CC BY
176
вании центрифугирования в технологических процессах.
ВЫВОДЫ
1. Экспериментально доказано существенное изменение липидной компоненты соевого гидролизата под действием центрифугирования.
2. Значительный рост степени окисленности липидов в осветленных гидролизатах может приводить к сокращению сроков хранения по сравнению с неосвет-ленными, что вызывает необходимость использования антиоксидантов, например, веторона.
ЛИТЕРАТУРА
1. Доморощенкова М.Л. Современные технологии получения пищевых белков из соевого шрота // Пищевая пром-сть. -2001. - № 4. - С. 5-11.
2. Траубенберг С .Е., Пивцаева М.М., Милорадо -
ва Е.В., Фугол О.А. Получение и применение ферментативных соевых гидролизатов // Междунар. конф. «Науч.-техн. прогресс в пере-раб. отраслях АПК», Москва, 16-18 мая, 1995: Тез. докл. — М., 1995. - С. 151.
3. Крепс Е.М. Липиды клеточных мембран. - Л.: Наука, 1981. - 340 с.
4. Goni F.M., Alonso A. Structure and functional properties of diacylglycerols in membranes // Prog. Lipid Res. - 1999. -38. - № 1. -P. 1-48.
5. Самойленко И.И., Борисенко Е.Г., Лысюк О.Г. Бактериальные токсины // Тез. докл. II Всесоюз. конф. - Юрмала, 1989. -С. 69.
6. Влияние центрифугирования на биохимические и физико-химические параметры липидов арахисовой питательной среды /
В.А. Меньшов, Л.Н. Шишкина, Е.Б. Бурлакова и др. // Прикл. биохимия и микробиология. - 1993. - ХХ1Х, вып. 3. - С. 442-448.
7. Траубенберг С.Е., Вяльцева И.В., Милорадова Е.В., Козлова А.А. Изучение кинетики действия ферментного препарата Бирзим П7 при гидролизе соевой обезжиренной муки // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2005. - № 2-3. - С. 54-57.
8. Asakawa T., Matsushita S. Coloring Conditions of Thiobarbituric Acid Test for Detecting Lipid Hydroperoxides // Lipids. -1980. - 15. - № 3. - Р. 137-140.
9. Itzhaki R., Gill D.M. A micro-biuretic method for estimating proteins // Anal. Biochem. - 1964. -9. - P. 401^10.
10. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. - 322 с.
11. Биологические мембраны. Методы. / Под ред. Дж. Б. Фиццлея, У.Г. Эванз. - М.: Мир, 1990. - 424 с.
12. Sperry W.M., Weeb M. A revision of the schoenheimer -sperry method for cholesterol determination // J. Biol. Chem. - 1950. -187. - № 1. - Р. 97-106.
13. Лакин Г.Ф. Биометрия. 3-е изд. - М.: Высш. шк., 1990.
- 293 с.
14. Каган В.Е., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов // Ито -ги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. Биофизика. - М., 1986. - 18.
- 136 с.
15. Шишкина Л.Н., Кушнирева Е.В., Смотряева М.А. Использование параметров системы регуляции перекисного окисления липидов для оценки биологических последствий сочетанного действия твина-80 и рентгеновского излучения в малой дозе // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2001. - 41. - № 3. - С. 301-306.
Кафедра аналитической химии
Поступила 24.10.05 г.
577.196+539
КОЛИЧЕСТВО И КА ЧЕСТВО БЕЛКА В ПРОДУКТАХ ПЕРЕРАБОТКИ ЛЬНЯНОГО ЖМЫХА
П.М. ПАХОМОВ, А.Л. ГРИГОРЬЕВА, А.Н. ПАНКРУШИНА,
С.Д. ХИЖНЯК, А.Н. СТЕБЛИНИН
Тверской государственн ыйуниверситет Всероссийский научно-исследовательский
проектно-технологический институт механизации льноводства Россельхозакадемии
На базе ВНИПТИ механизации льноводства разработана технология выделения белка из жмыха масличного льна, позволяющая извлекать более 50% от общего его количества, не менее 25% которого является легко перевариваемым [1]. Полученный белок представ -лен альбуминовой, глобулиновой, глютелиновой фракциями: 41, 37, 13% от суммы соответственно (9% составляет нерастворимый остаток).
О целесообразности выделения белка из жмыха льна свидетельствует благоприятный аминокислотный состав белков льна, близкий к стандартам ФАО [2]. Вместе с тем необходимо, чтобы в процессе технологической переработки конечный продукт не утрачивал своих ценных питательных свойств Применяемые в современных технологиях методы извлечения масла из семян имеют своей основой термическую обработку, приводящую к снижению растворимости белков,
разрушению многих ценных аминокислот, т. е. к снижению качества целевого продукта.
Для оптимизации процесса выделения белка и повышения его качества необходимо детальное изучение биохимического состава продуктов, получаемых на различных технологических стадиях с целью выявления степени ущерба, наносимого белкам на каждой из них.
Объектом исследования служил льняной жмых, полученный в Костромской, Пензенской областях и в Ставропольском крае (соответственно образцы 1, 2, 3). Для извлечения экстрактов льняного белка использовали запатентованную технологию его выделения [3]. Измельченный и откалиброванный льняной жмых смешивали с 7%-м раствором поваренной соли в соотношении 1 : 10. Сепарирование альбуминовой фракции белков проводили центрифугированием при 3000 об/мин. Полученный осадок смешивали с раствором гидроксида натрия, затем направляли на сепарирование при тех же условиях в течение 15 мин. Полученные растворы осаждали соляной кислотой, доводя кислотность раствора рН до 3,5-4,5. Надосадочную жидкость отделяли центрифугированием. При получении
экстрактов отбирались пробы по 50 мл для определения белка по методу Кьельдаля [4, 5]. Образцы осажденного белка высушивали при температуре до 50°С. Мокрое озоление образцов проводили концентрированной серной кислотой с селеном. Содержание общего азота и белка устанавливали по количеству отогнанного аммиака, связанного борной кислотой. Окончание отгонки определяли при помощи лакмусовой бумаги. Полученный раствор титровали 0,1 н серной кислотой, расчет количества общего азота и белка осуществляли по формуле [4]. Проводили два параллельных эксперимента. Погрешность опыта рассчитывали согласно общепринятым методам статистической обработки. Лабораторные исследования выполняли на базе лаборатории ВНИПТИМЛ Россельхозакадемии. О конформационных изменениях, происходящих в молекулах белков, судили по данным Фурье-ИК-спектро-скопии [6, 7]. Образцы для спектральных исследований готовили в виде таблеток с КВг. Запись спектров осуществляли на Фурье-ИК-спектрометре Equinox-55 фирмы Вгикег.
Содержание белка в исходном сырье (льняном жмыхе) не превышало 30%, что несколько ниже, чем указано в литературных данных.
В процессе холодного отжима белки сохраняют нативную конформацию, о чем свидетельствует положение полос поглощения Амид-1, Амид-П и Амид-111 при анализе ИК-спектров различных образцов жмыха (рис. 1). Поскольку полоса Амид-1 в образце 1 сдвинута к значению волнового числа 1646 см1, характеризующего параллельную Р-структуру, можно предположить, что белок имеет Р-конформацию. Белки образцов 2 и 3 представлены преимущественно а-конфор-мацией, о чем свидетельствует сдвиг полосы Амид-1 к значению частоты 1652 см1, показательной для а-спи-ралей и статистического клубка [8]. О сохранении нативной конформации белков свидетельствует также положение полосы Амид-1У с максимумом поглощения при значении 697 см-1, соответствующей частоте деформационных колебаний МН-групп
Экстракция солевым растворителем позволяет выделять до 35% белка льняного жмыха, при этом его концентрация в растворе составляет не более 13,6%. ИК-спектроскопия экстракта альбумина позволяет предположить, что в солевом растворе белок присутствует в форме а-спирали и статистического клубка. В
Пропускание [%]
ПЯ4
----1----------1----------1----------1----------1----------1------------
3500 3000 2500 2000 1500 1000 К см"1
Рис. 1
связи с тем, что в состав альбумина входят СООН-группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, МН2-группы лизина и аспарагина, МН-группы гистидина и триптофана, ОН-группы серина и тирозина, 88-, 8Н-, 8-СН2-группы цистеина, цистина, метионина и пептидные группы основной цепи (всего 585 остатков 17 типов аминокислот), то он способен к комлексооб-разованию при взаимодействии с хлоридом натрия [9, 10]. В результате образуются натриевые соли аминокислот, что подтверждается наличием полосы поглощения с максимумом при 1400 см-1, проявляющимся в ИК-спектрах экстрактов всех последующих стадий технологического процесса [11]. Вероятно, в процессе экстракции солевым растворителем образуются меж-молекулярные комплексы при помощи координационных связей по схеме [9, 10], что приводит к понижению растворимости в нейтральных и слабокислых растворителях.
Стадия сепарирования глобулинового раствора при помощи щелочного экстрагента позволяет выделять 32,4% от общего содержания белка, присутствующего в льняном жмыхе, что составляет 86,6% от всего объема глобулиновой фракции белка. Можно говорить о высокой эффективности стадии экстракции глобулинового раствора. Концентрация белка в щелочном экстракте глобулина несколько выше по сравнению с концентрацией альбумина в солевом экстракте и составляет 16,6%, что объясняется выделением и полисахаридов, растворимых в воде.
Анализ ИК-спектров глобулина, экстрагированно -го щелочью, и глобулина, обработанного после этого соляной кислотой (рис. 2: соответственно кривые 1 и 2), показывает, что под воздействием аномального рН происходит денатурация глобулина: в ИК-спектре глобулина отсутствует полоса поглощения Амид-11, а полоса Амид-Ш представлена слабо выраженным плечом. Форма полосы Амид-1 близка к ИК-спектру а-спирали белка, что доказывает разрушение третичной и вторичной структуры вследствие его денатурации [8]. Вероятно, денатурация глобулина происходит по типу «все или ничего», поскольку при последовательном переходе через ряд промежуточных состояний всего количества макромолекул, ранее имевших нативную структуру, их часть находилась бы в растворе в «полусвернутом» виде. ИК-спектр при таком характере распределения молекул имел бы более узкую
Пропускание [%]
Рис. 2
Пропускание [%]
3500 3000 2500 2000 1500 1000 Х.,см“:
Рис. 3
полосу Амид-I, так как часть молекул, уже не имеющих третичной структуры, но еще сохраняющих вторичную, обусловливала бы наличие колебаний в области, являющейся функцией конформации белковых молекул. Смещение полосы Амид-I от 1656 к 1646 см1, а также отсутствие полосы Амид-II (1529 см1) может свидетельствовать о переходе от a-спирали к b-форме. Только белки с небольшой молекулярной массой подвергаются денатурации по отмеченному типу. Следовательно, глобулиновая фракция льняного белка представлена преимущественно макромолекулами со сравнительно незначительной молекулярной массой.
ИК-спектры глобулина, обработанного кислотой, показывают, что условия денатурации глобулина в процессе отработки технологических стадий были подобраны таким образом, чтобы при этом не происходило разрыва белковой цепи макромолекулы, иначе рена-турация глобулина была бы невозможна.
Для прохождения эффективной ренатурации белка в условиях in vitro необходимо спонтанное восстановление архитектуры белка. При обработке кислотой рН раствора достигает физиологических условий, характерных для белков в нативном состоянии. Так как глобулин перед проведением нейтрализации находится в максимально развернутом состоянии, то, вероятно, вся информация для создания трехмерной молекулы белка заложена в химической последовательности аминокислот.
Так как макромолекула любого белка является по-лиамфолитом, то противоположно заряженные участки белковой цепи начинают самопроизвольно притягиваться, образуя контакты, способствующие последовательному сворачиванию a-спиралей и b-шпилек, которые затем слипаются в расплавленную глобулу согласно концепции О.Б. Птицына. Таким образом, изменение окислительно-восстановительного потенциала среды является одним из основных факторов самоорганизации белка. Наблюдающиеся в ИК-спектрах глобулина различия в интенсивности и форме полос Амид-II и Амид-III по сравнению со спектром белков льняного жмыха подтверждают предположение о прохождении самоорганизации белка через накопление метастабильного состояния молекул.
После проведения стадии осаждения (обработки соляной кислотой) наблюдается смещение полос по-
глощения валентных колебаний ОН-группы в сторону более низких частот в ИК-спектрах экстрагированного альбумина и глобулина соответственно: с 3424 до 3422 см-1 и с 3425 до 3394 см-1. Это свидетельствует о снижении уровня свободной и связанной интрамицел-лярной воды, в результате чего повышается степень гидрофобности белковых молекул (рис. 3: 1 - альбумин, обработанный хлоридом натрия; 2 - экстрагированный альбумин, обработанный соляной кислотой). Явление гидрофобности обусловлено особенностями строения белковой глобулы. В процессе взаимодействия неполярных участков с солевыми и щелочными растворителями происходит снижение энтропии на фоне возрастания свободной энергии, что способствует изменению конформации белковой молекулы. Вследствие падения энтропии воды происходит образование водородных связей между молекулами воды и функциональными группами белков. Таким образом, вокруг глобулы создается гидратная оболочка из фиксированных молекул воды [10]. Это может свидетельствовать о некотором снижении качественных показателей альбумина на данной технологической стадии.
Однако эффективность проведения стадии осажде -ния достаточно высока: она позволяет повысить концентрацию альбумина в растворе в 5, а глобулина - в 4 раза, что подтверждается ИК-спектрограммами конечного альбумина и глобулина (рис. 2, 3).
Стадия осаждения глобулина вносит существенный вклад в изменение конформации белковых молекул. Судя по сдвигу положения полос поглощения Амид-1 и Амид-11 в сторону более низких частот (с 1656 до 1646 см-1), после обработки кислотой увеличивается количество белков, имеющих Р-конформаци-онную структуру, что можно объяснить частичным кислотным гидролизом молекул белка, имеющих конформацию статистического клубка. О конформацион-ных изменениях белка свидетельствует и значительное усиление интенсивности полосы Амид-1 и ее сдвиг к значению 1646 см-1, более характерному для а-спира-ли.
Содержание белка в льняном жмыхе, промежуточных продуктах технологии и льняном белковом концентрате составляет, % на сухое вещество:
Льняной жмых 28,0 ± 1,0
Альбуминовый раствор 13,5 ± 0,1
Глобулиновый раствор 16,5 ± 0,2
Первичная сывороточная вода 25,7 ± 0,1
Вторичная сывороточная вода < 1,0
Вторичная жмыховая паста 12,9 ± 2,0
Нерастворимый остаток 6,10 ± 0,1
Льняной белковый концентрат 71,0 ± 3,0
Анализ технологических потерь белка на стадии сепарирования конечного продукта показывает, что они составляют 9,1%, что может быть связано с невысокой скоростью центрифугирования белкового раствора, позволяющей осаждать только высокомолекулярные белки. Аминокислоты и другие низкомолекулярные соединения переходят при этом в надосадочную жидкость. Интенсификация процесса осаждения позволяет
увеличить выход альбуминовой фракции на 25%. Так как осаждение белков основано на скорости седиментации, то оптимизировать процесс осаждения возможно при помощи ультрацентрифугирования, что повысит энергоемкость технологического процесса. Экстракция глобулина проводится более полно, а технологические потери с вторичной сывороточной водой составляют менее 1%.
Показателем общей эффективности разработанной технологии может служить тот факт, что процентное содержание белка в конечном продукте составляет не менее 70% что позволяет классифицировать его как белковый концентрат. По данным ИК-спектроскопии, можно заключить, что примеси в основном представлены натриевыми солями аминокислот, о чем свидетельствует полоса поглощения в диапазоне 1090-1295 см1.
Технологические отходы производства, представленные вторичной жмыховой пастой, содержат около 13% белка, большую часть которого составляет глюте-линовая фракция, при этом 6,7% белка приходится на нерастворимый остаток.
ВЫВОДЫ
1. Технология выделения белка из жмыха льна, разработанная сотрудниками ВНИПТИМЛ, позволяет достаточно полно экстрагировать как альбуминовую, так и глобулиновую фракцию белка. Полнота экстракции глобулина составляет 86,6%.
2. Увеличение процентного выхода белка возможно за счет модификации стадии осаждения альбумина, так как эта стадия дает наибольший вклад в технологические потери (40% всех потерь).
3. Анализ возможных конформационных изменений в молекуле белка позволяет оптимизировать технологический процесс извлечения белка и повысить его качество, проводя работу в направлении контролируемой самоорганизации белков.
4. Согласно выдвинутой гипотезе, экстракция глобулина проходит через стадию обратимой денатурации с последующей ренатурацией белка при нейтрализации среды.
5. Белковый продукт, получаемый в ходе реализации данной технологии, содержит не менее 70% льняного белка, что позволяет относить его к концентратам. Технология выделения белка из жмыха льна защищена патентом РФ [3].
ЛИТЕРАТУРА
1. Стеблинин А.Н., Григорьева А.Л. Оценка пищевых свойств льна // Технологии и технические средства производства: Сб. науч. тр. - Тверь, 2001. - С. 77-83.
2. Технологические аспекты применения семени льна в ле -чебно-профилактических целях / И. В. Ущаповский и др. // Там же. -С. 140-146.
3. Пат. 2232513 RU. Способ получения альбуминно-глобу -линового белка «линумина» из жмыха семян льна / А.Н. Стеблинин, А.Л. Григорьева, И.Э. Миневич и др. - Опубл. в БИПМ. - 2004. -№ 20.
4. Зоотехнический анализ кормов / Е.А. Петухова и др. -2-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1989. - 239 с.
5. Разумов В.А. Справочник лаборанта-химика. - М.: Рос-сельхозиздат, 1986. - 304 с.
6. Пахомов П.М. Спектроскопия полимеров. - Тверь,
1997. - 142 с.
7. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических молекул. - М.: Мир, 1965. - 210 с.
8. Дехант И. Инфракрасная спектроскопия полимеров / Пер. с нем. Э.Ф. Олейника. - М.: Химия, 1976. - 472 с.
9. Изучение комплексов альбумина с ионами тяжелых ме -таллов / М.В. Лавриенко, Д.В. Дылев, Г.Н. Подгорный и др. // Физи -ко-химия полимеров. Вып. 9. - Тверь, 2003. - С. 135-140.
10. Григорьева А.Л., Панкрушина А.Н., Пахомов П.М. ИК спектроскопическое исследование экстрактов льняного жмыха // Физико-химия полимеров. Вып. 10. - Тверь, 2004. - С. 167-171.
11. Socrates G. Infrared Characteristic Group Frequencies: Tables and Charts. Second Edition. - England. Chichester.: John & Sons Ltd, 1994. - 244 p.
Кафедра биомедицины
Поступила 05. 05. 05 г.
634.17:547.56
ФЕНОЛЬНЫЙ КОМПЛЕКС ДИКОРАСТУЩЕЙ ЕЖЕВИКИ
А.С. ДЖАБОЕВА, Р.М. ЖИЛОВА
Кабардино-Балкарская государственная сельскохозяйственная академия
В последние годы особое внимание привлекают вещества фенольной природы, так как некоторые их представители обладают противорадиационным, общим противовоспалительным и капилляроукрепляющим действием. В то же время фенольный состав некоторых дикорастущих ягод и плодов, в частности ежевики, изучен недостаточно.
Ежевика представляет собой наиболее многочисленный по числу видов подрод Subgenus Pubus рода Rubus L. У нас в стране эта культура развита слабо. Между тем в странах СНГ насчитывается 52 вида ежеви-
ки, причем большинство из них встречается на Кавказе.
Данные биохимического состава ежевики свидетельствуют не только о высокой пищевой ценности, но и о фармакологических свойствах этой культуры [1, 2 ]. Во многих странах ежевика используется как эффективное лекарственное средство. Ягоды оказывают общеукрепляющее, успокаивающее, умеренное желчегонное действие, обладают антимикробной активностью против & сшгеш\ положительно воздействуют при гипертонии и атеросклерозе [3]. Предполагают, что терапевтический эффект ежевики обусловлен во многом содержащимися в ней фенольными соединениями. Поэтому максимальное сохранение последних
