CC BY
11
© Т.В.Абрамова, Е.Г.Рыбакина, И.Г.Каюков, 2003 УДК [616.61-002.17:S4-128.4].001.S
Т.В. Абрамова, Е.Г. Рыбакина, И.Г. Каюков
КОЛИЧЕСТВА КАТИОННЫХ БЕЛКОВ НЕЙТРОФИЛОВ И ЭКСПРЕССИИ КОМПЛЕМЕНТАРНЫХ И Fey-РЕЦЕПТОРОВ НА ИХ МЕМБРАНЕ ПРИ IgА-НЕФРОПАТИИ
T.V.Abramova, E.G.Rybakina, I.G.Kayukov
THE NUMBER OF NEUTROPHIL CATIONIC PROTEINS AND EXPRESSION OF COMPLEMENTARY AND Fey-RECEPTORS ON THEIR MEMBRANE IN IgA-NEPHROPATHY
Отдел общей патологии и патофизиологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН, Научно-исследовательский институт нефрологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, Россия.
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучить корреляции количественных и функциональных показателей нейтрофильно-гранулоци-тарных клеток при lgA-нефропатии у человека с функциональным состоянием почек и биохимическим составом крови. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Исследование проведено на 15 больных lgA-нефропатией. В качестве контроля была взята группа больных не-1дАмезангиально-пролиферативным гломерулонефритом (МезПГН), состоящая из 21 человека. Количество катионных белков нейтрофилов изучалось с помощью лизосомапьно-катионного теста. На мембране нейтрофилов исследовалась экспрессия эритроцитарных, комплементарных и Fcy-рецепторов. РЕЗУЛЬТАТЫ. Выявлены корреляции интенсивности экспрессии комплементарных и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофилов с уровнем протеинурии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Полученные нами данные позволяют предполагать, что одним из механизмов развития нарушения гломе-рулярного фильтра при lgA-нефропатии может быть механизм, опосредованный повышенным экзоцитозом катионных белков НГ. Возможно, СЗЬ- и Fcy-рецепторы мембраны НГтакже участвуют в повреждении гломерулярного фильтра при lgA-нефропатии. Механизмы повреждения почечной ткани НГ при lgA-нефропатии отличаются от механизмов при МезПГН. Ключевые слова: lgA-нефропатией, нейтрофил, катионные белки, СЗЬ-рецептор, Fcy-рецептор.
ABSTRACT
THE AIM of the investigation was to study the correlations of the quantitative and functional indices of the state of neutrophilic-granulocytic cells at IgA-nephropathy with the functional state of the kidneys and the biochemical composition of blood. PATIENTS AND METHODS. The investigation was performed in 15 IgA-nephropathy patients. The control group consisted of 21 patients with non-lgA mesangial-proliferative glomerulonephritis (Mes-PGN). The number of neutrophil cationic proteins was studied by the lysosomic-cationic test. Expression of erythrocytic, complementary and Fcg-receptors was investigated on the neutrophil membrane. RESULTS. The correlation of intensity of expression of the complementary and Fcy-receptors on the neutrophil membrane with the level of proteinuria was detected. CONCLUSION. The data obtained allow a suggestion that one of the mechanisms of the development of the glomerular filter in IgA-nephropathy might be a mechanism mediated by elevated exocytosis of cationic proteins of NG. C3b- and Fcy-receptors of NG might also be involved in injuring the glomerular filter in IgA-nephropathy. The mechanisms of injury of the renal tissue with NG in IgA-nephropathy differ from the mechanisms in Mes-PGN.
Keywords: IgA-nephropathy, neutrophil, cationic proteins, C3b-receptor, Fcy-receptor.
ВВЕДЕНИЕ
1^-нефропатия - самая распространенная форма первичного хронического гломерулонефрита, характеризующаяся мезангиальной пролиферацией, сегментарным склерозом клубочков и преимущественно гранулярными мезангиальными отложениями иногда сопровождаемыми отложениями ^О, СЗс и фибриногена в ткани почки [I].
^А-нефропатия была выделена в особую форму гломерулонефрита в 1968 году, но до сих пор этиология этого заболевания остается неизвестной [2]. Показано наличие структурной аберрации мо-
лекулы IgA при IgA-нефропатии [3]. Результаты исследования, проведенного Т. Sano и соавт., продемонстрировали, что IgA, выделенный из крови больных IgA-нефропатией, является молекулой О-гликозилированной в шарнирной области и обладает так называемыми гломерулофильными свойствами [I]. Нарушения в строении молекулы IgA приводят к повышенному отложению иммунных комплексов с IgA в клубочках, за которым следует инфильтрация почечной ткани нейтрофиль-ными гранулоцитами (НГ). На наличие гломеру-лярной нейтрофильно/моноцитарной инфильтрации
в период обострения IgA-нефропатии указывают многие авторы [4,5], хотя имеются данные, что при IgA-нефропатии лейкоцитарная инфильтрация в клубочках в основном представлена моноцитами/ макрофагами [6]. Предполагается, что эти клетки участвуют в повреждении клубочков.
В литературе уделяется большое внимание ок-сидантным механизмам деструкции почечной ткани при IgA-нефропатии. Имеются данные о высокой продукции активных форм кислорода ней-трофилами периферической крови, приводящей к выраженным гистологическим повреждениям почечной ткани при IgA-нефропатии [7]. Считают, что повышение активности НГ при IgA-нефропатии связано с особой формой IgA. Этот измененный иммуноглобулин вызывает мобилизацию кальция и продукцию свободно-радикального кислорода НГ [8]. Кроме того, продукция перекиси водорода НГ после стимуляции агрегированным IgG или зимо-заном выше у больных IgA-нефропатией [4]. Н.С. Chen и соавт. исследовали воздействие нейтрофи-лов, активированных N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином, на выживаемость мезангиоцитов, продукцию эндотелина-1 и экспрессию мРНК эн-дотелина-1 мезангиальными клетками почечных клубочков крыс при их совместном культивировании. Показано, что НГ больных IgA-нефропатией повышали продукцию эндотелина-1 в значительно большей степени по сравнению с нейтрофилами больных мезангиально-пролиферативным гломеру-лонефритом (МезПГН) и здоровых доноров. Интенсивность экспрессия мРНК эндотелина-1 соответствовала степени повышения уровня эндо-телина-1. Продемонстрирована гибель значительного количества мезангиальных клеток после инкубации с активированными нейтрофилами. Активированные N-формил-метионил-лейцил-фе-нилаланин нейтрофилы больных IgA-нефропатией продуцируют больше супероксида, чем нейтрофи-лы больных МезПГН и здоровых доноров. Авторы сделали вывод, что активированные N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином нейтрофилы больных IgA-нефропатией повышают клеточную гибель и продукцию эндотелина-1 гломерулярными мезангиальными клетками через высвобождение супероксида [9].
Более точные механизмы и динамика развития повреждения почечной ткани активными формами кислорода не известны.
Нейтрофилы, по-видимому, также могут участвовать в повреждении почечной ткани при IgA-нефропатии, реализуя свои неоксидантные механизмы. Нейтрофильные гранулы содержат много гидролитических ферментов и антимикроб-
ных полипептидов, которые могут вызывать повреждения стенок сосудов. Например, катионные белки, выделенные из лизосомальных гранул ней-трофилов, повышают сосудистую проницаемость in vivo. Протеазы разрушают базальную мембрану сосудов in vivo и in vitro и выделенная из нейтро-филов гепараназа быстро разрушает гепаран сульфат субэндотелиального вещества in vitro [10].
K.N. Lai считает, что терапевтические попытки снизить повреждение почечной ткани при данном заболевании должны быть нацелены на предотвращение появления мезангиальных IgA-отложений и восстановление повреждений, вызванных инфильтрирующими нейтрофилами и высвободившимися цитокинами [3]. Таким образом, можно заключить, что НГ принимают активное участие в развитии IgA-нефропатии, но их механизмы в патогенезе данного заболевания недостаточно ясны.
Цель настоящей работы заключается в изучении корреляций количественных и функциональных показателей нейтрофильно-гранулоцитарных клеток при IgA-нефропатии у человека с функциональным состоянием почек и биохимическим составом крови.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на 15 больных IgA-нефропатией. В качестве контроля была взята группа больных не-IgA МезПГН, состоящая из 21 человека. Все пациенты проходили обследование и лечение в нефрологических отделениях №1 и №2 клиники пропедевтики внутренних болезней Санкт-Петербургского государственного медицинского университета (СПбГМУ) им. акад. И.П. Павлова. У всех обследованных больных функция почек была сохранена. Обследование проведено до начала патогенетической терапии. Всем пациентам для установления диагноза хронического гломеру-лонефрита была проведена прижизненная нефро-биопсия. Морфологическое исследование ткани нефробиоптата выполняли с помощью световой и иммунофлюоресцентной микроскопий. Диагноз IgA-нефропатии был поставлен на основании наличия отложений IgA, Х- и k-легких цепей иммуноглобулинов в свежезамороженных срезах почечного биоптата. У больных МезПГН отложения IgA в почечной ткани при иммунофлюоресцен-тном исследовании не были выявлены. Иммунофлюоресцентное исследование нефробиоп-тата было проведено нами в лаборатории клинической иммунологии и морфологии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова НИИ нефрологии. Анализ срезов ткани почки на световом уровне выполнила
г8 =-0,560 р=0,029
Рис.1. Корреляция интенсивности экспрессии СЗЬ-рецеп-торов на мембране НГ с уровнем суточной протеинурии у больных 1дА-нефропатией (ось ординат - суточная протеи-нурия, г/сут; ось абцисс - НГСЗЬ.%).
г=0,732 р=0,002
Рис.2. Корреляция интенсивности экспрессии Рсу-рецеп-торов на мембране НГ с уровнем суточной протеинурии у больных 1дА-нефропатией (ось ординат - суточная протеи-нурия, г/сут; ось абцисс - НГ Рсу %).
г8 =-0,800 р=0,00034
Рис.3. Корреляция интенсивности экспрессии Рсу-рецеп-торов на мембране НГ с концентрацией сывороточного альбумина - у больных 1дА-нефропатией (ось ординат -альбумин, г/л; ось абцисс - НГ Рсу %).
с.н.с. И.К. Клемина. Изучение НГ было осуществлено на базе Отдела общей патологии и патофизиологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН. Забор крови для исследования НГ производили из локтевой вены в стандартных условиях (утром, натощак). Суммарное содержание катионных белков в НГ периферической крови определяли по методу В.Е. Пигаревского Лизосомально-катионным тестом
(ЛКТ) с последующим вычислением цитохимического показателя [II]. Изучение экспрессии рецепторов на мембране НГ проводили методом розеткообразования. НГ выделяли из гепаринизи-рованной периферической крови в желатиновом градиенте. Для определения уровня экспрессии рецепторов к эритроцитам барана (Е) на мембране НГ использовали бараньи эритроциты, сохранявшиеся в консерванте Олсвера при 1; = 4°С до 10 дней, после трехкратного отмывания 0,9% №С1 и разведенных средой 199 до 0.5% концентрации.. Для определения комплементарных (СЗЬ) рецепторов на мембране НГ использовали метод розеткообразо-вания с эритроцитами барана, сенсибилизированными антителами в присутствии мышиного комплемента. В качестве гемолитической сыворотки использовали сыворотку кроликов, иммунизированных эритроцитами барана [12]. Для выявления Бсу-рецепторов на мембране НГ использовали человеческие эритроциты резус-отрицательной АВ (4) группы крови, фиксированные в 6% растворе формалина и обработанные ^О-антителами [1З]. Подсчитывали процент клеток, образующих розетки по отношению к общему количеству лейкоцитов.
У обследованных пациентов выполняли исследование общего анализа мочи с определением уровня эритроцитурии и протеинурии. Кроме того, у этих же больных определяли суточную экскрецию белка с мочой (суточная протеинурия - СП). В целях определения функций почек исследовали скорость клубочковой фильтрации (СКФ), которая оценивалась по клиренсу эндогенного креатинина. В сыворотке крови измеряли концентрацию общего белка (ОБС), альбумина, мочевины и холестерина. Все эти исследования проводились дважды, в день забора крови на изучение состояния НГ и спустя 7-10 дней.
При статистической обработке данных вычисляли коэффициенты линейной корреляции Пирсона (г) и непараметрические коэффициенты Спирмена г) За достоверные принимались значения р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В обеих группах значение цитохимического коэффициента ЛКТ и относительного содержания НГ, экспрессирующих на своей мембране эритроцитар-ные, Бсу- и СЗЬ-рецепторы, коррелировали с данными лабораторных исследований, полученными спустя 7-10 дней после анализа функций НГ периферической крови с большей достоверностью, чем с этими же данными, полученными в день исследования функций НГ.
У пациентов ^А-нефропатией величина ЛКТ коррелировала только с уровнем эритроцитурии
(г = - 0,570; р = 0,026). У больных МезПГН такой взаимосвязи не выявлено.
Обнаружена отрицательная непараметрическая корреляция уровня экспрессии эритроцитарных рецепторов на мембране НГ со скоростью клубоч-ковой фильтрации у пациентов с IgА- нефропатией (г8 = -0,567; р = 0,027). Тогда как при не-^А МезПГН выявлена прямолинейная положительная корреляция между уровнем экспрессии эритроци-тарных рецепторов на мембране НГ и СКФ (г=0,481, р=0,027).
У пациентов с IgА-нефропатией относительное количество НГ, несущих на своей мембране СЗЬ-рецепторы, корреляционно связано с концентрацией белка в моче (г8 =-0,545, р=0,0З57) и, как и следовало ожидать, с суточной протеинурией, причем с более высокой степенью достоверности (рис.1). Однако ОБС и концентрация альбумина в сыворотке крови не коррелировали с уровнем экспрессии комплементарных рецепторов на мембране НГ периферической крови.
Интенсивность экспрессии Бсу-рецепторов на НГ при IgА-нефропатии коррелировала с концентрацией белка в моче (г=0,6ЗЗ , р=0,011) и соответственно с большей степенью достоверности, с СП (рис. 2). Относительное содержание НГ с Бсу- рецепторами на своей мембране непараметрически связано с ОБС (г = -0,672, р=0,0061) и с концентрацией альбумина в сыворотке крови (рис.З). У больных МезПГН таких взаимосвязей не выявлено. Следует подчеркнуть, что у этих пациентов интенсивность экспрессии Бсу-рецепторов на НГ коррелирует с количеством эритроцитов в моче (г=0,596 , р=0,006).
Корреляций изученных нами показателей функций НГ с уровнем лейкоцитурии, содержанием мочевины и холестерина в сыворотке крови выявлено не было.
ОБСУЖДЕНИЕ
Высокая степень корреляции изменений показателей ЛКТ и выраженности эритроцитурии при ^А-нефропатии, вероятно, может быть связано с выходом катионных белков из НГ, которые могут повреждать гломерулярный фильтр. Это предположение косвенно потверждает результаты исследований В.И Наумовой и соавт., выявившие повышение трипсиноподобной протеазной активности и химотрипсиноподобной протеазной активности крови и мочи у детей, больных IgА-нефропатией [14]. Повышение трипсиноподобной протеазной активности может быть обусловлено присутствием в крови и моче нейтрофильного катепсина О, а химотрипсиноподобной - присутствием нейтро-
фильной эластазы. Эти данные, по мнению авторов, могли бы быть основанием для включения некоторых ингибиторов протеаз в комплексную терапию IgA-нефропатии.
Известно, что поражение почечной ткани при хроническом гломерулонефрите проявляется про-теинурией. В 1997 году J.B. Lefkowith были опубликованы данные, полученные на модели экспериментального гломерулонефрита. Показано, что миграция НГ в почечную ткань является ком-плементзависимой и опосредуется активацией ß2-интегина [15]. При IgA-нефропатии нами выявлено, что концентрация белка в моче и уровень СП отрицательно коррелируют с относительным количеством в периферическом русле НГ, несущих СЗЬ-рецепторы, которые соответствуют CD11b/CD18 и принадлежат классу ßP-интегинов. Интерпретировать полученные данные, не изучая количество НГ, экспрессирующих СЗЬ-рецепторы, в почке необходимо с большой осторожностью. Не исключено, что при низком уровне этих клеток в крови их количество в почечной ткани может быть увеличено. В этом случае, возможно, это связано с миграцией НГ, несущих СЗЬ-рецептор, в почечную ткань и их повреждающим действием на гломеру-лярный фильтр. Т. Tang и соавт. (1997) на экспериментальной модели гломерулонефрита доказали усиление повреждения почечной ткани НГ активированными иммунными комплексами, адгезия которых была обусловлена поддерживающим эффектом СЗЬ-рецептора. В этой же работе Т. Tang и соавт. указывают на функциональное взаимодействие Мас1 с Fcy-рецепторами на мембране НГ [16]. Это объясняет полученные нами данные, касающиеся корреляции концентрации белка в моче, СП и интенсивности экспрессии Fcy-рецепторов на мембране НГ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные нами данные позволяют предполагать, что одним из механизмов развития нарушения гломерулярного фильтра при IgA-нефропатии может быть механизм, опосредованный повышенным экзоцитозом катионных белков НГ. Возможно, СЗЬ- и Fcy-рецепторы мембраны НГ также участвуют в повреждении гломерулярного фильтра при IgA-нефропатии. Механизмы повреждения почечной ткани НГ при IgA-нефропатии отличаются от механизмов при МезПГН.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Sano Т, Hiki Y, Kokubo Т et al. Enzymatically deglycosylated human lgA1 molecules accumulate and induce inflammatory cell reaction in rat glomeruli. Nephrol Dial
Transplant 2002; 17(1): 50 -56
2. Berger J, Hinglais N Les depots intercapillaries d'IgA-IgG. J Urol Nephrol 1968; 74: 694-695
3. Lai KN. Future directions in the treatment of IgA nephropathy. Nephron 2002; 92 (2): 263-270
4. Chen HC, Tomino X Yaguchi Y et al. Oxidative metabolism of polymorphonuclear leukocytes (PMN) in patients with IgA nephropathy. J Clinic Lab Anal 1992; 6 (1): 35-39
5. Kincaid-Smith P, Nicholls K, Birchall I. Polymorphs infiltrate glomeruli in mesangial IgA glomerulonephritis. Kidney Int 1989; 36(6): 1108-1111
6. Soma J, Saito T, Ootaka T, Sato H, Abe K Differences in glomerular leukocyte infiltration between IgA nephropathy and membranoproliferative glomerulonephritis. Nephrol Dial Transplant 1998; 13: 608-616
7. Ventura MT, Gesualdo L, Capobianco V et al. Effects of in vitro nutrient supplementation on polymorphonuclear cell respiratory burst in primary IgA nephropathy. Clin Nephrol 1995; 43(1): 14-19
8.Lai KN, Leung JC. Heat-aggregated IgA prepared from patients with IgA nephropathy increases calcium mobilization and superoxide production of human neutrophils in vitro. Nephron 1993; 64(1): 129-135
9. Chen HC, Guh JY Chang JM, Lai YH. Differential effects of FMLP-activated neutrophils from patients with IgA nephropathy enhanced endothelin 1 production of glomerular mesangial cells. Nephron 2001 ; 89 (3): 274-279
10. Matzner Y Bar NM, Yahalom J et al. Degradation of
heparan sulfate in the subendothelial extracellular matrix by a readily released heparanase from human neutrophils: Possible role in invasion through basement membranes. J Clin Invest 1985; 76:1306-1313
11. Лизосомально-катионный тест. В:. Пигаревский BE (ред.) Клиническая морфология нейтрофильных грануло-цитов. Л. 1988: 87-102
12. Петрова ИВ, Шкурко ВИ, Арапова ОЮ, Васильева ЛП. Определение розеткообразующих клеток, комплемента и комплементфиксирующиех антител в клинике аутоиммунных и иммунодефицитных заболеваний. Методические рекомендации. НИИ травматологии и искусственных органов МЗСССР. М.,1980
13. Новиков Д.Н. Справочник по клинической иммунологии и аллергологии. Минск: Беларусь; 1987
14. Наумова ВИ, Михайлова ЗМ, Панченко ЕЛ и др. Течение и исход lgA-гломерулонефрита. Тер архив 1996; 6: 82-84
15. Lefkowith J.В. Leukocyte migration in immune complex glomerulonephritis: role of adhesion receptors. Kidney Int 1997; 51(5): 1469-1475
16. Tang T, Rosenkrnz A, Assmann KZM et al. A role for Mac-1 (CD11b/CD18) in immune complex-stimulated neutrophil function in vivo: Mac-1 deficiency abrogates sustained Fey - receptor-dependent neutrophil adhesion and complement-dependent proteinuria in acute glomerulonephritis. J Exp Med 1997; 186 (11): 1853-1863
Поступила в редакцию 17.06.2003 г.
