CC BY
17
УДК 616-006.81-092.4:576.3.08
КОЭКСПРЕССИЯ ВИМЕНТИНА И ЦИТОКЕРАТИНОВ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА
Т.А. Богуш1, С.А. Калюжный1, А.А. Башарина1, Е.А. Богуш1, В.Ю. Кирсанов2, В.С. Косоруков1, О.С. Бурова1, М.М. Давыдов2, М.А. Барышникова1
(1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации; 2Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет); *e-mail: tatbo-gush@mail.ru)
Методом двойного иммунофлуоресцентного окрашивания и проточной цитоф-луориметрии при исследовании 7 клеточных линий выявлена молекулярная гетерогенность клеток метастатической меланомы человека. Показано, что лишь незначительная популяция клеток (до 10%) презентирует только основной маркёр меланомы - виментин. Существенно большее число клеток (от 25 до 50%) экспресси-руют только эпителиальные цитокератины. Впервые выявлен доминирующий молекулярный фенотип - коэкспрессия виментина и цитокератинов в 50-80% клеток исследованных линий меланом. Предполагается, что именно этот фенотип клеток меланомы может рассматриваться как молекулярный маркёр агрессивности и метастатического потенциала новообразований.
Ключевые слова: иммунофлуоресцентный анализ, проточные цитофлуориметр, виментин, цитокератины, меланома.
До настоящего времени основным молекулярным маркёром меланом, как в опухолях человека и животных, так и в культурах клеток, служит белок промежуточных филаментов разных тканей мезодермального происхождения. При этом в ряде случаев в клетках меланомы выявляются и эпителиальные промежуточные филаменты - цитокератины. Впервые это было продемонстрировано в конце 80-х годов XX в. [1].
В дальнейшем экспрессия эпителиальных цитокератинов, наряду с виментином, была подтверждена при исследовании не только культур клеток, но и ткани меланомы человека [2, 3]. Более того, при повышении уровня экспрессии цитокератинов было показано изменение ряда характеристик клеток меланомы - увеличение миграционной активности на культурах клеток и метастического потенциала в опытах на животных [4]. При этом нокаут гена белка ци-токератина 18 приводил к уменьшению миграционной активности по сравнению с исходной клеточной культурой [4].
Заметим, что аналогичные изменения в поведении клеток отмечены при так называемом феномене эпителиально-мезенхимальной трансформации [5]. В этом случае de novo экспрессия
мезенхимального белка виментина в эпителиальных опухолевых клетках, экспрессирующих специфические цитокератины, представляет собой клинически значимый неблагоприятный маркёр агрессивности течения онкологического заболевания [6, 7].
Попытки оценить прогностическую значимость экспрессии в ткани меланомы эпителиальных цитокератинов не привели к определенному выводу [2, 8]. По нашему мнению, эта неопределенность обусловлена тем, что не решен фундаментальный вопрос: что означает выявление в культуре клеток или ткани меланомы, наряду с виментином, цитокератинов? Следует это рассматривать как экспрессию белков в разных опухолевых клетках или коэкспрессию белков в одних и тех же опухолевых клетках?
Мы попытались ответить на этот вопрос при исследовании экспрессии и коэкспрессии ви-ментина и цитокератинов в культурах клеток меланомы человека, которые были получены и запатентованы ранее.
Материалы и методы
Исследование проведено на шести клеточных линиях меланомы те1 М1р, те1 Н, те1 Яао,
mel Kor, mel Ibr, mel IL, полученных и запатентованных в лаборатории, а также на линии SK-MEL-2 (ATCC HTB-68) из коллекции The Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Все клеточные линии получены из метастатических узлов меланомы кожи в мягкие ткани и лимфоузлы.
В работе использован ассоциированный с проточной цитометрией метод двойного иммуно-флуоресцентного анализа, разработанный и запатентованный ранее в нашей лаборатории [9, 10]. Одноклеточную суспензию в течение 15-20 ч инкубировали с первичными моноклональными антителами к широкому спектру цитокератинов (панцитокератины, клон MNF116, «DAKO», США), затем в течение 1 ч инкубировали с антителами к мезенхимельному белку вименти-ну (клон SP20, «BIOCARE», США) и 1,5 ч - с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромами DyLight488 (ab96899, Великобритания) или DyLight650 (ab96899, Великобритания). После этого для удаления из анализа дебриса и эритроцитов клетки в течение 15 мин инкубировали с красителем ДНК Hoechst 33258 («Sigma-Aldrich», США).
Флуоресценцию клеток измеряли на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США). Для визуализации распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции в разных каналах проточного цитофлуориметра использовали точечные диаграммы, построенные в программе WinMDI
2.9. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы GraphPad Prism 7.0 («GraphPad Software», США).
Результаты и обсуждение
Результаты оценки в культурах клеток меланомы человека показателей экспрессии вимен-тина и цитокератинов, а также коэкспрессии маркёров представлены в таблице. В исследованных культурах меланом содержание клеток, экспрессирующих только основной молекулярный маркёр меланом - виментин, было минимальным и колебалось от 1 до 12%. Доля клеток, экспрессирующих только эпителиальные цитокератины, была существенно более значительной. Лишь в двух культурах клеток (№ 1 и № 5) содержание клеток, экспрессирующих ци-токератины, составляло менее 20%, тогда как в остальных - от 24 до 46%. Важно отметить, что при оценке коэффициента корреляции Спирме-на не было выявлено связи между двумя этими показателями (r = -0,67; 95% CI: (-0,94) - 0,14; p = 0,09).
Иной оказалась ситуация с количеством клеток, коэкспрессирующих оба маркёра в одних и тех же клетках (виментин и цитокератины). Видно, что разброс значений этого показателя значительно меньше по сравнению с показателями экспрессии только виментина или только цитокератинов, однако в некоторых случаях различия достигали полутора раз (например, № 4 и № 2).
Доля клеток, экспрессирующих мезенхимальный маркёр виментин и эпителиальные цитокератины в культурах клеток меланомы человека
Номер образца Линия клеток меланомы Доля клеток, экспрессирующих маркёры, %*
только виментин только цитокератин коэкспрессия виментина и цитокератина
1 mel Mtp 1 39 60
2 mel IL 9 11 80
3 mel H 6 17 77
4 mel Ibr 2 46 52
5 mel Kor 1 25 74
6 mel Raс 12 24 64
7 SK-MEL-2 1 46 53
*Представлены результаты одного из трех анализов, при повторном проведении которых различия в значениях показателей не превысили 3%; **долю клеток (%), экспрессирующих маркёры, рассчитывали по отношению к суммарному числу окрашенных клеток.
Клетки линии mel IL
104
8 юз —
н г
1-1
ю1
10°
9% 80%
'ШШ?'
■ ¡¿ä
11%
10° 101 102 103 104 FL 1 INT LOG
Quad* Events**
UL 316
UR 2809
LL 1495
LR 380
Клетки линии mel Ibr
104
8 103
J
H
г
J Ь
101
10°
2% 52% '¿шшКуtV/
'•УЙЩстВ • • * ' "и.» ' 46%
10°
10'
102
FL1 INT LOG
103 104
Quad* Events**
UL 72
UR 1550
LL 1987
LR 1391
Точечные диаграммы распределения клеток меланомы по интенсивности флуоресценции при количественной оценке уровня экспрессии виментина, цитокератинов или коэкспрессии этих маркёров. По оси абсцисс - интенсивность внутриклеточной флуоресценции (усл. ед.) красителя DyLight488, по оси ординат - интенсивность внутриклеточной флуоресценции (усл. ед.) красителя DyLight650. В таблицах под диаграммами: Quad* - обозначение квадранта, UL - верхний левый (клетки, экспрессирующие ви-ментин), UR - верхний правый (клетки, коэкспрессирующие виментин и цитокератины), LL - нижний левый (автофлуоресценция клеток после инкубации с вторичными антителами) и LR - нижний правый (клетки, экспрессирующие цитокератины); Events** - число клеток в каждом квадранте; долю клеток (процентное содержание указано на рисунках в квадрантах) с экспрессией маркёра рассчитывали относительно суммы окрашенных клеток
Реальные точечные диаграммы, полученные при двойном иммунофлуоресцентном окрашивании клеточных культур меланомы линий mel IL и mel Ibr представлены на рисунке.
Видно, что в культуре клеток линии mel IL подавляющее число клеток (80%) составляет популяция с фенотипом коэкспрессии вимен-тина и цитокератинов, тогда как в культуре Ibr доля таких клеток в 1,5 раза меньше (52%). Более того, культуры значительно отличаются и по количеству клеток, экспрессирующих только цитокератины (11 и 46% в клетках линии mel IL и mel Ibr соответственно). Что касается клеток, экспрессирующих только виментин, то их доля низка в обоих случаях (2 и 9%).
Таким образом, эти результаты в совокупности с данными, представленными в таблице, демонстрируют значительные фенотипические различия исследованных клеточных культур ме-ланомы человека.
Заключение
При исследовании клеточных линий меланомы человека выявлены различия количественных показателей экспрессии и коэкспрессии мезенхимального маркёра виментина и эпителиальных цитокератинов, что свидетельствует о выраженной молекулярной гетерогенности клеток меланомы. Подчеркнем, что речь идет о гетерогенности именно клеток, а не культур, так как экспрессия двух маркёров оценена одновременно в каждой из исследованных клеток. Это стало возможным благодаря применению разработанного авторами метода двойного иммуно-флуоресцентного окрашивания с использованием проточной цитофлуориметрии.
Анализ полученных результатов показывает, что лишь незначительная популяция клеток (до 10%) презентирует только основной маркёр меланомы - виментин. Существенно большее число клеток меланомы в культуре (от 25 до 50%)
может экспрессировать только эпителиальные цитокератины. С нашей точки зрения, особенно важным представляется то, что во всех культурах отчетливо выявляется доминирующий молекулярный фенотип клеток. Это клетки, коэк-спрессирущие не только виментин, но и разные эпителиальные цитокератины.
Таким образом, удалось ответить на поставленный в работе вопрос: что означает описанная в литературе экспрессия в культурах клеток меланомы виментина и цитокератинов - экспрессию маркёров в разных клетках или ко-экспрессию в одних и тех же опухолевых клетках? Показано, что молекулярный фенотип клеток меланомы в культуре гетерогенный и, наряду с клетками, экспрессирующими только один маркёр, доминирующая популяция презентиру-ет и виментин, и цитокератины. Возможно, это характерная особенность исследованных культур клеток, так как все они получены из ткани метастазов меланомы (см. раздел «Материалы и методы»).
Возвращаясь к работе, в которой было показано, что выявление в культурах меланомы эпителиальных цитокератинов коррелирует
с повышенным миграционным и метастатическим потенциалам клеток, а нокаут генов ци-токератинов, напротив, уменьшает проявление этих агрессивных свойств клеток меланомы [4], можно предположить, что именно количество клеток, коэкспрессирующих виментин и цито-кератины, а не уровень экспрессии одного или другого маркёра может характеризовать агрессивность и метастатический потенциал новообразования. По существу, прослеживается прямая аналогия с известным фактом, что потенциально более агрессивны эпителиальные опухолевые клетки с коэкспрессией цитокератинов и мезенхимального белка виментина [7, 8]. Работа выполнена в рамках программы исследований, запланированных в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (тема НИР: «Маркёры стволовой опухолевой клетки меланомы человека», рег. № AAAA-A16-116122210048-6). Конфликта интересов нет. Дополнительной информации нет. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием людей или животных в качестве объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Trejdosiewicz L.K., Southgate J., Kemshe-ad J.T., Hodges G.M. // Exp. Cell Res. 1986. Vol. 164. N 2. P. 388.
2. Banerjee S.S., Harris M. // Histopath. 2000. Vol. 36. N 5. P. 387.
3. Korabiowska M., Fischer G., Steinacker A., Stachura J., Cordon-Cardo C., Brinck U. // Anticancer Res. 2004. Vol. 24. N 5B. P. 3203.
4. Hendrix M.J.C., Seftor E.A., Chu Y.W., Seftor R.E.B., Nagle R.B., McDaniel K., Leong S.P.L., Yohem K.H., Leibovitz A.M., Meyskens F.L., Conaway Jr.D., Welch D.R., Liotta L.A., StetlerStevenson W. // J. Natl. Cancer Inst. 1992. Vol. 5. N 84. P. 165 (DOI: 10.1093/jnci/84.3.165).
5. KendaSuster N., Smrkolj S., Virant-Klun I. // J. Ovarian Res. 2017. Vol. 10. N 1. P. 11 (DOI: 10.1186/s13048-017-0306-7).
6. Davidson B., Holth A., Hellesylt E., Tan T.Z., Huang R.Y., Trope C., Nesland J.M., Thiery J.P. // Hum. Pathol. 2015. Vol. 46. N 1. P. 1 (DOI: 10.1016/j. humpath.2014.10.004).
7. Wu D.I., Liu L., Ren C., Kong D., Zhang P., Jin X., Wang T., Zhang G. // Oncol. Lett. 2016. Vol. 11. N 2. P. 1463 (DOI: 10.3892/ ol.2016.4092).
8. Fuchs U., Kivela T., Summanen P., Immo-nen I., Tarkkanen A. // Am. J. Pathol. 1992. Vol. 141. N 1. P. 169.
9. Богуш Т.А., Арефьева А.А., Калюжный С.А., Богуш Е.А., Тюляндин С.А., Полоцкий Б.Е., Давыдов М.М. // Российский биотерапевтический журнал. 2017. Т. 16. № 4. С. 29 (DOI: 10.17650/17269784-2017-16-4-29-33).
10. Богуш Т.А., Калюжный С.А., Дудко
Е.А., Кирсанов В.Ю., Тюляндина А. С., Богуш
Е.А., Тюляндин С.А., Давыдов М.М. // Вестн.
Моск. ун-та Сер. 2. Химия. 2016. Т. 57. № 5.
С. 330 [Bogush T.A., Kaliuzhny S.A., Dudko
E.A., Kirsanov V.Yu.Б, Tjulandina A.S., Bogush
Е.А., Tjulandin S.A., Davydov M.I. // Mosc.
Univ. Chem. Bull. 2016. Vol. 71. N 5-6. P. 307]
DOI: 10.3103/S0027131416050035.
Поступила в редакцию 01.02.2019 Получена после доработки 02.03.2019 Принята к публикации 14.03.2019
COEXPRESSION OF VIMENTIN AND CYTOKERATINS IN HUMAN MELANOMA CELLS LINES
T.A. Bogush1*, S.A. Kaliuzhny1, A.A. Basharina1, E.A. Bogush1, V.Yu. Kirsanov2, V.S. Kosorukov1, O.S. Burova1, M.M. Davydov2, MA. Baryshnikova1
(1 FSBI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» of the Ministry of Health of the Russian Federation; FSAEI HE I.M. Sechenov First MSMUMOH Russia (Sechenovskiy University); *e-mail: tatbogush@mail.ru)
Molecular heterogeneity in 7 human metastatic melanoma cells lines was revealed by dual immunofluorescent assay and flow cytometry. It has been evaluated that quite a small population of cells (up to 10%) expressed only vimentin, the main marker of melanoma. Only epithelial cytokeratins expression was revealed in more significant amount of cells (from 25% to 50%). And finally, coexpression of vimentin and cytokeratins was newly identified and dominant molecular phenotype (50-80% cells expressed both markers). The authors expect that the letter phenotype of melanoma cells may be a molecular marker of tumor aggressiveness and metastatic potential.
Key words: immunofluorescent assay, flow cytometry, vimentin, cytokeratins, melanoma.
Сведения об авторах: Богуш Татьяна Анатольевна - руководитель группы молекулярных маркёров опухолей лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, профессор, докт. биол. наук (tatbo-gush@mail.ru); Калюжный Сергей Андреевич - мл. науч. сотр. группы молекулярных маркёров лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (labmedchem@mail.ru); Башарина Анна Александровна -мл. науч. сотр. группы молекулярных маркёров лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (bashari-naa@inbox.ru); Богуш Елена Александровна - ст. науч. сотр. хирургического отделения № 2, канд. мед. наук (labmedchem@mail.ru); Кирсанов Владислав Юрьевич - доцент кафедры онкологии лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, канд. мед. наук (labmedchem@mail.ru); Косоруков Вячеслав Станиславович - зав. лабораторией трансгенных препаратов ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. биол. наук (labmedchem@mail.ru); Бурова Ольга Семёновна - ст. науч. сотр. лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. биол. наук (labmedchem@mail.ru); Давыдов Михаил Михайлович - зав. кафедрой онкологии лечебного факультета ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, чл.-корр. РАН, докт. мед. наук (labmedchem@mail.ru); Барышникова Мария Анатольевна - зав. лабораторией экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, канд. фарм. наук (labmedchem@mail.ru).
