CC BY
261
Количественное определение выхода аберраций хромосом в костном мозге мыши при воздействии ионизирующей радиации и радиомодификаторов
Поздышкина О.В.
ФГБУ МРНЦ Минздрава России, Обнинск
Предложена модифицированная методика количественной оценки мутагенной активности гамма-излучения в диапазоне сублетальных доз (0,5-1,5 Гр) по выходу аберраций хромосом в костном мозге мыши с коротким сроком фиксации клеток. Продемонстрирована её высокая радиочувствительность и воспроизводимость. Методика позволяет получать цитогенетические препараты в течение одного рабочего дня.
Ключевые слова: мыши, костный мозг, аберрации хромосом, гамма-излучение, радиомодификатор.
Введение
Исследование мутагенной активности химических соединений по выходу аберраций хромосом в костном мозге мелких грызунов является общепризнанным, надёжным и весьма доступным методом [3-5, 7, 8]. Но попытка его непосредственного использования для количественной оценки радиационного воздействия приводит к непреодолимым трудностям, поскольку при рекомендуемых Фармкомитетом РФ сроках фиксации клеток [3, 5], в метафазных пластинках преобладают аберрации хромосомного типа [1, 6]. Идентификация же этих нарушений для ак-роцентрических хромосом, которыми преимущественно представлен кариотип мелкого грызуна, даже для высококачественных метафазных пластинок весьма затруднительна и ненадёжна, и вряд ли её можно считать количественной. По этой причине в настоящей работе предпринята попытка модификации методики с целью применимости её для количественной оценки мутагенной активности ионизирующей радиации с одновременным сохранением возможности оценки с её помощью мутагенной активности химического соединения.
Материалы и методы
В опытах использовали самцов и самок мышей линии Р1(СВДхС57 Bl) весом 14-15 г. Все мыши были разделены на две группы (по 12 мышей в каждой). В первой изучали выход аберраций хромосом в костном мозге после гамма-облучения в дозах 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 Гр при мощности дозы 0,5 Гр/мин (по 3 мыши на каждую дозу), во второй - после облучения в дозе 1,0 Гр в сочетании с радиопротектором цистамином [9] в концентрации 200 мг/кг веса (3 мыши), дозе
0,5 Гр с радиосенсибилизатором цисплатином [2] (в двух концентрациях: 3 мг/кг и 5 мг/кг) -6 мышей, и хорошо изученным, рекомендуемым в качестве положительного тест-контроля, препаратом циклофосфаном [3-5, 7, 8] в концентрации 20 мг/кг (без облучения) - 3 мыши. Все препараты вводили за 30 мин до облучения. Сразу после облучения мышам внутрибрюшинно вводили по 0,2 мл 0,025 %-ного раствора колхицина. Через 2 часа их поочередно забивали, начи-
Поздышкина О.В. - ст. научн. сотр., к.б.н. ФГБУ МРНЦ Минздрава России.
Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (48439) 9-71-64; e-mail: o.pozdyshkina@inbox.ru.
ная с первой группы. Из обеих берцовых костей извлекали костный мозг, вымывая его питательной средой, состоящей из 80 % среды ЯРМ! и 20 % эмбриональной сыворотки телят, раствор быстро ресуспендировали, доводя до объёма 3 мл, и помещали в термостат с температурой 37 °С.
На процедуру поочередного извлечения костного мозга и его ресуспендирование в каждой из групп в общей сложности уходило 30 мин. После этого все пробирки из группы помещали в центрифугу, центрифугировали в течение 15 мин, сливали надосадочную жидкость, и оставшиеся клетки гипотонизировали 0,075 %-ным раствором хлористого калия в течение 25 мин. Затем раствор снова центрифугировали, сливали жидкость, и после этого производили фиксацию клеток смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. В последующем из взвесей клеток приготавливали препараты и при световой микроскопии анализировали индуцированные тем или иным агентом повреждения хромосом.
Заметим, что в нашем эксперименте клетки костного мозга всех мышей первой и второй групп после забоя продолжали расти в общей сложности в течение 30 мин (либо в самой мыши, либо в термостате), поэтому время начала фиксации для всех них было одинаковым - 2,5 ч после облучения (оно определялось началом центрифугирования, лишающего клетки питательной среды).
В этой же работе было проведено изучение выхода аберраций хромосом после гамма-облучения в дозе 1 Гр (3 мыши) и воздействия циклофосфана (3 мыши) при сроке фиксации 24 часа, как это рекомендовано Фармкомитетом РФ [3-5, 7, 8].
Приготовление цитогенетических препаратов осуществлялось стандартным методом (без поджига), окраска - азур-эозином. На каждую точку анализировалось по 200-600 метафаз. Опыты по изучению выхода аберраций хромосом при различных дозах гамма-облучения были двухкратными. Результаты цитогенетического анализа представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Выход хромосомных аберраций (на 100 кл.) в костном мозге мышей при однократном воздействии гамма-излучения в диапазоне доз 0,5-2,0 Гр
Вид воздействия Число метафаз Хромосомный тип Хромати дный тип Общая частота аберраций
дицентрики центрические кольца ацентрики всего делеции всего
Фиксация клеток через 2,5 ч
Интактный контроль 300 - - 0,3 0,3±0,03 1,0 1,0±0,06 1,3±0,07
Облучение в дозе 0,5 Гр 600 1,3 0,7 1,5 3,5±0,8 32,8 33,7±2,4 37,2±2,5
Облучение в дозе 1,0 Гр 500 2,0 1,0 1,2 4,2±0,9 70,0 71,7±3,8 75,9±3,9
Облучение в дозе 1,5 Гр 200 0,5 _ 1,5 2,0±1,0 130 132,0±8,1 134,0±82
Облучение в дозе 2,0 Гр 200 - - - - 257,0 260,5±11,4 260,5±11,4
Фиксация клеток через 24 ч
Интактный контроль 300 - - 0,7 0,7±0,05 1,7 1,7±0,1 2,4±0,1
Облучение в дозе 1,0 Гр 300 4,5 3,5 6,2 14,2±1,9 2,3 2,3±0,9 16,5±2,3
Таблица 2
Выход хромосомных аберраций (на 100 кл.) в костном мозге мышей при воздействии гамма-излучения в сочетании с химическими модификаторами
Вид воздействия Число метафаз Хромосомный тип Хромати дный тип Общая частота аберраций
дицентрики центрические кольца ацентрики всего делеции всего
Фиксация клеток через 2,5 ч
Циклофосфан 20 мг/кг 200 - - - - 19,0 22,5±3,4 22,5±3,4
Цисплатин 3 мг/кг + 0,5 Гр 200 - - 0,5 0,5±0,5 41,0 41,5±4,6 42,0±4,6
Цисплатин 5 мг/кг + 0,5 Гр 200 2,0 0,5 5,0 7,5±1,9 80,0 85,0±6,5 92,5±6,8
Цистамин 200 мг/кг + 1,0 Гр 200 0,5 0,5 1,0 2,0±1,0 28,0 29,5±3,8 31,5±4,0
Фиксация клеток через 24 ч
Циклофосфан 20 мг/кг 200 0,5 0,5 2,0 3,0±1,2 18,0 22,0±3,3 25,0±3,5
Обсуждение результатов
Из таблиц 1 и 2 видно, что как однократное, так и сочетанное с радиомодификаторами ионизирующее излучение при фиксации клеток на 2,5 ч приводит, в основном, к выходу аберраций хроматидного типа. Частота же аберраций хромосомного типа в большинстве случаев была незначимой, и лишь при сочетанном воздействии гамма-облучения в дозе 1 Гр с максимальной концентрацией цисплатина (5 мг/кг) достигала 9,4 %. Из этого следует, что при выбранном нами сроке фиксации количественное определение выхода аберраций хромосом в костном мозге мыши может быть успешно выполнено. Очевидно, что это обусловлено тем фактом, что через 2,5 ч после облучения в митоз успевают войти лишь в2-клетки или клетки поздней Б-фазы митотического цикла. При этом радиочувствительность методики существенно выше, чем соответствующая при фиксации клеток на 24 ч. Так, при дозе 1 Гр в нашем случае общая частота аберраций достигала 75,9 аберр./100 кл., а при фиксации на 24 ч - только 16,5. Из этого следует, что статистическая нагрузка на точку в нашем случае снижалась по сравнению со стандартной в 4,5 раза. Что же касается данных по циклофосфану, то полученный в нашем эксперименте практически одинаковый выход аберраций хромосом при обоих сроках фиксации, по всей видимости, обусловлен задержкой деления наиболее сильно повреждённых клеток для срока 2,5 ч. Об этом свидетельствует тот факт, что при фиксации клеток на 24 ч общее число повреждённых клеток было значительно меньше, чем при сроке 2,5 ч: 12,5 % против 17,5 %. При этом в первом случае встречались клетки с большим числом аберраций (с 6-7 аберрациями), а при фиксации на 2,5 ч этого не наблюдалось, и максимальное число аберраций в поврежденной клетке не превышало 2.
Выполненное в нашем эксперименте поочередное вымывание костного мозга питательной средой и помещение клеток в термостат для продолжения роста при одновременном центрифугировании всех пробирок группы обеспечило хорошую сходимость результатов в каждой исследуемой группе (3 мыши на точку). О хорошей сходимости свидетельствовали также дан-
ные по однократному облучению, которые были получены в двух отдельных независимых экспериментах. Разброс данных не превышал 15 %, а в основном, составлял 5-10 %.
Исследование дозовой зависимости выхода общей частоты аберраций хромосом в диапазоне доз (0,5-2,0 Гр) показало, что вплоть до дозы 1,5 Гр она близка к линейной. При этом выход аберраций хромосомного типа хотя и остается незначимым, но продолжает регистрироваться. После дозы 1,5 Гр выход аберраций резко возрастает (со 134 до 260 аберр./100 кл.), а аберрации хромосомного типа полностью исчезают. Это говорит о том, что при дозе 2 Гр резко возрастает степень задержки деления облучённых клеток, так что через 2,5 ч после облучения в митоз вступают лишь 02-клетки. Отсюда следует, что предложенная методика с успехом может быть использована в диапазоне доз до 1,5 Г р.
Полученные нами данные по сочетанному воздействию различных доз гамма-квантов из исследуемого диапазона доз на клетки костного мозга мыши в сочетании с известными радиомодификаторами свидетельствуют о перспективности предложенной методики. Так, радиосенсибилизатор цисплатин при концентрации 5 мг/кг в сочетании с дозой 0,5 Гр приводил к увеличению общей частоты аберраций хромосом в 2,5 раза по сравнению с таковой при отдельно взятом облучении (уровень значимости эффекта р<<0,001); при меньшей концентрации (3 мг/кг) - эффект практически отсутствовал: 42,0 и 37,2 аберр./100 кл. соответственно. Радиопротектор цистамин в концентрации 200 мг/кг в сочетании с дозой гамма-квантов 1 Гр приводил к снижению общей частоты аберраций хромосом в 2,4 раза по сравнению с таковым при отдельно взятом облучении.
Выводы
Таким образом, предложенная в данной работе методика определения выхода аберраций хромосом в костном мозге мыши с фиксацией клеток на 2,5 ч при строгом соблюдении срока фиксации клеток, достигаемого путем поочередного вымывания костного мозга питательной средой и помещением суспензии клеток в термостат до начала одновременного центрифугирования образцов группы, может быть использована для количественной оценки мутагенной активности гамма-излучения в диапазоне сублетальных доз (0,5-1,5 Гр).
Ввиду высокой радиочувствительности, хорошей воспроизводимости метода, а также низкого спонтанного уровня аберраций хромосом в костном мозге используемой для анализа линии мышей Р1(СВДхС57 В1) [3-5, 7, 8] можно ожидать, что наиболее интересным аспектом приложения этой методики станут исследования в диапазоне малых доз.
В практическом плане преимущество короткого срока фиксации клеток неоспоримо. Оно позволяет провести эксперимент в течение одного рабочего дня, включая приготовление, окраску препаратов и оценку их пригодности для высококачественного цитогенетического анализа.
Автор выражает благодарность Л.П. Жаворонкову и О.И. Колгановой за техническую помощь в работе.
Литература
1. Зайнулин В.Г., Цапыгина Р.И. Анализ динамики индукции хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей //Радиобиология. 1987. Т. 27, Вып. 1. С. 130-132.
2. Канаев С.В. Принципы и обоснование химиолучевого лечения злокачественных опухолей //Практическая онкология. 2008. Т. 9, № 1. С. 1-8.
3. Методические рекомендации по оценке мутагенных свойств фармакологических средств. М.: Медицина, 1994. 40 с.
4. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах (методические указания). М.: Медицина, 1977. 12 с.
5. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. Критерии состояния окружающей среды. ВОЗ, Женева, 1989. 212 с.
6. Рябченко Н.И., Ульяненко С.Е., Антощина М.М. и др. Действие смешанного у-нейтронного излучения с различной мощностью дозы на содержание клеток в тимусе и хромосомы костного мозга мышей и лимфоцитов человека //Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. Т. 45, № 5. С. 592-598.
7. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность: методические указания. Вильнюс, 1989. 36 с.
8. Стрижельчик Н.Г. Оценка мутагенной активности новых вспомогательных фармацевтических веществ на млекопитающих //Вестник Харьковского национального университета. 2000. № 1. С. 54-57.
9. Ярмоненко С.П. Противолучевая защита организма. М.: Атомиздат. 1969. 264 с.
Quantitative estimation the induction of chromosomal aberrations in the mouse bone marrow cells exposed to ionizing radiation and radiomodifiers
Pozdyshkina O.V.
Medical Radiological Research Center of the Russian Ministry of Health, Obninsk
Modified method for quantitative estimation of y-radiation mutagenic activity in moderate doses (0,5-1,5 Gy) by chromosomal aberrations yield in mouse bone marrow cells by means of short time of cells fixation is described in the article. It demonstrates high radiosensitivity and repeatability. The method allows to obtain the cytogenetic preparations during one day.
Key words: mouse, bone marrow, chromosome aberrations, gamma-radiation, radiomodificator.
Pozdyshkina O.V. - Senior Researcher, C. Sc., Biol. MRRC.
Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: (48439) 9-71-64; e-mail: o.pozdyshkina@inbox.ru.
