CC BY
36
УДК 618.11- 006.6 - 076.5
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЛИНИИ MCF7/ADR
Т.А. Богуш1*, С.А. Калюжный1, М.Р. Четыркина2, М.А. Ястребова 12, А.М. Щербаков1, О.М. Рябинина1, И.А. Мамичев1, Е.А. Богуш1, А.А. Каменский2
(1 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; *e-mail: tatbogush@mail.ru)
Выявлены различия между чувствительными (MCF7) и резистентными (MCF7/ ADR) клетками в экспрессии виментина и P-gp, что указывает на «сосуществование» двух механизмов лекарственной резистентности в клетках MCF7/ADR. Мезен-химальный фенотип эпителиальных клеток вносит значительно больший вклад в механизм резистентности в сравнении с гиперэкспрессией АВС-транспортера, так как разница в уровне экспрессии виментина между чувствительной и резистентной культурами значительно превосходит разницу в экспрессии P-gp.
Ключевые слова: MCF7, MCF7/ADR, культуры клеток рака молочной железы, лекарственная резистентность, эпителиально-мезенхимальный переход, виментин, P-gp, проточная цитофлуориметрия.
Резистентность к воздействию противоопухолевых препаратов остается серьезной проблемой противоопухолевой терапии. Механизмов резистентности много и разработка подходов к их преодолению требует точно охарактеризованных клеточных моделей. Линия рака молочной железы MCF7 - одна из широко используемых моделей для изучения механизмов реализации множественной лекарственной резистентности, обусловленной выбросом противоопухолевых препаратов из клетки при работе АВС-транспортеров [1, 2]. Из литературных источников известно, что линия MCF7/ADR обладает высоким уровнем резистентности к ан-трациклиновому препарату доксорубицину, что связывают с повышенной экспрессией одного из АВС-транспортеров - P-gp [3]. Мы предположили, что высокий уровень лекарственной резистентности клеток MCF7/ADR может быть обусловлен и другими причинами, например, индукцией процесса эпителиально-мезенхи-мального перехода, который общепризнанно связан с агрессивностью заболевания и с высоким метастатическим потенциалом опухоли [4].
Для проверки этого предположения в клетках двух линий, принципиально различающихся по чувствительности к противоопухолевым препаратам (MCF7 и MCF7/ADR), проведена сравнительная оценка экспрессии двух молекулярных маркеров - P-gp и de novo экспрессии мезенхимального белка виментина, который считается специфиче-
ским маркёром молекулярного фенотипа эпители-ально-мезенхимального перехода.
Материалы и методы
Исследована культура клеток рака молочной железы линии МСР7, полученная при адаптации к росту в культуре клеток из плевральной жидкости при диссеминации опухоли по плевре, а также линия МСР7/АЭЯ с индуцированной резистентностью к доксорубицину. При иммунофлуоресцент-ном анализе с включением проточной цитофлуо-риметрии использованы первичные антитела к ви-ментину (клон 8Р20, СЯМ312А), к Р^р (клон 4Е3, аЬ10333) и к цитокератинам 8/18 (ЦК 8/18) (клон БР1628У аЬ53280), а также вторичные антитела, конъюгированные с БЬ650 (аЬ98510 и аЬ98729). Методом Колмогорова-Смирнова (программа Р1с№1о 10.0.8) определены следующие параметры экспрессии маркёров: уровень (%) - количество специфически флуоресцирующих клеток в процентах по отношению к контролю (инкубация с вторичными антителами); интенсивность (усл. ед.) - отношение средней специфической интенсивности флуоресценции к аналогичному показателю в контроле; интегральный индекс - произведение доли клеток, экспрессирующих маркёр, и интенсивности экспрессии маркёра.
Результаты и обсуждение
Гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции после иммунофлуорес-
центного окрашивания антителами к АВС-транспортеру P-gp, мезенхимальному белку ви-ментину и к эпителиальным цитокератинам представлены на рисунке.
Необходимо отметить, что уровень экспрессии P-gp в резистентных клетках MCF7/ADR приблизительно в 1,5 раза выше, чем в родительской линии MCF7, чувствительной к ан-трациклину (82 и 62% соответственно). Более существенны различия между резистентными и чувствительными клетками по интенсивности и индексу экспрессии P-gp - в 3 и 4 раза соответственно.
По de novo синтезу виментина клетки различались значительно, начиная с уровня экспрессии маркёра. В резистентных клетках MCF7/ADR уровень показателя составил 72%, тогда как в клетках MCF7 - только 14%. Показатели интенсивности и индекса экспрессии виментина отличались еще более значительно. В резистентных клетках MCF7/ADR интенсивность экспрессии
маркёра была выше более чем в 6 раз, а индекс -в 25 раз, чем в клетках линии MCF7.
Важно также отметить различия по частоте de novo экспрессии виментина в клетках, экс-прессирующих эпителиальные цитокератины 8/18. В чувствительных клетках этот показатель составил около 17% (14% против 83%), а в резистентных клетках MCF7/ADR - достиг 100% (72% против 69%). Тот факт, что в клетках обеих культур отмечен высокий уровень экспрессии цитокератинов 8/18, подтвердил эпителиальную природу этих клеток и de novo коэкспрессию виментина практически во всех резистентных клетках MCF7/ADR.
Заключение
Результаты настоящей работы показали, что высокая резистентность к доксорубицину клеток рака молочной железы линии MCF7 ассоциирована не только с гиперэкспрессией АВС-транспортера P-gp, но и с высоким уровнем эпителиально-ме-
Примеры гистограмм распределения клеток в зависимости от интенсивности клеточной флуоресценции при иммунофлуоресцентном окрашивании. По осям абсцисс указана интенсивность специфической флуоресценции (усл. ед.), по осям ординат указано число клеток. Окрашенные гистограммы получены после инкубации с вторичными антителами (контроль); прозрачные гистограммы получены после инкубации с первичными и вторичными антителами (опыт). Стрелками указан уровень экспрессии маркёра в %; в скобках указаны соответственно интенсивность и индекс экспрессии маркёра
зенхимального перехода, который оценивали по специфическому маркёру мезенхимальных клеток - виментину. Этот белок выявлен во всех резистентных клетках линии MCF7/ADR, при этом коэкспрессия виментина и эпителиальных цитоке-ратинов наблюдалась в 100% этих клеток, что подтверждает возможность de novo экспрессии мезен-химального маркёра в эпителиальных опухолевых клетках.
Выявленные различия между чувствительными и резистентными клетками в показателях экспрессии виментина и P-gp позволяют предположить «сосуществование» двух меха-Работы с клеточными культурами по
(проект №
низмов лекарственной резистентности в клетках МСР7/ЛВЯ. При этом мезенхимальный фенотип эпителиальных клеток вносит значительно больший вклад в механизм резистентности по сравнению с гиперэкспрессией АВС-транспортеров.
Таким образом, клетки рака молочной железы линии МСР7/ЛЭЯ представляют собой перспективную модель для поиска и изучения модификаторов лекарственной резистентности, ассоциированной с индукцией в эпителиальных опухолевых клетках эпителиально-мезенхи-мального перехода. одержаны Российским научным фондом 14-15-00362).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gottesman M.M., Fojo T., Bates S.E. // Nat Rev Cancer. 2002. Vol. 2. N 1. P. 48.
2. Luqmani Y.A. // Med Princ Pract. 2005. Vol. 14. Suppl. N 1. P. 35.
3. Tsou S.H., Chen T.M., Hsiao H.T., Chen Y.H. // PLoS One. 2015. Vol. 10. N 1. P. 1.
4. Saxena M., Stephens M.A., Pathak H., Rangarajan A. // Cell Death Dis. 2011. N 2. P. 1.
Поступила в редакцию 12.04.18
MOLECULAR MECHANISMS OF DRUG RESISTANCE IN MCF7/ADR BREAST CANCER CELLS
T.A. Bogush1*, S.A. Kalyuzhny1, M.R. Chetyrkina2, M.A. Yastrebova12,
A.M. Scherbakov1, O.M. Ryabinina1, I.A. Mamichev1, E.A. Bogush1, A.A. Kamensky2
(1 FSBI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» of the Ministry of Health of the Russian Federation; 2 FSB Educational Institution of Higher Education M.V. Lomonosov Moscow State University; *e-mail: tatbogush@mail.ru)
It was revealed differences between expression of vimentin and P-gp in sensitive MCF7 and resistant MCF7/ADR cells thus demonstrating the "coexistence" of two drug resistance mechanisms in MCF7/ADR cells. Mesenchymal phenotype of epithelial cells contributes significantly to resistance mechanism in comparison with overexpression of the ABCtransporter the difference in vimentin expression levels between sensitive and resistant cell cultures is substantially higher compared with the difference in P-gp expression levels..
Key words: MCF7, MCF7/ADR, breast cancer cell cultures, drug resistance, epithelial-to-mesenchymal transition, vimentin, P-gp, flow cytometry.
Сведения об авторах: Богуш Татьяна Анатольевна - профессор, руководитель группы молекулярных маркёров опухолей лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (tatbogush@mail.ru); Калюжный Сергей Андреевич - мл. науч. сотр. группы молекулярных маркёров лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (labmedchem@mail.ru); Четыркина Маргарита Руслановна - студентка биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (margarita.che-tyrkina@yandex.ru); Ястребова Маргарита Андреевна - студентка биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (ritayastrebova2009@gmail.com); Щербаков Александр Михайлович - ст. науч. сотр. лаборатория онкопротеомики ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, канд. биол. наук (alex.scherbakov@gmail.com); Рябинина Ольга Михайловна - науч. сотр. группы молекулярных маркёров лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (labmedchem@mail.ru); Мамичев Иван Андреевич - мл. науч. сотр. группы молекулярных маркёров лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (Mamichev99@gmail.com); Богуш Елена Александровна - ст. науч. сотр. отделения клинической фармакологии и химиотерапии ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, канд. мед. наук; Каменский Андрей Александрович -зав. кафедрой физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, профессор, докт. биол. наук (kamensky_msu@mail.ru).
