CC BY
21
УДК 618.11-006.6-079:576.3.088
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АСЦИТНЫХ КЛЕТОК РАКА ЯИЧНИКОВ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ПРИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОМ АНАЛИЗЕ С ПРИВЛЕЧЕНИЕМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ
Т.А. Богуш*, С.А. Калюжный, Е.А. Дудко, В.Ю. Кирсанов, А.С. Тюляндина, Е.А. Богуш, С.А. Тюляндин, М.М. Давыдов
(Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации; *e-mail: [email protected])
Диссеминация по брюшине и рост опухолевых клеток в асцитической жидкости при рецидиве рака яичников III и IV стадий - трудно поддающийся лечению этап болезни, при котором отмечается устойчивость ко многим противоопухолевым препаратам, применяющимся при терапии солидной формы рака яичников. Для проверки правильности авторской гипотезы о том, что одной из причин этого могут быть отличия молекулярного фенотипа опухолевых клеток при разных формах заболевания, в клетках солидной и асцитной форм рака яичников проведена сравнительная оценка экспрессии и коэкспрессии ряда молекулярных маркеров (иммунофлуоресцентный анализ, ассоциированный с проточной цитофлуориметрией). Показано, что в отличие от солидной формы, клетки асцитного рака яичников помимо маркера эпителиальных клеток цитокератина презентируют общий лейкоцитарный антиген CD45 и маркер мезенхимальных клеток виментин. Следовательно, наряду с ингибированием аной-киса (специфический механизм смерти эпителиальных клеток в жидкой среде при отсутствии контакта с субстратом), клетки асцитного рака яичников характеризуют: 1) эмпериполез (внутриклеточная миграция лейкоцитов без повреждения опухолевой клетки); 2) фенотип эпителиально-мезенхимального перехода. Таким образом, впервые получены данные о клинически значимых молекулярных отличиях солидного и рецидивного асцитного рака яичников, что открывает возможности для противоопухолевой терапии, которая ранее не использовалась при лечении рака яичников.
Ключевые слова: асцитная и солидная форма рака яичников, опухолевые маркеры, цитокератин, CD45, виментин, проточная цитофлуориметрия.
Асцит является характерным симптомом рака яичников, сопровождающим течение данного заболевания с момента возникновения. Диссеминация по брюшине и рост опухолевых клеток в асцитической жидкости при рецидиве рака яичников III и IV стадий - трудно поддающийся лечению этап болезни, при котором отмечается устойчивость ко многим противоопухолевым препаратам, применяющимся при терапии солидной формы рака яичников. В этом случае недостаточно эффективна и внутрибрюшинная терапия заболевания, хотя безусловный прогресс отмечен в ряде исследований [1]. Поэтому разработка новых, патогенетически обоснованных подходов к терапии асцитных форм рака яичников является важнейшей задачей.
Анализ клинических результатов лечения этого заболевания позволяет предположить, что клетки рецидивного асцитного рака яичников на поздних стадиях заболевания могут иметь молекулярный фенотип, отличный от первичного солидного но-
вообразования. Это открывает возможности для противоопухолевой терапии, которая ранее не использовалась при лечении рака яичников. Если это так, то по молекулярной характеристике клетки солидной и рецидивной асцитной форм рака яичников должны отличаться принципиально не только на количественном уровне экспрессии молекулярных маркеров «больше-меньше», но и качественно - «есть-нет».
В настоящем исследовании для проверки правильности сформулированной гипотезы проведена сравнительная оценка молекулярной характеристики солидной и асцитной форм серозного рака яичников III стадии с использованием имму-нофлуоресцентного анализа, ассоциированного с проточной цитофлуориметрией.
Материалы и методы
Работа проведена на опухолевых клетках рака яичников, полученных из хирургических
биопсийных образцов и асцитической жидкости при диссеминации процесса по брюшной полости. Суммарно исследованы 14 опухолевых образцов больных серозным раком яичников III стадии. Оценка параметров экспрессии молекулярных маркеров проведена с использованием ранее разработанного количественного имму-нофлуоресцентного метода, ассоциированного с проточной цитофлуориметрией [2, 3].
Для получения одноклеточной суспензии хирургические образцы рака яичников, зафиксированные в 4%-м растворе формальдегида, тщательно измельчали и инкубировали в растворе Версена при 37 ос в течение 30 мин. К измельченному образцу опухоли добавляли раствор фосфатного буфера (pH 7,4), гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе пятикратным движением пестика и фильтровали через фильтры «BD Falcon» («Becton, Dickinson and Company») диаметром 40 мкм. Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (pH 7,4).
Асцитическую жидкость центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (pH 7,4) и фиксировали в 4%-м растворе формальдегида. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева и доводили фосфатным буферным раствором (pH 7,4) до концентрации 200-400 тыс. клеток в 1 мл.
После получения одноклеточных суспензий клетки инкубировали в течение 1,5 ч с первичными моноклональными антителами, специфичными к CD45 (меченные флуоресцентным красителем APC, клон HI30, «Biolegend», США), к общему ци-токератину (клон AE1/AE3, «DAKO», США) или к виментину (клон SP20, «BIOCARE», США) в конечном разведении 1:200 для каждого антитела. Далее в течение 1,5 ч проводили инкубацию с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями DyLight650 (ab98510, «Abcam», Великобритания) или DyLight488 (ab98637, «Abcam», Великобритания) в конечном разведении 1:1000 и 1:120 соответственно. Для выведения из анализа дебриса и эритроцитов после завершения инкубации с вторичными антителами клетки инкубировали в течение 15 мин со специфическим красителем ДНК Hoechst 33258 («Sigma-Aldrich», США) в концентрации 1,2 мкг/мл. Включали в анализ только клетки с окрашенными ядрами, исключая клеточные конгломераты путем дополнительного гейтирования.
Измерение флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman
Coulter», США). Для возбуждения флуоресценции использовали твердотельные диодные лазеры с длиной волны испускаемого света 405, 488 и 638 нм. Регистрацию сигнала флуоресценции красителей Hoechst 33258 и DyLight488 проводили в каналах FL-9, FL-1 соответственно, а для DyLight650 и APC использовали канал FL-6. Использовали средний показатель скорости подсчета анализируемых клеток; число анализируемых событий составило 5000. Точечные диаграммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции в разных каналах на проточном цитофлуориметре получали с помощью программы WinMDI 2.9, количество специфически флуоресцирующих клеток рассчитывали с помощью теста Колмогорова-Смирнова, включенного в программу FlowJo 10.0.8 («FlowJo LLC», США).
Результаты и их обсуждение
Побудительным мотивом для исследования экспрессии в эпителиальных клетках асцитного рака яичников молекулярного маркера лейкоцитов (антигена CD45) [4] явился трудно объяснимый, но многократно воспроизводимый феномен. При попытке выделить из асцитической жидкости «чистую» фракцию клеток рака яичников путем гейтирования и удаления из анализа лейкоцитов сумма клеток, иммунофлуоресцентно окрашенных специфическими антителами к цитокератину [5] и CD45, существенно превышала число клеток, взятых в анализ (таблица). Превышение было значительным и колебалось от 33 до 75%. Ни в одном из случаев сумма эпителиальных опухолевых клеток, экспрессирующих цитокератин, и клеток, окрашенных CD45, по отношению к числу проанализированных клеток не приближалась к 100%.
Для того чтобы оценить, не является ли этот феномен методической погрешностью, аналогичное исследование провели с суспензиями опухолевых клеток, полученных из хирургических биопсий-ных образцов солидного рака яичников (таблица). Видно, что полученные результаты отличаются от описанных. В 5 из 7 случаев (71%) сумма эпителиальных опухолевых клеток, экспрессирующих цитокератин и CD45 позитивных клеток, была приблизительно равна числу проанализированных клеток, а в 2 из 7 случаев лишь незначительно (на 20 и 25%) превышала 100%.
Таким образом, выявленный феномен превышения суммы клеток, экспрессирующих цитокератин и CD45, над общим числом исследованных клеток не случаен и отражает некую молекулярную особенность эпителиальных клеток рака яичников в асцитической жидкости. Подтверждение этому
Уровень экспрессии цитокератина (ЦК) и СБ45 в клетках асцитного рака яичников
Образец для Номер образца Уровень экспрессии маркеров (%)*
исследования ЦК СБ45 ЦК + СБ45 >100%**
1*** 81 94 175 75
2*** 68 89 157 57
Асцитическая 3 76 90 166 66
жидкость из 4 78 97 175 75
брюшной полости 5 60 89 149 49
6 58 81 139 39
7 64 69 133 33
Среднее значение показателей 69,3±9,1 87,0+9,4 156,3+16,8
1*** 83 8 91 ^
2*** 78 11 89
Хирургиче ский 3 62 29 91
биопсийный образец 4 88 17 105
солидной опухоли 5 76 28 104
6 90 30 120 20
7 92 33 125 25
Среднее значение показателей 81,2+9,6 22,2+9,3 103,6+13,4 -
Достоверность различий (р) между показателями 0,04 <0,001 0,002 -
*Уровень экспрессии маркеров - количество специфически окрашенных клеток относительно показателя при инкубации с вторичными антителами; "превышение суммы (%) клеток, экспрессирующих цитокератин и СБ45, над общим числом исследованных клеток; ***образцы солидной и асцитной опухоли одной и той же пациентки.
продемонстрировано при иммунофлуоресцентном окрашивании опухолевых клеток, полученных из биопсийного хирургического образца солидной опухоли и из асцитической жидкости (после рецидива болезни) одной и той же пациентки (таблица, образцы 1 и 2). В случае солидной опухоли сумма клеток, экспрессирующих цитокератин и СЭ45, составила приблизительно 100% (91 и 89%), а в асцитных клетках - 157 и 175% соответственно.
Последнее наблюдение однозначно указывает на то, что при рецидиве рака яичников молекулярная характеристика опухолевых клеток в ас-цитической жидкости по сравнению с солидным узлом изменяется. Полученные результаты позволили предположить, что это может быть презентация лейкоцитарного антигена СЭ45 на эпителиальных клетках, экспрессирующих специфический антиген цитокератин. Для проверки этой гипотезы была проведена окраска клеток асцитного рака яичников последовательно двумя специфическими антителами: сначала - к СЭ45, а затем - к цитокератину (далее - двойная метка). Данные, представленные на рис. 1, демонстрируют точечные диаграммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции в разных каналах на проточном цитофлуориметре. Анализ автофлуоресценции интактных клеток (рис. 1, А, левый нижний квадрант) проведен для точной дис-
позиции областей размещения клеток, окрашенных СЭ45 или цитокератином, а также при последовательном окрашивании одной и той же клеточной суспензии антителами к СЭ45, а затем - к цито-кератину. На рис. 1, Б (правый верхний квадрант) видна популяция клеток, выявляемая при таком двойном окрашивании. Это клетки, несущие метку вторичных антител, конъюгированных с разными флуорохромами, специфичными по отношению к СЭ45 или цитокератину. Часть клеток (левый верхний квадрант) несет на себе метку только СЭ45, и незначительное число клеток остаются неокрашенными (автофлуоресценция, левый нижний квадрант). Клетки, окрашенные только цитокератином (правый нижний квадрант), в исследованной популяции асцитных клеток не определяются.
Таким образом, при диссеминации рака яичников по брюшине в асцитической жидкости рецидивного рака яичников выявляются эпителиальные опухолевые клетки (цитокератин-положи-тельные), несущие лейкоцитарный антиген СЭ45. Поскольку при двойном окрашивании антителами к СЭ45 и к цитокератину не выявляются клетки, окрашенные только цитокератином, есть все основания считать, что при рецидиве рака яичников III стадии в асцитической жидкости все опухолевые клетки презентируют на своей поверхности лейкоцитарный антиген СЭ45.
Побудительным мотивом для выполнения следующего раздела работы послужили данные о том, что процесс метастазирования эпителиальных опухолей ассоциирован с так называемым эпителиаль-но-мезенхимальным переходом, маркером которого является экспрессия в клетках белка виментина [6, 7]. В полной мере это относится и к раку яичников: выявление в солидном опухолевом узле клеток, экс-прессирующих виментин, свидетельствует о высоком метастатическом потенциале новообразования [8]. Мы предположили, что поскольку при III и IV стадиях рака яичников после диссеминации рака яичников по брюшине «выход» опухолевых клеток в брюшную полость может рассматриваться как вторичное метастазирование («метастазирование из метастазов»), все или большая часть опухолевых клеток в асцитической жидкости должны экспрес-сировать виментин.
Для проверки правильности этого предположения проведена иммунофлуоресцентная последовательная окраска клеток рака яичников, полученных из асцитической жидкости, специфическими антителами к цитокератину и виментину. В предварительных экспериментах при раздельном окрашивании клеток этими антителами было показано, что как и в случае параллельного окрашивания цитокератином и CD45, сумма цитокератин- и ви-ментин-позитивных клеток превышает общее число исследованных клеток (данные не приведены). Это наблюдение объективизировано при двойном окрашивании клеток антителами к цитокератину и виментину.
Данные, представленные на рис. 2, демонстрируют точечные диаграммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции в разных каналах на проточном цитофлуориметре. Как и при двойном окрашивании антителами к CD45 и ци-токератину (рис. 1, А), оценка автофлуоресценции (рис. 2, А) проведена для точного определения областей размещения клеток, окрашенных цитоке-ратином, виментином или последовательно двумя этими антителами. При таком анализе выявляется популяция клеток, несущих двойную метку вторичных антител, конъюгированных с разными флуорохромами, специфичными по отношению к виментину или цитокератину (рис. 1, Б, правый верхний квадрант). Визуализируются клетки (левый верхний квадрант), окрашенные только ви-ментином, а клетки, экспрессирующие только ци-токератин, в исследованной популяции отсутствуют (правый нижний квадрант). Таким образом, в асцитической жидкости все цитокератин-позитив-ные опухолевые клетки экспрессируют виментин.
Полученные данные показывают, что при рецидиве заболевания клетки рака яичников в асци-тической жидкости экспрессируют молекулярные маркеры, принципиально отличающие их от клеток солидного новообразования. Это экспрессия общего лейкоцитарного антигена CD45 и маркера мезенхимальных клеток виментина во всех опухолевых клетках, несущих на себе эпителиальный маркер цитокерантин.
При анализе литературных данных в поисковой системе Pub Med нам удалось найти лишь одно
S Я
Я ев Я о,
Ц s-а к
О о
ё с
О- и
«•ä
о о о я
о
ins : о
Р
Я Q.
й И н т
Я Я
К
104
103
102
101
10°
CD45
Авто ЦК
я CL
я к
О U
ё Я
Они
а о 1«
10° 10> 102 103 104 К Интенсивность флуоресценции в зеленой области спектра
104
103
102
я 2 101
й к н т я я
10°
CD45 , . Ш)
Авто ЦК
CD45+ ЦК+
10° 101 102 103 104 Интенсивность флуоресценции в зеленой области спектра
Рис. 1. Результаты последовательного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток асцитно-го рака яичников специфическими антителами к СБ45 и цитокератину. А - области точечной диаграммы распределения клеток асцитного рака яичников в зависимости от интенсивности флуоресценции в разных каналах на проточном цитофлуориметре: нижний правый квадрант - область окрашивания цитокератином (ЦК); верхний левый квадрант - область окрашивания СБ45; верхний правый квадрант - область двойного окрашивания цитокератином СБ45 и ЦК; левый нижний квадрант - автофлуоресценция (Авто) клеток, включенных в анализ. Б - линией отмечена популяция клеток в области флуоресценции при двойном окрашивании антителами к СБ45 и ЦК
я я
Э"
55 о-
о tu
й в O.U
вН
•&3
JJ ч
1° Я Я
« а. й и
ЕВ Я
К
104 103 ю2 ю1 10°
Вим Вим ЦК
Авто ЦК
10° 101 ю2 ю3 ю4
Интенсивность флуоресценции в зеленой области спектра
10° 101 102 103 104
Интенсивность флуоресценции в зеленой области спектра
Рис. 2. Результаты последовательного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток асцитного рака яичников специфическими антителами к виментину и цитокератину. А - области точечной диаграммы распределения клеток асцитного рака яичников в зависимости от интенсивности флуоресценции в разных каналах на проточном цитофлуориметре: нижний правый квадрант - область окрашивания цитокератином (ЦК); верхний левый квадрант - область окрашивания виментином (Вим) СБ45; верхний правый квадрант - область двойного окрашивания Вим и ЦК; левый нижний квадрант -автофлуоресценция (Авто) клеток, включенных в анализ. Б - линией отмечена популяция клеток в области флуоресценции при двойном окрашивании антителами к Вим и ЦК
сообщение 2013 г., в котором при иммуноцитохи-мическом исследовании асцитических жидкостей четырех пациенток с раком яичников описано слияние опухолевых клеток и лейкоцитов [9].
В нашем исследовании феномен слияния клеток подтвержден и охарактеризован количественно. Показано, что лейкоцитарный антиген CD45 несут все клетки рецидивного асцитного рака яичников. Более того, оказалось, что все опухолевые клетки, презентирующие CD45, экспрессиру-ют виментин - маркер мезенхимальных клеток, т.е. находятся в состоянии эпителиально-мезен-химального перехода.
Иными словами, клетки рецидивного асцит-ного рака яичников, не утрачивая специфического маркера эпителиальных клеток цитокератина, презентируют несвойственные антигены - CD45 и виментин. Это объясняет выявленное нами превышение суммы цитокератин и CD45 презентиру-ющих клеток, а также суммы цитокератин и ви-ментин позитивных клеток относительно общего числа исследованных клеток. Таким образом, получено объяснение феномена, которое явилось побудительным мотивом для проведения настоящего исследования.
При обсуждении возможной клинической значимости представленных результатов хотелось бы высказать следующие соображения. В работе впервые получены данные, свидетельствующие о том, что все клетки рецидивного асцитного рака яичников III стадии по сравнению с солидной формой приобретают, наряду с ингибированием анойкиса (специфический механизм смерти эпи-
телиальных клеток в жидкой среде при отсутствии контакта с субстратом и соседними клетками), ряд важнейших отличительных молекулярных характеристик: 1) эмпериполез (внутриклеточная миграция лейкоцитов в опухолевую клетку); 2) фенотип эпителиально-мезенхимального перехода.
Важно, что эти различия выявляются не только в группах сравнения «солидный узел» и «асцити-ческая жидкость» у разных больных, но и внутри одной пациентки (в настоящем исследовании описаны два таких наблюдения).
Таким образом, впервые получены данные, свидетельствующие о клинически значимых молекулярных отличиях солидного и рецидивного асцитного рака яичников, что открывает возможности для противоопухолевой терапии, которая ранее не использовалась при лечении этого заболевания. Поскольку очевидно, что не только выявленные молекулярные характеристики могут определять различия солидных и асцитных форм рака яичника, чрезвычайно важным представляется дальнейший сравнительный анализ диффе-ренцировочных маркеров эпителиальных и гемо-поэтических клеток, а также выявление и оценка частоты экспрессии маркеров стволовых клеток. Кроме того, необходимо получить ответ на вопрос: являются ли выявленные молекулярные особенности характеристикой только рецидивного асцитно-го рака яичников или это некий общий феномен, ассоциированный со способностью эпителиальных опухолевых клеток к росту в асцитической или плевральной жидкости при диссеминации по брюшине или плевре соответственно?
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Тюляндина А.С. // Практическая онкология. 2014. Т. 15. № 4. С. 168.
2. Богуш Т.А., Шатурова А.С., Дудко Е.А., Жураев Э.Э., Полоцкий Б.Е., Унгиадзе Г.В., Давыдов М.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2011. Т. 52. № 4. С. 305.
3. Богуш Т.А., Тихомиров М.В., Дудко Е.А., Синицина М.Н., Раманаускайте Р.Ю., Полоцкий Б.Е., Тюляндин С.А., Давыдов М.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2012. Т. 53. № 3. С. 207.
4. ThomasL.M. // Ann. Rev. Immunol. 1989. Vol.7. P. 339.
5. Schweizer J., Bowden P.E., Coulombe P.A., Langbein
L., Lane E.B., Magin T.M., Maltais L., Omary M.B., Parry D.A., Rogers M.A., Wright M.W. // J. Cell Biol. 2006. Vol. 174. N 2. P. 169.
6. Moreno-Bueno G., Peinado H., Molina P., Olmeda D., Cubillo E., Santos V., Palacios J., Portillo F., Cano A. // Nat Protoc. 2009. Vol. 4. N 11. P. 591.
7. YeX., WeinbergR.A. // Trends Cell Biol. 2015. Vol. 25. N 11. P. 675.
8. Ahmed N., Abubaker K., Findlay J., Quinn M. // Curr Cancer Drug Targets. 2010. Vol. 10. N 3. P. 268.
9. Ramakrishnan M., Mathur S.R., Mukhopadhyay A. // Cancer Res. 2013. Vol. 73. N 17. P. 5360.
Поступила в редакцию 12.03.16
MOLECULAR PECULIARITIES OF ASCITIC OVARIAN CANCER CELLS REVEALING BY IMMUNOFLUORESCENCE ASSAY INVOLVING FLOW CYTOMETRY
T.A. Bogush*, S.A. Kaliuzhny, E.A. Dudko, V.Yu. Kirsanov, A.S. Tjulandina, ЕА. Bogush, S.A. Tjulandin, M^. Davydov
(N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation; *e-mail: [email protected])
Peritoneal dissemination of malignant cells and their proliferation in ascitic fluid in recurrent III и IV stages of ovarian cancer are phase of the disease characterized by resistance to various chemotherapy regimens employed for the solid tumor treatment. Authors supposed that such differences may be due to various molecular phenotypes of solid and recurrent ascitic ovarian cancer forms. For validation of this hypothesis comparative study of expression and co-expression of certain molecular markers was performed on ovarian cancer cells obtained from solid tumors and ascitic fluids by using immunofluorescence assay involving flow cytometry. It was established that ascitic cells unlike cells of solid tumor presented common leucocytic marker CD45 and mesenchymal marker vimentin additionally to epithelial marker cytokeratin. Hence, besides inhibition of anoikis (the specific form of epithelial cell death induced in fluid by the lack of contacts with matrix) ascitic ovarian cancer cells are characterized by (1) emperipolesis (the intracellular migration of leucocytes without damage of cancer cells) and (2) phenotype of epithelial-to-mesenchy-mal transition. Thus, for the first time it was established that solid and recurrent ascitic ovarian cancer have clinically significant molecular differences and this fact open up new opportunities for ovarian cancer treatment.
Key words: immunofluorescence assay, flow cytometry, ascitic and solid ovarian cancer, CD45, vimentin, cytokeratin.
Сведения об авторах: Богуш Татьяна Анатольевна - зав. лабораторией медицинской химии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, профессор, докт. биол. наук (labmedchem@ mail.ru); Калюжный Сергей Андреевич - мл. науч. сотр. лаборатории медицинской химии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России ([email protected]); Дудко Евгений Александрович - ст. науч. сотр. лаборатории медицинской химии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, профессор, канд. биол. наук ([email protected]); Кирсанов Владислав Юрьевич - науч. сотр. отделения диагностики опухолей ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, канд. мед. наук ([email protected]); Богуш Елена Александровна - ст. науч. сотр. отделения диагностики опухолей ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, канд. мед. наук ([email protected]); Тюляндина Александра Сергеевна - науч. сотр. отделения клинической фармакологии и химиотерапии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, канд. мед. наук ([email protected]); Тюляндин Сергей Алексеевич - зав. отделением клинической фармакологии и химиотерапии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, профессор, докт. мед. наук ([email protected]); Давыдов Михаил Михайлович - зав. отделением торакальной онкологии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, профессор, докт. мед. наук ([email protected]).
