CC BY
38
БИОТЕХНОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
Известия ТСХА, выпуск 3, 2010 год
УДК 633.791:575.18
КЛОНИРОВАНИЕ ПРИЛЕГАЮЩИХ РЕГИОНОВ У-ХРОМОСОМСПЕ0ИФИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
хмеля обыкновенного (.тмиьиБ ьигиьиБ Ь.)
О.С. АЛЕКСАНДРОВ, М.Г. ДИВАШУК, И.А. ФЕСЕНКО, Г.И. КАРЛОВ
(Центр молекуля рной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева)
С помощью метода АЬ-РСК была расширена специфичная область У-хромосомы хмеля обыкновенного на 264 п.о. в одну сторону и на 102 п.о. — в другую. Сравнительный анализ с другими известными последовательностя ми показал, что найденные новые последовательности также являются специфичными дл У-хромосомы хмел обыкновенного.
Ключевые слова: хмель обыкновенный, определение пола растений,
У-хромосомоспецифичные последовательности ДНК, клонирование.
Среди растений семейства Сап-паЪаееав большое хозя йственное значение имеет хмель, который является двудомным растением [6]. Женские растения используются в пивоваренной, пищевой, текстильной и лекарственной промышленности [2]. Кроме того, хмель представля ет собой интересный объект для выя вле-ния путей возникновения и эволюции пола у растений. Его геном еще мало изучен в молекул рно-генетическом плане [1]. Однако уже давно известно, что хмель обыкновенный характеризуется ХХ/ХУ-системой половых хромосом [7, 5, 11, 12]. Механизм их эволюционного формирова-ни и их структурно-функциональные и молекул рно-генетические отличия всё ещё остаются практически не изученными. Известно лишь, что Х- и У-хромосомы обладают слабой гомологией, что выражается в образовании между ними одной терминальной хиазмы в мейозе [8].
Ранее были разработаны два STS-маркера, специфичных только для мужских растений хмеля [4]. Сиквенсы продуктов амплификации данных маркеров (AJ831218 и AJ831219, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) негомологичны известным последовательностя м ДНК. Была обнаружена только слаба гомологи с некоторыми последовательностями Helianthus an-nuus, Medicago truncatula, Zea mays, Brassica oleracea, Gossipium hirsutum , а также с клонами, полученными из Y-хромосомы Homo sapiens. Вышеуказанные последовательности могут служить я корными для дальнейшего клонировани и изучени последовательностей ДНК, специфичных для Y-хромосомы.
В связи с этим актуальной задачей вл етс определение последовательностей, фланкирующих разработанные STS-маркеры. Для решения этой задачи был избран метод ПЦР с лигированным адаптором AL-PCR
(adaptor ligation PCR), который по-зволя ет также определить копийность области, фланкируемой праймерами STS-маркера [13]. AL-PCR была разработана на основе методов изучения геномов человека [9] и арабидопсиса [10]. Она представля ет собой сочетание лигирования специфических
адапторов с рестрикционными фрагментами и двух раундов ПЦР с праймерами, отжигающимися на границу известной последовательности и адаптор. После лигировани и трансформации продуктов ПЦР в бактериальные клетки проводитс секвениро-вание искомых фрагментов. К основным преимуществам метода AL-PCR относится простота, относительно небольшое количество занимаемого времени (нет необходимости созда-ни библиотек), нерадиоактивность, возможность совместить определение копийности известной последовательности и секвенирование геномного окружения .
Целью нашей работы было клонирование и характеристика фланкирующих последовательностей ДНК ранее разработанного пол-специфичного
STS-маркера хмеля обыкновенного (AJ831218).
Материалы и методы
Растительный материал. Были использованы различные мужские растения хмеля, произрастающие на территории РФ.
Выделение ДНК из растительного материала. ДНК выдел ли из молодых листьев по методу Bernatzky и Tanksley [3] с некоторыми модифика-ци ми.
ПЦР с лигированным адаптором. Схематическое изображение метода ПЦР с лигированным адаптором (AL-PCR) представлено на рисунке 1.
Рестрикция тотальной ДНК
мужского растения хмеля. Рестрик-тазы должны были удовлетворять, прежде всего, следующим условия м: резать по «тупым концам», так как
это облегчает лигирование с адапта-ром, и не иметь сайтов рестрикции внутри сиквенса. Этим требованиям соответствовали рестриктазы DraI, Hindi, BstFnI.
Приготовление адаптора и лигирование. Адаптор готовили, как было описано в [13]. Использовали следующие комплементарные олигонуклеотид ные последовательности:
5'-GTAATACGA-CTCACTATAGGG CACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCA GGT-3' и 5'-PO4-ACCTGCCC-NH2-3’. Лигирование между адаптаром и ре-стрицированой тотальной ДНК мужского растения хмеля осуществляли по стандартной методике. Конечный объем лигазной смеси составлял 50^1. Лигирование проводили в течение ночи при 15°С.
Амплификация. Были подобраны праймеры на фланкирующие области исследуемого сиквенса (рис. 2) с температурой отжига 60°С.
Праймеры для сиквенса AJ831218: RB8-1 5'-GGAGGGCAAGATGGGA-
ATTA-3'; RB8-2 5'-AGGGCCTTGAT-TAGTGTGCC-3'; LB8-15'-GGACGGC-CAAAAAATTACAT-3'; LB8-2 5'-CCC-TAATCCAAAACCCTAGC-3'.
ПЦР с лигированным праймером осуществл ли в два этапа. На первом этапе использовали праймеры RB8-1, LB8-1, специфичные для фланкирующих областей сиквенса, и праймер AP1 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-GGC-3’) на адаптор. В качестве матрицы использовали лигазную смесь. ПЦР начиналась с «горя чего старта» 94°С — 3 мин. Затем следовало 5 циклов со следующими условиями: 94°С — 30 с, 65°С — 30 с, при этом в каждом следующем цикле температура отжига снижалась на 1°С, 72°С —
1 мин. Далее следовало 40 циклов с такими же условия ми при температуре отжига 60°С. ПЦР завершалась конечной элонгацией в течение 15 мин при 72°С.
Второй этап ПЦР осуществл ли с адаптор-праймером Ap2 (5'-ACT-
ОБЛАСТЬ С НЕИЗВЕСТНОЙ , ОБЛАСТЬ С НЕИЗВЕСТНОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ОБЛАСТЬ С ИЗВЕСТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ
НУКЛЕОТИДОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ НУКЛЕОТИДОВ НУКЛЕОТИДОВ
АР1
АР2
АР2 .
LB2
Рис. 1. Схематическое изображение метода AL-PCR. RB1 и LB1 — внешние праймеры соответственно на правый и левый конец известной последовательности для первого раунда ПЦР; RB2 и LB2 — внутренние праймеры соответственно на правый и левый конец известной последовательности для второго раунда ПЦР; AP1 и AP2 — внешний и внутренний праймер на адаптор
5'GTTTCTCTCGGGTT СТСТТ GAAGAAGAT GAAGCTAGAGAGATTTT GGT AG AGTT CTTGCT ATGT А ДТТТТТТ GGC CGTCCTCT СТ ATCGT ААААТ G А GGGGGTATTTATAGСТAGGG I I I I GGATTAGGGTTTTTCTCCАСТСА CATGAGTCTTAATTACACCAGCCACAAATAGGGGATACAATTACTGTAGTA GC AT GGCTAC AAGAC Т СТ AT GTGGGT АТ АТТТ AC GT GAAAGT AT GGGGAAT ACACAAAGTCAGCCGTCTTTCCCAAGTTGTCAGCGGAACAGTAGGCGAAA AGGTAC TGT AAC G АС С С AAATTC ACT AATAAG GCTTAAGGGCCTT GAT TAGTGTGCCGGGAGG GCAAGATGGG A ATT AT GT GT GGTT ATT AT GATT AAG AT GT AT GATT AT GATTTT AAGC AT GTT AT AT G ACT AT GT GAATT A T ATT AT GT GAT AATT AT GAT AT GT GAATT GT 3'
Рис. 2. Сиквенс AJ831218 с отмеченными праймерами
ATAGGGCACGCGTGGT-3’) и праймерами RB8-2, LB8-2, специфичными для фланкирующих областей сиквен-сов. В качестве матрицы использовали 5^1 50-кратно разбавленного ПЦР-продукта после первого шага ПЦР.
Клонирование, трансформация,
секвенирование. Для клонирова-
ния ПЦР-продуктов, полученных на предыдущем этапе, использовали вектор pGMT-T Easy-Vector (Prome-ga). Лигирование проводили в течение часа при 15°С. Отбор трансформированных клонов осуществл ли на основе бело-голубой селекции. Проверку на наличие вставки соответствующего размера в плазмиду осуществл ли с помощью праймеров М13, фланкирующих область полилинкера pGMT-T Easy-вектора (Promega). Секвенирование ДНК и Blast анализ проводили по стандартным методикам и алгоритмам.
Результаты и их обсуждение
Результат проведени ПЦР с лигированным праймером после гель-электрофореза ПЦР-продуктов в
2%-м агарозном геле представлен на рисунке 3.
М 1 2 3 4 5 6
Рис. 3. Электрофореграмма Л1-РСН.
1 — праймеры RB8-1/RB8-2, рестриктаза DraI, 2 — праймеры RB8-1/RB8-2, рестриктаза HincII, 3 —праймеры RB8-1/RB8-2, рестриктаза BstFnI, 4 — праймеры LB8-1/LB8-2, рестриктаза DraI, 5 — праймеры LB8-1/LB8-2, рестриктаза HincII, 6 — праймеры LB8-1/LB8-2, рестриктаза BstFnI, М — маркер размеров
Как видно из электрофореграм-мы, не во всех случаях амплифи-цируется один ПЦР-продукт. Это может быть связано с тем, что исследуемые сиквенсы являются низ-кокопийными повторами (около пяти копий).
Фланкирующие области сиквен-
са AJ831218. Далее полученные ПЦР продукты были клонированы и сек-венированы. Контроль достоверности того, что полученные сиквенсы соответствуют фланкирующим последо-вательност м дл пол-специфичных STS-маркеров осуществляли с помощью сравнени известной части сик-венса с вновь полученной. У сиквенса AJ831218 80 нуклеотидов для праймера LB8-1 и — 117 нуклеотидов для праймера RB8-1.
Праймер LB8-1 на левую границу сиквенса. На рисунке 4 представлен сиквенс одного из клонов ПЦР продукта, полученного с помощью AL-PCR на участок AJ831218. Красным цветом обозначен локус отжига праймера Ap2, зеленым цветом — праймера LB8-1, синим цветом — верифицируема область размером
80 нуклеотидов, которая должна совпадать у вновь полученного сиквен-са и у AJ831218.
Таким образом, секвенированная с использованием праймера LB8-1 область, фланкирующая AJ831218, составила 264 нуклеотида. Далее с помощью Blast анализа был проведен поиск гомологий данной области к различным нуклеотидным последо-вательностя м. Она показала наибольшую гомологию к одному из микроса-теллитных сиквенсов Humulus lupulus. Интересно отметить, что якорная последовательность (AJ831218) была клонирована из ISSR, специфичного для мужских растений хмеля [4]. Также следует обратить внимание на наличие гомологии данной последовательности к пол-специфичному SCAR маркеру у хмел понского (Humulus scandes).
Рис. 4. Сиквенс клона ПЦР продукта, полученного с помощью AL-PCR (праймер 1-В8-1) ,
на сиквенс AJ831218
Праймер ЕБ8-1 на правую границу сиквенса. На рисунке 5 представлен сиквенс одного из клонов ПЦР продукта, полученного с помощью ЛЬ-РСИ на Л^31218. Крас-
ным цветом обозначен локус посадки праймера Ар2, зеленым — праймера ЯБ8-1, синим — верифицируема область размером 117 нуклеотидов, которая должна совпа-
* 20 * 40 * 60 * 80 * 100
СССАСАААТАССССеАТ Т СССССССАССТ СССАТ ССТ ССССССССССАТССССеСССССССААТ Т ССАТ ССССТ ^АССССААСАТ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------ддадддсаадаъ
ддадддсаадаЪ
* 12 0 * 140 * 160 * 180 * 200 *
СССААТ Т АТ САТ Г АТ САТ Т
gggaat.ii. atgtgtggttattatgatt aagatgtat gattat gatttt aagcatgttat.atgactatgtgaattatattatgtgataatt.atgatat gtgaa■ttgt--
дддааЪЪа д'Сд'С.д t■t £^аЪ.да‘С.Ъаада‘С.д atда11atgattttaagcatд tat.at.gactatgt.gaa■tt.atattat.g да aatt.atgat tgtgaattgt.
220 * 240 * 260 * 280 * 300 * 320
АССТСССТССССТеАТАССАСТеТСАТССАССТССССАААСеСТССТАСААААСТАСАТААСеОТАААТССТОАТТТССТААССТСТОТААСТАТТАОТА^^Ш^^
--------------------------------------------------------------------------------------------------------АССАССЗСС
ассасдсд
______*______ 340 * 360 * 380 * 400 * 420 *
¡ЕВМШВШаАТ САСТАОТ СААТ Т ССССССС СССТ СС А<5СТ ССАССАТ АТ СССАСАССТ ССС ААССССТ Т ССАТ ССАТ АСС Т Т САСТАТ Т СТАТАСТ СТ САС СТ АА
И<5СССТАТА6Т|-
tgcc:ctatagt
Рис. 5. Сиквенс клона ПЦР-продукта, полученного с помощью AL-PCR (праймер НВ8-1),
на сиквенс AJ831218
дать у вновь полученного сиквенса и у AJ831218.
Таким образом, секвенированная фланкирующая область для AJ831218 с использованием праймера RB8-1 составила 102 нуклеотида. Затем с помощью Blast анализа был проведен поиск гомологии данной области к известным нуклеотидным последовательностям других организмов. Достоверной гомологии (рис. 5) к известным последовательност м ДНК у данной последовательности вы влено не было. В предыдущем исследовании якорная последовательность также не давала гомологий [4].
Совмещение фланкирующих областей с сиквенсом AJ831218 представлено на рисунке 6.
ССЛСЛТЛС С АС АСССACAAAGA С АА AAGG ATCCTCGCCCT CAGGCTC AAAAGTCACC АТТТТСТТС GTG С AGTC AATAGT AGCCCCAT ЛТСТЛЛ ACAGAAT.ААСААААAG АТА AG AACTG TAGAAGTGCAGAAATGI'AACTAAACAAACCGTGnriTAC GTGGTTCA GGCGTT А AC AAGC ССТ AGTCC АС GAGTC GA CG ТААТТ АТ ACTTGTAA AG ААТТАС AGT AAGAT GGCTGGTGT АСА AGAACTTC АС АСАСТСАС AG1GTTTCTCTCGGGTTCT
ССС GTCTTTCC САА GTTGTC AGCGG ААС A GT AGG С GAAAA
GTGGTTATTATGATTAAGATGTATGATTATGATTTTAAGCA
^^^^^■асса CGTGGGTGCCGTGATACC AGTGG А TGCACGTGCCGAAACGGTCCTAGAAAACTAGATAACGGTA AATGGTGATTTGGTAACCTGTGTAACTATTAGTAf
Рис. 6. Сиквенс AJ831218 с фланкирующими областями (темно-серым цветом отмечен исходный сиквенс AJ831218)
Таким образом, известная ранее последовательность была расширена с левой и правой границы на 264 и 102 пары нуклеотидов соответственно. Как и в работе по исследованию сайтов встраивания трансгенов, метод продемонстрировал свою эффективность и в нашем исследовании [13]. Наличие определенной гомологии к последовательности пол-специфично-го ДНК-маркера хмеля я понского на левой границе корной последовательности и факт того, что сама якорная последовательность вл етс мар-
керной для мужских растений хмеля обыкновенного, свидетельствует о том, что этот сиквенс расположен в регионах хромосом, детерминирующих развитие пола у хмел .
Дальнейшее расширение сиквенса этого региона и его изучение поможет выявить роль данного участка ДНК в развитии пола и особенности молекул рно-генетического строени половых хромосом хмел .
Выводы
1. Показана высокая эффективность метода ЛЬ-РСИ для клонирования регионов, прилегающих к специфичной последовательности У-хромосомы хме-л обыкновенного.
2. Известная ранее последовательность была расширена с левой и правой стороны на 264 и 102 пары нуклеотидов соответственно.
3. Данные о гомологии вновь полученных сиквенсов и совмещенных сик-венсов свидетельствуют о том, что эти участки ДНК являются специфичными участками дл У-хромосомы.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант 06-04-49753а.
Библиографический список
1. Данилова Т.В., Данилов С.С., Карлов Г.И. Исследование полиморфизма сортов хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) с использованием iSSR-ПЦР-анализа // Генетика, 2003. Т.39. № 11. С. 1484-1489.
2. Либацкий Е.П. Хмелеводство. М.: Колос, 1993.
3. Bernatzky, R. and S.D. Tanksley. Majority of random cDNA clones correspond to single loci in the tomato genome // Mol. Gen. Genet., 1986. 203: 8-14.
4. Danilova T.V., Karlov G.I. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism for detection of sex-specific molecular markers in hop (Humulus lupulus L.). Euphytica, 2006. V. 151. Issue. 1. P. 15-21.
5. Karlov G.I., Danilova T.V., Horlemann C., Weber G. Molecular cytogenetics in hop (Humulus lupulus L.) and identification of sex chromosomes by DAPI-band-ing. Euphytica, 2003. V. 132. Issue. 2. P. 185-190.
6. Neve, R.A. Hops. Chapman and Hall. London, 1991.
7. Ono. T. Studies in hop. I. Chromosomes of common hop and its relatives. Bull Brew Sci, 1955. V. 2: P. 1-65.
8. Shephard H. L., Parker J. S., Darby P. & Ainsworth C. C. Sexual development and sex chromosome in hop. New Pythol, 2000. V. 148. P. 397-411.
9. Siebert,P. D., Chenchik,A., Kellogg, D. E., Lukyanov,K. A. & Lukyanov, S. A. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res., 1995. V. 23. P. 1087-1088.
10. Spertini D, Beliveau C, Bellemare G. Screening of transgenic plants by amplification of unknown genomic DNA flanking T-DNA. Biotechniques, 1999.V. 27. P. 308-314.
11. Wing 0. On sex chromosomes sex determination and preponderance of females in some dioecious plants. Compte rendu des travaux du Laboratoire de Carlsberg, 1923. V. 15. P. 1-16.
12. Wing, O. On the nature of sex chromosomes in Humulus. Hereditas, 1929. V. 12. P. 53-63.
13. Zheng S.J., Henken B., Sofiari E., Jacobsen E., Krens F.A., Kik C. Molecular characterization of transgenic shallots (Allium cepa L.) by adaptor ligation PCR (AL-PCR) and sequencing of genomic DNA flanking T-DNA borders. Transgenic Research, 2001. V. 10. P. 237-245.
Рецензент — д. б. н. A.A. Соловьев
SUMMARY
Specific area of Y-chromosome in hop (Humulus lupulus) has been increased by 264 units on the one side, and by 102 units on the other side by AL-PCR method. Comparative analysis of other khown sequences proves that found new sequences are also specific for Y-chromosome of hop.
Key words: Hop (Humulus lupulus), sexing of crops, Y-chromosome specific sequences of DNA, cloning.
Дивашук Михаил Георгиевич — к. б. н. Тел. (495) 977-72-01.
Эл. почта: [email protected]
Александров Олег Сергеевич — асп. Тел. (495) 977-72-01.
Эл. почта: [email protected]
Фесенко Игорь Александрович — к. б. н. Тел. (495) 977-72-01.
Карлов Геннадий Ильич к. б. н. Тел. (495) 977-72-01.
Эл. почта: [email protected]
