CC BY
28УДК 616.992.282
КОЛОНИЗИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ CANDIDA SPR ПРИ ДИСБИОЗАХ КИШЕЧНИКА
Алешукина А.В. (вед.н.с.)
ФГУН Ростов НИИМП Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия
© Алешукина А.В., 2009
Изучена колонизирующая способность 416 Candida spp., выделенных из кишечника людей с дисбиозами. Отмечено преобладание non-albicans видов Candida. Адгезивная активность Candida spp. была низкая. Филаментирующая способность коррелировала в 100% случаев с адгезивностью. Выявлена связь повышения муколитической, казеинолитической лизоцим-продуцирующей и антииммуноглобулиновой способностей Candida spp. с увеличением содержания микромицетов в 1 г фекалий. Препаратами выбора для лечения инвазивного кандидоза могут служить: кето-коназол, итраконазол, клотримазол и нистатин.
Ключевые слова: адгезия, Candida spp.; казеинолитическая, колонизирующая, лизоцим-продуцирующая, муколитическая способности; персистентные характеристики.
CANDIDA SPP. COLONIZATING CAPABILITY AT INTESTINAL DISBIOSIS
Aleshukina A.V. (leading researcher)
Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology of Rospotrebnadzor, Rostov on Don, Russia
© Aleshukina A.V., 2009
It Is studied colonizating capability of 416 Candida spp., chosen from bowels of the people with disbiosis. The noted prevalence nonalbicans species Candida. The adhesive activity of Candida spp. was low. Filamentations has correlated in 100% events with adhesition. The revealled relationship of increasing mucolytical, caseinolytical, lisocim-productions and antiimmunoglobulin of the capabilities of Candida spp. with increase of micromycetes in lgfaeces. The preparation of the choice for treatment of invasive candidosis. It is possible to use ketoconasol, itraconasol, klotrimasol and nistatin.
Key words: adhesition, Candida spp.; caseinolytical, colonizating, lisozyme-production, mucolytical capability, persistent characteristics
* Контактное лицо: Алешукина Анна Валентиновна Тел.: (863) 234-91-83
Колонизирующая способность индигенных микроорганизмов является важным фактором защиты, она представляет собой совокупность их свойств (адгезия, антагонистическая активность и т. д.), равно как и способность представителей собственной микробиоты быть связанной с особенностями метаболизма, скоростью ассимиляции питательных веществ, ферментной активностью, устойчивостью к изменениям pH среды и другими внешними факторами биотической и абиотической природы.
Колонизации кишечника Candida spp. способствует лечение широкоспектральными антибиотиками с активностью против анаэробов, применение третьей генерации цефалоспоринов, а также антибиотиков с интенсивной концентрацией в собственной пластинке кишечника. Колонизация кишечника микромицетами может привести к кандидемии при наличии следующих факторов риска: массивная колонизация кишечника Candida spp., первичное повреждение кишечника, гипохлоргидрия желудка, снижение перистальтики кишечника, цитотоксиче-ская химиотерапия [1].
Особый интерес представляют факторы перси-стенции собственных представителей микробиоты кишечника, которые отражают способность микроорганизмов противостоять защитным механизмам макроорганизма [2].
Длительное переживание (персистенция) Candida spp. на слизистых оболочках организма человека связано с их способностью к инактивации факторов естественной резистентности макроорганизма — лизоцима, белков системы комплемента и др. Одним из компонентов неспецифического иммунитета, обеспечивающих защиту хозяина, является лактофер-рин. Выявлено, что Candida spp. обладают антилак-тоферриновой активностью (АЛФА), которая является фактором персистенции данной группы, причем в большей степени АЛФА характерна для Candida spp., выделенных из кишечника [3].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 2127 амбулаторных больных, обращавшихся для обследования на дисбиоз кишечника. Было выделено 416 культур Candida spp.
Первичные посевы материалов от больных для выделения Candida spp. осуществляли на среду Са-буро согласно рекомендациям [4]. Исследование филаментирующей способности проводили на рисовой среде в модификации Блинова [5]. Видовую дифференциацию Candida spp., согласно данным П.Н.Кашкина [5], проводили по способности к утилизации и ферментации различных углеводов (глюкозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы). Исследовали чувствительность выделенных культур к антимикотическим препаратам (нистатину, амфоте-рицину В, клотримазолу, флуконазолу, итраконазо-лу, кетоконазолу) согласно рекомендациям (НИЦФ, Санкт-Петербург). Колонизирующую способность
Candida spp. оценивали по совокупности адгезивной способности согласно методике Брилис В.И. [6], про-теолитической (казеинолитической) [7] и муколи-тической активности [8]. Лизоцим-продуцирующую способность и персистентные характеристики (ан-тикомплементарную, антииммуноглобулиновую активности) изучали согласно О.В. Бухарину [2]. Исследовали антагонистическую активность Candida spp. по отношению к тест-штаммам: Escherichia coli М-17, Proteus mirabilis 115, Klebsiella pneumoniae 211, Shigella sonnei S-форма, Staphylococcus aureus 209p, Salmonella typhimurium 307 [9]. Все характеристики были проанализированы в двух группах Candida spp.: в количестве их выявления 0-Lg3 КОЕ/г и более Lg3 КОЕ/г фекалий.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В развитии патогенеза кандидоза различают следующие этапы: прикрепление (адгезию) грибов к поверхности слизистой оболочки с ее колонизацией, внедрение (инвазию) в эпителий, преодоление эпителиального барьера слизистой оболочки, попадание в соединительную ткань собственной пластинки, преодоление тканевых и клеточных защитных механизмов, проникновение в сосуды, гематогенная диссеминация с поражением различных органов и систем.
Высеваемость из содержимого толстого кишечника Candida spp. у людей с дисбиозами составляла 19,6% (416 человек). При этом Candida spp. выявляли в количестве, превышающем Lg3 КОЕ/г фекалий в 38,7% от всех изолируемых культур, у 161 пациента, которые могли быть расценены как лица, страдающие инвазивным кандидозом кишечника.
По видовому составу среди выделенных Candida spp. достоверно преобладали non-albicans виды Candida (77,4% от общего количества выделенных культур этого рода). С. albicans, соответственно, были выделены в 22,6% случаев. Среди non-albicans видов Candida чаще всего регистрировали: С. krusei (30,1%) и С. catenulata (13%).
Изучением спектра чувствительности к антими-котическим препаратам показано, что Candida spp. были наиболее чувствительны к азоловым антими-котикам, при этом по чувствительности Candida spp. распределили следующим образом (в порядке убывания): к кетоконазолу (74,3%), к клотримазолу (69,5%), к итраконазолу (61%), к флуконазолу (50,5%). Чувствительность к другим антимикотикам была ниже: к нистатину (52,4%), к амфотерицину В (49,6%). При этом С. albicans были более чувствительны к нистатину (76,2%), к амфотерицину В (76,2%) и к флуконазолу (66,7%); С. krusei — к флуконазолу (39,3%), к кетоконазолу (39,3%) и нистатину (42,9%); С. catenulata — к нистатину, амфотерицину В, флуконазолу и кетоконазолу (по 50%). Следует также отметить, что 46 культур дрожжеподобных грибов (11%) оказались
устойчивыми к действию всех тестируемых препаратов. Такая невосприимчивость к антимикотикам может являться следствием природной устойчивости Candida spp. к названным препаратам, а также резистентности, приобретенной в результате применения пациентами антимикотиков ранее. Следует отметить, что к полиенам (нистатину и амфотерицину В) тестируемые культуры были устойчивы в 47,6% и в 50,4% соответственно, что, в общем, характерно для длительно используемых в медицинской практике антимикотиков. Однако полиеновые антимикоти-ки плохо всасываются в желудочно-кишечном тракте и именно этим препаратам отдают предпочтение при коррекции дисбиотических нарушений, обусловленных Candida [10]. В тоже время по данным Блинова [11], чувствительность С. albicans и других видов этого рода к флуконазолу в течение последних лет мало изменилась и остается сравнительно высокой.
Попытки дифференциации патогенных Candida spp. от непатогенных предпринимаются по способности к адгезии во всем мире [12]. Однако до сих пор единого методического подхода к оценке адгезивно-сти Candida не разработано.
Инвазия Candida spp. в большей степени определяется наличием мицелиально-дрожжевого диморфизма. В большинстве случаев дрожжевую форму у других микромицетов признают более инвазивной, тогда как у Candida spp., наоборот, до недавнего времени более инвазивной считали мицелиальную форму. Однако следует иметь в виду, что в глубине тканей, где более ограничен доступ кислорода воздуха, по сравнению с органами и тканями открытых систем, дрожжевая форма может быть более инвазивной. Поэтому присутствие обеих форм Candida spp. в патологическом материале является патогномонич-ным для инвазивной инфекции [11]. Проведенными исследованиями показано, что адгезивность Candida коррелировала с филаментацией — у адгезирующих видов в 100% случаев отмечали способность к нитео-бразованию.
По данным литературы, кандидоз слизис тых оболочек часто протекает как микст-инфекция. При этом чаще обнаруживают ассоциацию грибов со значительным количеством условно-патогенных бактерий — Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Morganella, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa [13]. Было изучено распределение Candida spp. по степени антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям (табл.1)
Таблица 1.
Антагонистическая активность Candida spp. по отношению к тест-штаммам
Группы тестируемых Candida
Candida spp., выделенные в количестве более Lq3 КОЕ/г
Candida spp., выделенные в количестве Lg3 КОЕ/г
Антагонистическая активность Candida sop., 0 задержки роста, в мм
4,1
1,2
14,1
5,2
8,8
2,3
12,8
7,0
10,9
3,0
В целом было обнаружено, что антагонистическая активность тестируемых микромицетов была, в основном, средней и низкой. В группе Candida spp., выделенных в количестве Lg3 КОЕ/г, более активными микромицеты были против Shigella sonnei S-форма, Proteus mirabilis 115, Staphylococcus aureus 209р. Эти тенденции сохранялись и в группе Candida spp., выделенных в количестве более Lg3 КОЕ/г. Однако показатели антагонистической активности в этой группе были на несколько порядков выше против Staphylococcus aureus 209р — в 3,6 раз, Proteus mirabilis 115 — в 2,7 раз, Shigella sonnei S-форма — в 1,8 раз. При этом антагонизм Candida spp. возрос и к бактериям, к которым изначально показатели были невысокие (Salmonella typhimurium 307 — в 8,3 раз; Klebsiella pneumoniae 211 — в 3,8 раз; Escherichia coli М-17 — в 3,4 раз). Согласно полученным результатам, антагонистическая активность Candida spp. возрастает параллельно с изменением содержания микромицетов в кишечнике.
В основе микробного антагонизма лежит выработка биологически активных веществ, к которым относят лизоцим. Лизоцим является одним из основных регуляторов микробного ценоза в экологической системе желудочно-кишечного тракта [14]. Была изучена способность Candida spp. к выработке лизоцима (табл. 2).
Таблица 2.
Продукция лизоцима Candida spp.
Группы тестируемых Candida Лизоцим — продуцирующая способность Candida spp., %
Сильная (++++) Умеренная (+++) Слабая (++) Отсутствие признака (+,0)
Candida spp., выделенные в количестве более Lq3 КОЕ/г 44 ±3,9 38,6± 3,8 11,9± 2,6 5,5±1,8
Candida spp., выделенные в количестве Lg3 КОЕ/г 0 29± 2,8 22,6± 2,6 48,4± 3,1
в 51,6% случаев; признак отсутствовал в 48,4±3,1%. В группе Candida spp., выделенных в количестве более Lg3 КОЕ/г, обнаружили перераспределение количества лизоцим-продуцирующих Candida spp. — доля активных культур составила 94,5± 1,8%. Таким образом, с увеличением содержания дрожжеподобных грибов в кишечном содержимом происходило повышение лизоцим-продуцирующей активности Candida spp. В работе Бухарина О.В. с соавт. [15] была изучена антилизоцимная активность энтеробактерий, выделенных из кишечника, в ассоциации с Candida spp. В исследовании показано, что ассоциация стимулировала антилизоцимную активность условно-патогенных энтеробактерий. Эти данные косвенно подтверждают правомочность наших результатов в отношении увеличения процента лизоцим-продуцирующих Candida именно при дис-биозах, т.к. при повышении содержания лизоцима в среде кишечника за счет увеличения его продукции макро- и микроорганизмами происходит усиление выработки контрферментов микроорганизмами для обеспечения колонизирующей способности.
Колонизация биотопов организма человека различными микроорганизмами связана с наличием у них факторов, способствующих либо уходу от защитных механизмов макроорганизма, либо их инактивации [2]. В связи с этим были изучены протео-литические ферменты Candida spp., определяющие муколитическую, казеинолитическую, антикомпле-ментарную и антииммуноглобулиновую активности. Некоторые ферменты микромицетов могут рассматриваться в качестве факторов их агрессии/патогенности.
Одним из факторов, способствующих колонизации экологической ниши микроорганизмами, является их способность к разрушению муцина. Муцин представляет собой основной компонент слизистых секретов эпителиальных клеток. У микроорганизмов существует ряд ферментов, обеспечивающих проникновение через муциновый слой: например, гиалуронидаза, галактозидаза и т.д. [8]. Результаты исследования муколитической активности Candida spp. представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Муколитическая активность Candida spp.
Муколитическая активность Candida spp., %
Группы тестируемых Candida Сильная (++++) Умеренная (+++) Слабая (++) Отсутствие признака (+,0)
Candida spp., выделенные в количестве более Lq3 КОЕ/г 9,5 ±2,3 17,9± 3 15 ± 2,8 57,6± 3,8
Candida spp., выделенные в количестве Lg3 КОЕ/г 0 14,3± 2,2 21,4±2,7 64,3 ± 3
Проведенными исследованиями показано, что в группе Candida spp., выделенных в количестве Lg3 КОЕ/г, лизоцим-продуцирующие культуры выявляли
Из представленных данных следует, что частота встречаемости признака и его выраженности в группе Candida spp., выделенных в количестве более Lg3 КОЕ/г, возрастала по сравнению с группой грибов, определяемых в кишечном содержимом в нор-
2
0
мальном количестве. Так, выраженность признака в первой тестируемой группе преобладала в 1,9 раза. Уменьшилось и количество культур с отсутствием признака на 6,7%.
Наличие внеклеточных протеаз у Candida spp. могут определять их способность к инвазии. Казеи-нолитическая активность определяет способность микроорганизмов к протеолизу. Полученные результаты исследования этого свойства у Candida spp. представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Казеинолитическая активность Candida spp.
Казеинолитическая активность Candida spp., %
Группы тестируемых Candida Сильная (0 > 20 мм) Умеренная (016-19 мм) Слабая (012-15 мм) Отсутствие признака (0 < 11мм)
Candida spp., выделенные в количестве более Lq3 КОЕ/г 24±3,4 24±3,4 6,3±1,9 45,7±3,9
Candida spp., выделенные в количестве Lg3 КОЕ/г 7,1±1,6 14,3±2,2 21,4±2,6 57,2±3
На основании полученных данных, можно говорить об увеличении доли высоко и умеренно протео-литически активных Candida spp., выделенных в количестве более Lg3 КОЕ/г исследуемого материла, по сравнению с группой, где Candida spp. определяли в нормальном количестве практически в 2 раза. Такие результаты подтверждали возрастание инвазивных способностей у Candida при дисбиозах кишечника, особенно характеризующихся увеличением содержания Candida spp.
Способности к адгезии на тканях хозяина и к трансформации в псевдомицелий, инвазирующий ткани хозяина, синтез набора гидролитических энзимов (секретируемые аспаргил-протеиназы и фосфолипазы), вызывающих повреждение тканей хозяина, фенотипическая изменчивость, которая может играть роль в процессах адаптации грибов к ксенобиотикам — все это давало бы неполную характеристику колонизирующей способности Candida spp. без учета иммуномодуляторных эффектов, повреждающих эффективность систем антимикробной резистентности хозяина [16], т. е. персистентных свойств, усиливающих колонизационный потенциал микромицетов [3]. В этой связи были изучены анти-комплементарная и антииммуноглобулиновая активности Candida spp. (табл. 5 и 6).
Таблица 5.
Антикомплементарная активность Candida spp.
Антикомплементарная активность Candida spp%
Группы тестируемых Candida Сильная (00-9 мм) Умеренная активность (010-15 мм) Слабая активность (016-19 мм) Отсутствие признака (0 > 20 мм)
Candida spp., выделенные в количестве более Lq3 КОЕ/г 78±3,4 14±2,7 5±1,7% 3±1,3%
Candida spp., выделенные в количестве Lg3 К0Е/г 71,4±2,8 28,6±2,8 - -
При анализе данных антикомплементарной активности не выявили достоверных различий признака в обеих тестируемых группах дрожжеподобных грибов. Была сохранена общая тенденция преобладания сильно и умеренно активных культур в отношении комплемента у микромицетов, выделенных как в нормальном количестве, так и с повышенным содержанием КОЕ в 1 г исследуемого материала.
Таблица 6.
Антииммуноглобулиновая активность Candida spp.
Группы тестируемых Candida Антииммуноглобулиновая активность Candida spp., %
Сильная Умеренная Слабая Отсутствие признака
Candida spp., выделенные в количестве более Lq3 КОЕ/г 50±1,2 35,7± 3,7 14,3±2,7 -
Candida spp., выделенные в количестве Lg3 К0Е/г 16,7±2,3 58,3 ±3 13,3±2,1 11,7±2
При изучении антииммуноглобулиновой активности доказано перераспределение удельного веса в сторону увеличения антииммуноглобулин — активных культур с преобладанием сильно и умеренно активных в группе Candida, выделенных в количестве более Lg3 КОЕ/г, по сравнению с группой, где Candida были выделены в нормальном количестве (85,7% и 75% соответственно).
ВЫВОДЫ
1. Non-albicans виды Candida выделяли в 77,4%, а С. albicans — в 22,6% случаев. Среди первых чаще всего регистрировали: С. krusei (30,1%) и С. catenulata (13%).
2. Адгезивная способность Candida spp., выделенных из фекалий людей с дисбиозами кишечника, была низкой вне зависимости от количества микромицетов в 1 г исследуемого материала. Филамента-ция Candida spp. в 100% коррелировала с их адгезив-ностью и также не зависела от количества определяемых микромицетов.
3. Антагонистическая активность Candida spp., выделенных в количестве Lg3 КОЕ/г, была выявлена по отношению к Shigella sonnei S-форма, Proteus mirabilis 115, Staphylococcus aureus 209р. Эти тенденции сохранялись и в группе Candida spp., выделенных в количестве более Lg3 КОЕ/г. Однако показатели антагонистической активности в этой группе были на несколько порядков выше как по отношению к Staphylococcus aureus 209р, Proteus mirabilis 115, Shigella sonnei S-форма, так и против остальных тест-культур, к которым изначально показатели были невысокие: Salmonella typhimurium 307, Klebsiella pneumoniae 211,Escherichia соИЪА-Yl. Таким образом, антагонистическая активность Candida spp. возрастает параллельно с изменением содержания микромицетов в содержимом кишечника.
3. Лизоцим-продуцирующая, муколитическая и казеинолитическая способности Candida spp. усиливались при увеличении содержания микромицетов. Антиммуноглобулиновая активность имела тенден-
цию к повышению у культур Candida spp., выделен- 4. В целом, колонизирующая способность Candida ных в повышенном количестве. Антикомплемен- spp. возрастала при увеличении их содержания в КОЕ/г тарная активность была стабильно высокой в обеих исследуемого материала, группах Candida spp.
ЛИТЕРАТУРА
1. Samonis G. Gut: portal of entry do fungi in the immunocompromised hosts // Micol. Lek. — 2004. — Vol.ll, №2. — P.1272.
2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. — М.: «Медицина», 1999.- 341 с.
3. Валышева И.В., Валышев А.В., Карташова О.А., Бухарин О.В. Антилактофериновая активность Candida species 11 Ж. Проблемы медицинской микологии.-2004.-Т.6, №2.-С.65.
4. Микробиологическая диагностика дисбактериозов кишечника. / Пособие для врачей и студентов. — М., 1997. — 19 с.
5. Кашкин П.Н., Хохряков М.К., Кашкин А.П. Определитель патогенных, токсигенных и вредных для человека грибов. — Л.: «Медицина», 1979. — 268 с.
6. Брилис В.И.. Брилине ТА. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело.
— 1986. — №4. — С.210-212.
7. Кузиков А.Н.., Бондаренко В.М.., Аыкова Е.А. и др. Особенности казеинолитической активности содержимого толстой кишки при дисбиотических состояниях // ЖМЭИ.- 1998. — №1.- С.80-83.
8. Кюнкрикова И.Е. Биокоррекция микрофлоры кишечника в комплексной терапии и профилактике дисбактериоза: Дис...канд. мед. наук. — Волгоград, 2000. — 144 с.
9. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. Биргера М.О.- М..: Медицина, 1982,- 464 с.
10. Страчунский А.С., Козлов С.Н. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей — М.: «Боргес», 2002. — 436 с.
11. Елинов Н.П. Candida species и кандидемия. Состояние проблемы (обзор) // Ж. Проблемы медицинской микологии,- 2001,- Т.З, №1,- С.4-15.
12. Аисовская С.А., Глушко Н.И. Новые подходы в изучении адгезивных свойств патогенных штаммов Candida albicans //Ж. Проблемы медицинской микологии — 2006.- Т.8, №2.- С.58.
13. Шевяков М.А. Диагностика и лечение кандидоза кишечника //Тер. архив.-2003.-Т.75, вып. 11.- С.77-79.
14. Бухарин О.В., Васильева Н.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов. — Томск, 1985.-191 с.
15. Бухарин, О.В., Валышев А.В., Перунова Н.Б. и др. Бактериально-грибковые ассоциации кишечника в условиях колонизации дрожжеподобными грибами рода Candida //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.
— 2002. — вып.5,- С.45-48.
16. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение. — М., 2001. — 472 с.
Поступила в редакцию журнала 03.02.09 Рецензент: М.А.Шевяков
