CC BY
39
УДК 631.523:577.21
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СУБТЕЛОМЕРНОГО ГЕТЕРОХРОМАТИНА У ALLIUMFISTULOSUML., ALLIUM CEPA L. И ALLIUM WAKEGI С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ BAC-FISH*
А.В. КИСЕЛЕВА, И.В. КИРОВ, О.С. ПАВЛЕНКО, Д.В. РОМАНОВ, Л.И. ХРУСТАЛЕВА
(РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева)
Геномы луковых до сих пор остаются слабо изученными в связи с их большим размером, высокой частотой дупликаций и повышенной гетерозиготностью. Создание ВАС (bacterial artificial chromosome) библиотек, несущих большие вставки геномной ДНК, и физическое картирование ВАС клонов на хромосомах значительно ускорят изучение геномов представителей рода Allium. Ранее нами была сконструирована ВАС библиотека Allium fistulosum. Особое внимание было уделено поиску ВАС клонов, несущих теломерные или субтеломерные последовательности ДНК, так как для луковых пока остается загадкой механизм поддержания стабильности хромосом и сохранения длин теломерных окончаний после каждого раунда репликации. Нами был проведен скрининг ВАС библиотеки с ДНК-зондом на общий для луковых субтеломерный повтор. В результате скрининга было выявлено 4 ВАС клона. Перекрестный дот-блот анализ ВАС библиотеки с Cot-1 фракциями A. cepa и A. fistulosum выявил один ВАС клон 5.12.7 со слабой гомологией к Cot-1 фракции A. cepa. Отобранные пять ВАС клонов были физически картированы на хромосомах с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) на трех видах луков (A. fistulosum, A. cepa и A. wakegi). Четыре клона, несущие общий субтеломерный повтор, локализовались в дистальных окончаниях хромосом у всех трех изучаемых видов. Концевое секвенирование этих ВАС клонов и биоинформати-ческий анализ полученных сиквенсов выявили их высокую гомологию к общему для луковых субтеломерному повтору и GSS (Genome Survey Sequence) A. cepa. Причем у одного ВАС клона гомология к общему субтеломерному повтору была с обоих концов, а у трех ВАС клонов только с одного конца, а с другого к GSS A. eepa. Выравнивание полученных последовательностей ДНК с гомологией к GSS между собой не выявило у них общих последовательностей, что дает основание предположить их принадлежность к разным плечам/хромосомам.
FISH анализ ВАС клона 5.12.7 выявил ярко выраженные сигналы в субтеломерныхрегионах хромосом только на A. fistulosum. В результате FISH с ВАС клоном 5.12.7 на A. wakegi, который является естественным гибридом между A. fistulosum и A. cepa, были получены четкие сигналы на хромосомах A. fistulosum и слабые сигналы на хромосомах A. cepa. В FISH эксперименте на A. wakegi, в котором использовали в качестве блока ПЦР-продукт полученный с праймерами на общий субтеломерный повтор и геномной ДНК A. cepa и A. fistulosum, не было выявлено сигналов на хромосомах A cepa. ВАС-FISH на A. cepa с использованием блок-ДНК на общий субтеломерный повтор также не выявил сигналов гибридизации. Это указывает на наличие в ВАС клоне 5.12.7 видоспецифичного повтора. Концевое секвениро-
* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», мероприятие 1.2.1, соглашение № 8112 от 23 июля 2013 г.
вание этого ВАС клона выявило лишь гомологию к GSSA. сера. Дальнейшее полное секвени-рование ВАС клона 5.12.7 позволит определить видоспецифичный субтеломерный повтор у A. fistulosum.
Ключевые слова: Allium fistulosum, A. сера, A. wakegi, ВАС библиотека, субтеломерный повтор, ВАС-FISH.
Несмотря на широкое использование луков в питании людей и фармацевтике, их геном до сих пор остается слабо изученным из-за целого ряда причин, в числе которых: большой размер, высокая частота дупликаций и повышенная гетерозиготность. Для изучения таких больших и сложных геномов используют геномные библиотеки на основе ВАС векторов, благодаря которым можно клонировать фрагменты ДНК до 300 тыс. пар нуклеотидов (п.н.). Японскими учеными недавно была создана ВАС библиотека лука репчатого (Allium сера L.), покрывающая 30% генома. На сервере международного центра биотехнологической информации (NCBI) опубликовано более 5 млн нуклеотидных последовательностей, принадлежащих A. сера, в то время как для лука батуна (Allium fistulosum L.) известно лишь 746 последовательностей ДНК. Геном лука батуна остается почти неизученным.
Лук батун является источником многих ценных генов, в частности, устойчивости к ряду фитопатогенов, которые могут быть использованы для обогащения генофонда лука репчатого. Размер генома лука батуна на 28% меньше генома лука репчатого и составляет приблизительно 12,5 х 109 п.н.
У A. fistulosum была обнаружена тандемно повторяющаяся сателлитная ДНК размером 378 п.н. [8], а ранее у A. сера также был выделена сателлитная последовательность 375 п.н. [4]. У обоих видов повторы были локализованы в дистальных регионах хромосом. Также сателлитные последовательности были найдены и у других представителей рода Allium. Так FISH с 375 п.н. повтором A. сера выявил сигналы в дистальных регионах хромосом у A. vavilovii, A. fistulosum, A. galanthum, A. os^a-ninii, A. altaiсum [15].
Сравнение A. fistulosum сателлитного повтора с выявленным у A. сера показало 82% гомологии [8]. Копийность A. fistulosum повтора примерно равняется 2,8 х 106 на гаплоидный геном, что составляет 4,5% генома [8]. У A. сера сателлитный повтор составляет 4% генома. Такие массивы тандемно повторяющейся ДНК организуют субтеломерный гетерохроматин у многих видов растений [11].
Субтеломерный гетерохроматин считается переходным регионом между теломерным повтором и наиболее дистальной хромосом-специфичной последовательностью. Роль субтеломерных регионов в стабильности и функционировании хромосом остается слабо изученной. Субтеломеры большинства организмов по большей части содержат нефункциональные повторяющиеся последовательности, и потеря субтеломеры не влияла на жизнеспособность клетки и стабильность хромосом [14]. Однако некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что укладка терминальной области теломер в более внутренний субтеломерный регион может способствовать кэпированию теломер [6, 7, 12].
Для луковых пока остается загадкой механизм поддержания стабильности хромосом и сохранения длин теломерных окончаний после каждого раунда репликации. У всех представителей рода Allium отсутствует Арабидопсис-типа теломерный повтор, характерный для большинства растений — TTTAGGG [19]. У них также не был найден теломерный повтор позвоночных — TTTAGG, обнаруженный у Аспа-
рагаловых, к которым принадлежит род Allium. У луков не найдена теломераза — фермент обеспечивающий достраивание теломер [19]. Поэтому возникает вопрос, как луковые сохраняют теломерные окончания хромосом от укорачивания. Была выдвинута гипотеза, что сателлитный повтор является одним из классов терминального повтора, выполняющего функцию теломеры, благодаря событиям неравного крос-синговера, происходящего в тандемных повторах [16]. В поддержку данной гипотезы говорит тот факт, что сателлитный повтор может формировать теломерное окончание хромосом и выполнять функцию теломеры, как это было найдено у Chironomus pal--lidivittatus [13].
В состав субтеломеры у некоторых видов входят также ретротранспозоны. Так, в терминальном гетерохроматине хромосом ячменя и эгилопса встречаются представители надсемейства eopia- и LIÆ-ретротранспозоны [5]. А в субтеломере у видов Triticeae найден CACTA- ДНК-транспозон Caspar [18, 20]. В субтеломерном гетерохроматине A. fistulosum обнаружено наличие ДНК последовательностей Ty 1-copia обратной транскриптазы [2].
Нами была ранее сконструирована ВАС библиотека геномной ДНК A. fistulo-sum и проведен ее скрининг с праймерами на субтеломерный повтор [1]. Были отобраны четыре ВАС клона, несущие субтеломерный повтор. Перекрестный дот-блот анализ ВАС библиотеки с Cot-1 фракциями A. cepa и A. fistulosum выявил один клон со слабой гомологией к Cot-1 фракции A. cepa [1].
В данной работе представлены результаты флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) ранее отобранных пяти ВАС клонов и их концевого секвенирования. BAC-FISH продемонстрировала четкую локализацию сигналов гибридизации в дистальных окончаниях хромосом A. fistulosum. Четыре клона, несущие общий субте-ломерный повтор, локализовались в дистальных окончаниях хромосом у всех трех изучаемых видов. ВАС клон 5.12.7, несущий видоспецифичный повтор, давал сигнал гибридизации только на хромосомах A. fistulosum. Концевое сиквенирование этих BAC клонов и биоинформатический анализ полученных сиквенсов выявили высокую гомологию к общему субтеломерному повтору и GSS A. cepa.
Материалы и методы исследования
Растительный материал и приготовление митотических препаратов хромосом
Семена A. cepa (2n = 2х =16) сорта Халцедон и A. fistulosum сорта Русский зимний (2n = 2х =16) были выращены на влажной фильтровальной бумаге в течение 72 ч при 25 °С, затем перенесены последовательно в 0,75 mM гидроксимочевину при 25 °С на 24 ч, на фильтровальную бумагу, смоченную водой при 25 °С на 4 ч и в 0,05% (w/v) колхицин при 25 °С в течение 3,5 ч. Молодые корешки A. wakegi были собраны у растений, выращенных в теплице в горшках, затем обработаны N2O в камере под давлением 10 атмосфер в течение 3 ч. Фиксация корней проводилась в этанол : уксусной кислоте (3: 1) (v/v). Препараты хромосом готовили по описанной ранее методике распластывания [17].
Получение проб
Отобранные 4 ВАС клона, несущие общий субтеломерный повтор, и ВАС клон с видоспецифичной повторяющейся последовательностью ДНК [1] были размножены в жидкой питательной среде LB (1% (w/v) триптон, 0,5% (w/v) дрожжевой экстракт, 0,5% (w/v) хлорид натрия) с добавлением антибиотика хлорамфеникола.
Плазмидная ДНК была выделена с помощью коммерческого набора реактивов «The GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, США), согласно прилагаемому протоколу, и помечена с помощью DIG-Nick Translation Mix (Roche, Германия) согласно прилагаемой инструкции.
Получение блок-ДНК
В качестве ДНК для блокирования общих для луковых нуклеотидных последовательностей был получен ПЦР продукт с праймерами на общий субтеломерный повтор и геномной ДНК A. сера и A. fistulosum.
На основании данных о нуклеотидной последовательности сателлитного повтора лука батуна [8] были сконструированы праймеры, фланкирующие отрезок длиной 378 п.н. [2]:
34902 5’-ATCGATTCTTCGGACGGCCT-3:
34903 5’-ATCCGCAGGGTGCAACATCTGCGG-3’.
Амплификацию проводили на амплификаторе «Tetrad» (Biorad, США) при следующих параметрах: 94 °С — 5 мин; 30 циклов: 94 °С — 1 мин, 55 °С — 40 с, 72 °С — 2 мин 30 с.
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)
Предобработка и гибридизация стекол проводились по стандартной методике [11]. Гибридизационной смесь, содержала 50% (w/v) деионизорованного форма-мида, 10% (w/v) декстран сульфата, 2xSSC, 0,1% (w/v) SDS, и 50 нг на стекло меченной пробы. Жесткость отмывки составила 80%.
Детекция гибридизованной пробы проводилась по стандартной методике [9]. Пробы, меченные дигоксегенином, были детектированы с помощью антител anti-digoxigenin-fluorescein (Roche, Германия).
Анализ митотических препаратов хромосом проводился на флуоресцентном микроскопе Axiolmager M1 (Zeiss, Германия) с использованием цифровой камеры AxioCam MRm. Снимки были оптимизированы с помощью функции контраста и яркости, используя программы AxioVision v.4.6 или Isis v.5.
Результаты и обсуждение
Скрининг ВАС клонов и концевое сиквенирование
Все полученные ВАС клоны были проанализированы с помощью ПЦР на наличие в них 378 п.н. субтеломерного повтора. В ходе нашей работы было обнаружено 4 ВАС клона несущих данную последовательность: 5.3.1, 5.3.6, 5.8.7, 7.11.7 с размером вставки в каждом клоне около 50 т.п.н. Отобранные ВАС клоны были проанализированы с помощью концевого секвенирования. ВАС клон 7.11.7 с обоих концов выявил гомологию к 378 п.н. субтеломерному повтору. Поэтому мы можем предположить, что вставка геномной ДНК этого клона была получена из участка генома, находящегося внутри данного сателлитного повтора. У трех других ВАС клонов только с одного конца выявлена гомология к 378 п.н. субтеломерному повтору, а с другого конца обнаружена гомология к GSS (Genome Survey Sequence) A. сера. GSS представляют собой последовательности ДНК кодирующей части генов схожие с ESTs, но отличающиеся от последних своим геномным происхождением, а не из мРНК. Проведенный ранее FISH на растянутой ДНК и адаптер ПЦР с прямым клонированием теломерного конца показали, что сателлитный повтор занимает самый конец
хромосом A. cepa [16]. Поэтому мы можем предположить, что концы ВАС клонов с гомологией к субтеломерному повтору ориентированы к теломере, а противоположные концы, с гомологией к GSS ориентированы к центромере.
Для выяснения, не перекрываются ли последовательности, гомологичные GSS сиквенсам A. cepa, было проведено их выравнивание.
На рисунке 1 представлены результаты Gendoc анализа этих трех последовательностей. Они не гомологичны друг к другу, и, возможно, данные ВАС клоны принадлежат разным плечам/хромосомам.
Рис. 1. Выравнивание секвенированных последовательностей ВАС клонов 5.3.1, 5.3.6, 5.8.7
с гомологией к GSS A. cepa
ВАС-FISH клонов с общим субтеломерным повтором
Все четыре ВАС клона были проанализированы с помощью ВАС-FISH с целью установления их положения на хромосомах. В результате гибридизации in situ были выявлены четко выраженные сигналы на дистальных концах хромосом. На рисунке 2 представлены результаты FISH гибридизации двух из четырех ВАС клонов, несущих субтеломерную последовательность.
ВАС-FISH с видоспецифичным повтором A. fistulosum
Отобранный ранее ВАС клон 5.12.7 со слабой гомологией к Cot-1 фракции A. cepa [1] дал ярко выраженный сигнал на дистальных окончаниях хромосом A. fistulosum (рис.За). ВАС клон 5.12.7 был также гибридизован на хромосомах A. wakegi, который является естественным гибридом между A. fistulosum и A. cepa [3]. В результате FISH на A. wakegi были получены яркие сигналы на хромосомах A. fistulosum и очень слабые сигналы на хромосомах A. cepa (рис.3б). Интерпретируя полученные результаты ВАС- FISH на A. wakegi, мы можем предположить следующее: (1) возможно ВАС клон 5.12.7 содержит, наряду с общим субтеломерным повтором, последовательность ДНК, специфичную для A. fistulosum, или (2) число копий общего субтеломерного повтора значительно больше в субтеломерных регионах хромосом,
*
•Чг*
,10 цт
: \
а б
Рис. 2. ВАС-FISH клонов с субтеломерным повтором на хромосомах A. fistulosum: а — ВАС 5.3.6, меченный 11 dUTP-Digoxigenin; б — ВАС 5.8.7, меченный 11 dUTP-Digoxigenin
а б
Рис. 3. ВАС-FISH клона 5.12.7, меченного 11-dUTP-Digoxigenin: а — A. fistulosum; б — A. wakegi
принадлежащих A. fistulosum, чем у хромосом, принадлежащих A. cepa. Предположение о существовании у A. fistulosum видоспецифичного субтеломерного повтора было высказано ранее на основании результатов GISH анализа искусственных межвидовых гибридов между A. fistulosum и A. cepa [9].
Для проверки этих предположений был проведен FISH эксперимент на A. fistulosum, A. cepa и A. wakegi с меченной ДНК ВАС клона 5.12.7 и немеченым ПЦР продуктом, полученным с праймерами на 378 п.н. субтеломерный повтор и с геномной ДНК A. fistulosum и A. cepa. Немеченный ПЦР продукт был использован в концентрации, превышающей в 50 раз концентрацию меченного ВАС клона, для блокирования общего субтеломерного повтора.
В результате FISH на хромосомах A. fistulosum были выявлены гибридизаци-онные сигналы в субтеломерной области хромосом (рис. 4а). Однако на хромосомах А. cepa сигналов не было обнаружено (рис. 4б).
% '
10 iim
10 цт
Рис. 4. ВАС-ПЭИ клона 5.12.7 меченного 11-dUTP-Digoxigenin с использованием ДНК блока — ПЦР-продукт с праймерами на субтеломерный повтор и геномной ДНК А. Ши^ит;
а — А. fistulosum; б — А. сера
Это подтверждает наше предположение, о том, что в данном ВАС клоне может содержаться видоспецифичный субтеломерный повтор. Концевое секвенирование этого клона (по 500 п.н. с обоих концов геномной вставки) показало 70% гомологии к GSS A. cepa. Возможно, что в оставшихся 49 тыс. п.н. неизвестных последовательностях ВАС клона 5.12.7 находится видоспецифичный повтор. Полное секвенирование ВАС клона 5.12.7 внесет ясность в дискуссию и позволит установить последовательность ДНК видоспецифичного повтора.
Выводы
Скрининг ВАС библиотеки с ДНК-зондом на общий для луковых субтеломер-ный повтор выявил 4 ВАС клона, которые были проанализированы методом концевого секвенирования. Биоинформатический анализ сиквенсов показал у одного ВАС клона гомологию к общему для луковых субтеломерному повтору с обоих концов, и у трех ВАС клонов гомологию с одного конца к данной субтеломерной последовательности, а с другого к GSS A. eepa. Это позволяет судить о теломерно-центромерной ориентации ДНК вставок этих ВАС клонов. Выравнивание полученных последовательностей ДНК с гомологией к GSS между собой не выявило у них общих последовательностей, что дает основание предположить их принадлежность к разным плечам/хромосомам.
ВАС-FISH с клонами, несущими общий субтеломерный повтор, подтвердила их физическую локализацию в дистальных окончаниях хромосом. FISH с ВАС клоном 5.12.7 на хромосомах A. fistulosum, A. cepa и A. wakegi выявила наличие видоспецифичного субтеломерного повтора у A. fistulosum.
1. Киселева А.В., Фесенко И.А., Хрусталева Л.И. Создание геномной ВАС библиотеки Allium fistulosum L. для получения цитогенетических маркеров // Известия ТСХА. 2012. Вып. 6. С. 31-39.
2. Фесенко И.А., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И. Изучение организации сателлитного повтора 378 п.н. в терминальном гетерохроматине Allium fistulosum // Генетика. 2002. Т. 38. № 7. С. 894-903.
3.ХрусталеваЛ.И.,КанЛ.Ю.,КировИ.В., СальникА.А. Молекулярно-цитогенетический анализ естественных и синтетических гибридов Allium fistulosum х A. сера // Известия ТСХА. 2010. Вып. 4. С. 12 -21.
4. Barnes S. R., James A. M., Jamiesson G. The organization, nucleotide sequence, and chromosomal distribution of a satellite DNA from A. сера // Chromosoma. 1985. № 92. 185 p.
5. Belyayev A., Raskina O., Nevo E. Chromosomal distribution of reverse transcriptase-containing retroelements in two Triticeae species // Chromosome Res. 2001. V 9. P. 129-136.
6. de Bruin D., Kantrow S.M., Liberatore R.A. andZakian V.A. Telomere folding is required for the stable maintenance of telomere position effects in yeast // Mol. Cell. Biology. 2000. № 20. P. 7991-8000.
7. Grunstein M. Yeast heterochromatin: regulation of its assembly and inheritance by his-tones // Cell. 1998. № 93. P. 325-328.
8. Irifune K., Hirai K., Zheng J., Tanaka R., Morikawa H. Nucleotide sequences of a highly repeated DNA sequences and its chromosomal localization in Allium fistulosum // Theor. Appl. Genet. 1995. № 90. 312 p.
9. Khrustaleva L.I. and Kik C. Cytogenetical studies in the bridge cross Allium cepa x x (A. fistulosum x A. roylei) // Theor Appl Genet. 1998. № 96. P. 8-14.
10. Kuipers G. J., Van Os D. P. M., De Jong J. H., Ramanna M. S. Molecular cytogenetics
of Alstroemeria: identification of parental genomes in interspecific hybrids and characterization of repetitive DNA families in constitutive heterochromatin // Chromosome Res. 1997. № 5. P. 31-39.
11. Kuo H.F., Olsen K.M., Richards E.J. Natural variation in a subtelomeric region of Arabi-dopsis: implications for the genomic dynamics of a chromosome end // Genetics. 2006. № 173(1). P. 401-417.
12. Lieb J.D., Liu X., Botstein D. and Brown P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association // Nat. Genet. 2001. № 28. P. 327-334.
13. Lopes C. C., Nielsen L., Edstrom J.-E. Terminal long tandem repeats in chromosomes
from Chironomus pallidivittatus // Mol. Cell Biol. 1996. № 16. P. 3285.
14. Mefford, H. C. and Trask B. J. The complex structure and dynamic evolution of human subtelomeres// Nat. Rev. Genet. 2002. № 3. P. 91-102.
15. Pich U., Fritsch R., Shubert I. Closely related Allium species (Alliaceae) share a very similar satellite sequences // Plant Syst. Evol. 1996b. № 202. 255 p.
16. Pich U., Schubert I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium cepa // Chromosome Res. 1998. № 6. 315 p.
17. Pijnacker L. P., Ferwerda M. A. Giemsa C-banding of potato chromosomes // Can J Genet Cytol. 1984. № 26. P. 415-419.
18. Sergeeva E.M., Salina E.A., Adonina I.G., Chalhoub B. Evolutionary analysis of the CACTA DNA-transposon Caspar across wheat species using sequence comparison and in situ hybridization // Mol. Genet. Genomics. 2010. V. 284. № 1. P. 11-23.
19. Sykorova E., Lim K.Y., Kunicka Z., Chase M.W., Bennett M.D., Fajkus J. And Leitch A.R. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales // Proc. R. Soc. Lond. B Bio. 2003. 270. P. 1893-1904.
20. Wicker T., Taudien S., Houben A. et al. A whole-genome snapshot of 454 sequences exposes the composition of the barley genome and provides evidence for parallel evolution of genome size in wheat and barley // Plant J. 2009. V. 59. № 5. P. 712-722.
COMPARATIVE ANALYSIS OF SUBTELOMERIC HETEROCHROMATIN
IN ALLIUMFISTULOSUML, ALLIUM CEPA L.
AND ALLIUM WAKEGI USING BAC-FISH
A.V. KISELEVA, I.V KIROV, O.S. PAVLENKO, D.V. ROMANOV, L.I. KHRUSTALEVA (RSAU-MAA named after K.A. Timiryazev)
Genomes of onions are poorly studied because of their large sizes, high frequency of duplications and increased heterozygosity. The creation of BAC (bacterial artificial chromosome) libraries with large inserts of genomic DNA and physical mapping of BAC clones on the chromosomes will significantly accelerate the studying of onion genomes. We constructed a BAC library of Allium fistulosum. Special attention was paid to the search in the BAC library of clones carrying telomeric and/or subtelomeric DNA sequences as for Allium the sequence of telomeric end and therefore mechanism for maintaining of chromosome stability and preservation of telomere lengths endings after each round of replication remains unknown. We carried out BAC library screening with DNA-probing in order to detect a common subtelomeric repeat for Allium species. Four BAC clones were identified. Cross dot blot analysis of BAC library with Cot-1 fractions of A. cepa and A. fistulosum identified one BAC clone 5.12.7 with weak homology to the Cot-1 fraction of A. cepa. The selected five BAC clones were physically mapped by fluorescence in situ hybridization (FISH) on chromosomes of A. fistulosum, A. cepa and A. wakegi. Four clones that carry the common subtelomeric repeat, were localized in the distal end of chromosomes in all three species. End-sequencing of the BAC clones and bioinformatic analysis of the sequence data revealed their high homology to the common onion subtelomeric repeat and to the genome survey sequences (GSS) of A. cepa. One BAC clone revealed homology to the common subtelomeric repeat at both ends. Three BAC clones had homology from the one end to the common subtelomeric repeat and from the other to the GSS of A. cepa. Alignment of DNA sequences with the homology to the GSS to each other did not reveal common sequences, which gives ground for a suggestion that these BAC clones originatedfrom different arms or chromosomes.
FISH analysis of BAC clone 5.12.7 revealed strong signals in the subtelomeric region only on chromosomes of A. fistulosum. FISH analysis of BAC clone 5.12.7 on A. wakegi, which is a natural hybrid between A. cepa and A. fistulosum, revealed strong signals on the chromosomes of A. fistulosum and weak signals on the chromosomes of A. cepa. Using the PCR product with primers on the common subtelomeric repeat and genomic DNA of A. cepa and A. fistulosum as a block-DNA in FISH probing with BAC clone 5.12.7 on A. wakegi, the signals were not observed on chromosomes of A. cepa. BAC-FISH on A. cepa with block-DNA on the common subtelomeric repeat also did not show any hybridization signals. This may point to the presence in BAC clone 5.12.7 species-specific subtelomeric repeat. End-sequencing of this clone revealed homology only to the GSS of A. cepa. Further whole sequencing of the BAC clone 5.12.7 will allow us to identify the species-specific sub-telomeric repeat in A. fistulosum.
Key words: Allium fistulosum, A.cepa, A. wakegi, BAC library, subtelomeric repeat, BAC-FISH.
Хрусталева Людмила Ивановна — д. б. н., главный научный сотрудник Центра молекулярной биотехнологии, проф. кафедры генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 5а; тел.: 8 (499) 977-70-01; e-mail: [email protected]).
Киров Илья Владимирович — аспирант кафедры генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел.: 8 (499) 977-70-01.
Павленко Ольга Сергеевна — студентка кафедры генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел.: 8 (499) 977-70-01.
Романов Дмитрий Викторович — к. б. н., лаборант-исследователь Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел.: 8 (499) 977-70-01.
