактивности Т-клеток и продолжительностью жизни.
Попытки активного внедрения методов иммунотерапии в комплексное лечение ЗОГМ предпринимаются вот уже на протяжении 20 лет. Однако будучи эффективными в экспериментальных моделях, такие подходы, как использование цитоки-нов (интерфероны, интерлейкин-2, фактор некроза опухоли) и иммунизация опухолевыми клетками в клинических испытаниях показали незначительную эффективность [20, 12, 29]. Использование методов адоптивной иммунотерапии с применением ЛАК или антигенспецифических Т-лимфо-цитов особенно при локорегиональном введении эффекторных клеток и низких доз интерлейкина-2 оказалось более успешным [13, 14, 22]. Интерес к данному виду лечения не охладел, и отдельные случаи успешной иммунотерапии приводятся по настоящее время [16]. Тем не менее, клинические испытания адоптивной иммунотерапии ограничены небольшими выборками наблюдений и в силу существенных различий используемых протоко-
лов не позволяют пока однозначно оценить эффективность лечения.
Прогресс в понимании клеточно-молекулярных механизмов противоопухолевой защиты позволил существенно продвинуться в разработке новых им-мунотерапевтических стратегий. Стало очевидно, что успех иммунотерапии во многом определяется возможностью преодоления гематоэнцефалического барьера, ослабления супрессорного потенциала опухолевых клеток, коррекцией исходных иммунных дисфункций, усилением распознаваемости опухолевых антигенов и т.д. [19, 26, 33]. Поэтому сочетание различных иммунотерапевтических стратегий - например, комбинирование специфической и неспецифической, активной и адоптивной иммунотерапии, системных и локальных подходов может существенно повысить эффективность иммунотерапии, что подтверждается полученными нами данными. Имеющиеся на сегодняшний день результаты пока еще не позволяют однозначно ответить на вопрос о том, какое место займет иммунотерапия в лечении ЗОГМ. Тем не менее, можно полагать, что иммуно-терапевтические технологии послужат хорошим дополнением к имеющимся методам лечения, особенно на этапе, когда объем опухолевой массы минимизирован.
Список литературы
1. Земская А.Г., Лещинский Б.И. Опухоли головного мозга астроцитарного ряда. - Л„ 1985. - 216 с.
2. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев
A.А. Эндогенные иммуномодуляторы. Санкт-Петербург, “Гиппократ”.- 1992, 256 с.
3. Кузнецов В.П., Маркелова В.П., Лазанович
B.А., Колесникова Н.В., Беляев Д.Л., Бабаянц А.А., Кузнецова С.Ю., Силич Е.В. Дисбаланс цитокинов как фактор патогенеза гнойно-септических заболеваний и иммунокорригирующие эффекты лейкин-ферона. // Медицинская Иммунология.- 2002.- Т. 4, № 1.- С.11-20.
4. Марченко С.В. Комплексное лечение злокачественных глиом полушарий головного мозга: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. - С.-Пб., 1997. - 24 с.
5. Никонов С.Д., Черных Е.Р., Останин А.А., Хонина Н.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Ступак
В.В., Центнер М.И. Способ комбинированной иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга // Заявка на изобретение № 2000111634 / 14 (012134) приоритет от 10.05.2000 г.
6. Олюшин В.Е., Улитин А.Ю. Глиальные опухоли. Распространенность в Санкт-Петербурге, результаты лечения. // Материалы II съезда нейрохирургов России,- С-Пб.- 1998.- С. 148-149.
7. Ярцев В.В., Коршунов А.Г., Непомнящий В.П. Некоторые аспекты эпидемиологии и классифика-
ции опухолей нервной системы. // Вопросы нейрохирургии.- 1997.- № 3.- С. 9-13.
8. Brooks WH, Latta RB, Mahaley MS, et al. Immunobiology of primary intracranial tumors //J. Neu-rosurg.- 1981,- Vol. 54.- P. 331-337.
9. Davis F.G., Malinski N., Haenzel W., et al. Primary brain tumor incidence rates in four United States regions, 1985-1989: a pilot study. //Neuroepidemiology (Switzerland).- 1996.- Vol. 15, № 2,- P. 103-112.
10. Dietrich P, de Tribolet N. Immune response against malignant astrocytic tumors and related therapy. In: Raffel C, Harsh GR IV, eds. The Molecular Basis of Neurological Disease. Baltimore: Williams & Wilkins, 1996,- P. 211-237.
11. Elliott L., Brooks W., Roszman T. Role of interleukin-2 (IL-2) and IL-2 receptor expression in the proliferative defect observed in mitogen-stimulated lymphocytes from patients with gliomas. // CNI.- 1987.-Vol. 78,- P. 919-922.
12. Farkkila М., Jaaskelainen J., Kallio M. et al. Randomised, controlled study of intratumoral recombinant y-interferon treatment in newly diagnosed glioblastoma. // Br. J. Cancer.-1994.- Vol. 70,- P. 138-141.
13. Groux H., Monte D., Plouvier B., et al. CD3-mediated apoptosis of human medullary thimocytes and activated peripheral T cells: respective roles of inter-leukin-1, interleukin-2, interferon-gamma and accessory cells. // Eur. J. Immunol.- 1993.- Vol. 23.- P. 1623
- 1629.
14. Hayes R.L., Koslow М., Hiesiger E.M., Hymes K.B., Hochster H.S., Moore E.J., Pierz D.M., Chen D.K., Budzilovich G.N., Ransohoff J. Improved long term survival after intracavitary interleukin-2 and lymphokine-activated killer cells for adults with recurrent malignant glioma. // Cancer.- 1995,- Vol. 76, № 5,- P. 840-852.
15. Holladay F.P., Heitz-Turner Т., Bayer W.L., Wood G.W. Autologous tumor cell vaccination combined with adoptive cellular immunotherapy in patients with grade III/IV astrocytoma. // J. Neurooncol.-
1996,- Vol. 27, № 2,- P. 179-189.
16. Huang Y., Hayes R.L., Wertheim S., Arbit E., Scheff R. Treatment of refractory recurrent malignant glioma with adoptive cellular immunotherapy: a case report. // Crit. Rev. Oncol. Hematol- 2001,- Vol. 39, № 1-2.- P. 17-23.
17. Iwabuchu S., Bishara S., Herbison P., Erasmus
A., Samejima H. Prognostic factors for supratentorial low grade astrocytomas in adults. // Neurol. Med. Chir.-1999,- Vol. 39, № 4,- P. 273-281.
18. Kamofsky D.A., Borchenal J.H. The clinical evaluation of chemotherapeutic agents in cancer. In: Macleod
C.M. (ed.) Evaluation of chemotherapeutic agents. - New York: Columbia University Press, 1949. - P. 199-205.
19. Lawrence R. Dendritic vaccine promising for gliomas. // Drug Discovery Today.- 2001,-Vol. 6, №
7,- P. 329-330.
20. Mahaley M.S., Bigner D.D., Dudka L.F. et.al. Immunobiology of primary intracranial tumors. Part 7: active immunotherapy with anaplastic human glioma cells: a pilot study. // J. Neurosurgery.-1983.-Vol. 59,- P. 201-207.
21. McVicar D.W., Davis D.F., Merchant R.E. In vitro analysis of the proliferative potential of T cells from patients with brain tumor: glioma-associated immunosuppression unrelated to intrinsic cellular defect. //J. Neurosurg.- 1992,- Vol. 76, № 2,- P. 251-260.
22. Merchant R.E., Baldwin N.G., Rice C.D., Bear H.D. Adoptive immunotherapy of malignant glioma using tumor-sensitized T lymphocytes. //Neurol. Res.-
1997,- Vol. 19, № 2,- P. 145-152.
23. Morford, L. A., Elliott L. H., Carlson S. L., Brooks W. H., Roszman T. L. T cell receptor-mediated signaling is defective in T cells obtained from patients with primary intracranial tumors. //J. Immunol- 1997.-Vol. 159,- P. 4415-4419.
24. Naganuma H., Sasaki A., Satoh E., Nagasaka M., Nakano S., Isoe S., Nukui H. Down-regulation of transforming growth factor-beta and interleukin-10 secretion from malignant glioma cells by cytokines and anticancer drugs. //J. Neurooncol.- 1998,- Vol. 39, №
3,- P. 227-236.
25. Plautz G.E., Barnett G.H., Miller D.W., Cohen
B.H., Prayson R.A., Krauss J.C., Luciano M., Kangiss-er D.B., Shu S. Systemic T cell adoptive immunotherapy of malignant gliomas. // J. Neurosurg.- 1998.- Vol. 89, № 1,- P. 42-51.
26. Plautz G.E., Miller D.W., Barnett G.H., Stevens G.H., Maffett S., Kim J., Cohen P.A., Shu S. T cell adoptive immunotherapy of newly diagnosed gliomas. // Clin. Cancer Res.- 2000,- Vol. 6, № 6,- P. 2209-2218.
27. Roszman T., Elliott L., Brooks W. Modulation of T-cell function by gliomas. // Immunol. Today.-1991,- Vol. 12, № 10,- P. 370-374.
28. Salcman M. Glioblastoma and malignant astrocytoma. In: Kaye A.H., Laws E.R.J. Brain tumors: an encyclopedic approach. // NY: Churchill-Livingstone, 1995,- P. 449-477.
29. Saris S.C., Patronas N.J., Rosenberg S.A., Alexander J.T., Frank J., Schwartzentruber D.J., Rubin J.T., Barba D., Oldfield E.H. The effect of intravenous in-terleukin-2 on brain water content. // J. Neurosurg.-1989,- Vol. 71, № 2.- P. 169-174.
30. Swain S.L. The activation and differentiation of T cells. // Immunologist.- 1995.- Vol. 3.- P. 209-211.
31. Weller M., Fontana A. The failure of current immunotherapy for malignant glioma. Tumor-derived TGF-beta, T-cell apoptosis, and the immune privilege of the brain. // Brain Res. Rev.- 1995,- Vol. 21, № 2,- P. 128-151.
32. Wells A.D., Walsh M.C., Bluestone J.A., Turka L.A. Signaling through CD28 and CTLA-4 controls two distinct forms of T cell anergy. // J. Clin. Invest.-2001,- Vol. 108,- P. 895-904.
33. Wood G.W., Holladay F.P., Turner T., Wang Y.Y., Chiga M. // A pilot study of autologous cancer cell vaccination and cellular immunotherapy using anti-CD3 stimulated lymphocytes in patients with recurrent grade III/IV astrocytoma. // J. Neurooncol.- 2000.-Vol. 48, №2,- P. 113-120.
34. Yen S.A., Leung S.W., Sun L.M., Wang C.J., Fang F.M., Chen H.C. Postoperative radiotherapy for
supratentorial malignant gliomas. // J. Neurooncol.-1999,- Vol. 42, № 2,- P. 183-187.
35. Zou J.P., Morford L.A., Chougnet C„ Dix A.R., Brooks A.G., Torres N., Shuman J.D., Coligan J.E., Brooks W.H., Roszman T.L., Shearer G.M. Human glioma-induced immunosuppression involves soluble factor(s) that alters monocyte cytokine profile and surface markers. // J. Immunol.- 1999,- Vol. 162, № 8,- P. 4882-4892.
поступила в редакцию 07.06.2002 принята к печати 03.09.2002
