CC BY
83
ydK 635.264:635-152:005
MOЛEKУЛЯPHO-ЦИTOГEHETИЧECKИЙ АНАЛИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ И СИНТЕТИЧЕЖИХ ГИБFИДOB ALLIUM FISTULOSUM x A. CEPA
Л.И. XFУCTAЛЁBA1, Л.Ю. KAH2 , M.B. KMFOB1, A.A. CAЛЬHИK1
(х Центр молекуля рной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева; 2 ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур, лаборатория генетики и цитологии)
В современной селекции лука репчатого (A. cepa L.) для переноса необходимых ценных признаков используют дикие близкородственные виды. Лук батун (A. fistulosum L.) является источником многих ценных признаков для создания новых сортов лука репчатого. Геномная in situ гибридизация (GISH), позволяющая четко различать родительские геномы в межвидовом гибриде, была использована для анализа межвидовых гибридов между A. cepa и A. fistulosum. GISH-анализ синтетического гибрида BC1[F5 (A. cepa x A. fistulosum) x A. cepa] показал наличие 8 хромосом A. fistulosum и 16 хромосом A. cepa. Таким образом, была установлена аллотриплоидна природа гибрида. В работе обсуждаются возможные механизмы образования аллотриплоида. Проведенный нами GISH-анализ вместе с FISH-локализацией 5S рДНК у природного гибрида A. wakegi Araki подтвердил его аллодиплоидную природу.
Ключевые слова: лук, Allium межвидовые гибриды, GISH, FISH.
Лук репчатый (Allium cepa L., 2n=16) — одна из древнейших культур, которую человек использует в пищу на протя жении более 5000 лет [2, 4]. За столь продолжительный период возделывани и селекции пред-ковый дикий вид A. cepa был утеря н. Поэтому в современной селекции лука репчатого дл переноса необходимых ценных признаков используют дикие близкородственные виды. Лук батун (A. fistulosum L. 2n=16) явля ется источником многих ценных признаков, которые могли бы быть использованы дл создани новых сортов лука репчатого. A. fistulosum обладает устойчивостью к таким заболеваниям, как луковая листовая гниль [5], розовая корневая гниль [6] и антракноз [7].
Устойчивость к луковой мухе [8], наносящей значительный экономический ущерб при выращивании лука репчатого, также была обнаружена у А. Кроме того, А. ^яЬиХо-
вит обладает рядом других ценных признаков, а именно высоким содержанием сухого вещества, более острым вкусом и морозостойкостью, более ранним и более коротким цветением, большей привлекательностью соцветий дл насекомых-опылителей [9].
Первая попытка переноса генов от А. ^ЬиХошт к А. сера с помощью межвидовой гибридизации была осуществлена ещё в 1935 г. [10]. К сожалению, полученные межвидовые гибриды оказались стерильными, хотя
иногда авторам удавалось получить несколько семя н путем их самоопыления [11]. Беккроссы (BC1) межвидовых гибридов A. cepa х A. fistulosum обычно т акже проя вля ли низкую ф ер-тильность [12]. Анализ ВС2 гибридов выя вил морфологические нарушения в репродуктивных органах, которые, по-видимому, и стали причиной по-лучени незначительного количества семян [13]. Таким образом, усилия генетиков и селекционеров перенести гены от A. fistulosum в геном лука репчатого не увенчались успехом, и до настоя щего времени эта проблема остаётся нерешённой.
A. wakegi Araki — естественный гибрид между A. fistulosum и A. cepa. Этот гибрид не был создан человеком, а появился в природе самостоятельно и был выделен в отдельный вид A. wakegi Araki. Естественный гибрид A. wakegi Araki полностью стерилен и размножается луковицами. Он давно используется в пищу в Я понии, Китае и Южной Азии. О генетическом происхождении этого вида начали задумываться ещё в 50-е годы, когда была показана гетероморфность его карио-типа и наличие двух спутничных хромосом, явно отличающихся друг от друга по длине [14]. В 1953 г. Kurita [15] было высказано предположение, что A. wakegi Araki я вляется аллоди-плоидом, образованным A. fistulosum и другим неизвестным видом. Позднее была подтверждена эта гипотеза результатами С-бендинга [16, 17]. Анализ искусственного гибрида между A. cepa (var. A. ascalonicum) и A. fistulosum выя вил схожий кариотип и поведение хромосом в мейозе с A. wake-gi Araki [18, 19]. В 1984 г. Tashiro на основании цитогенетического анализа конъюгирования хромосом в мейозе в материнских клетках пыльцы было показано, что A. wakegi я вля ется гибридом между A. ascalonicum и A. fistulosum [20]. Спустя 10 лет с помощью метода геномной in situ гибридизации (GISH) было доказано, что A. wakegi
Araki является гибридом между A. fistulosum и A. cepa [21].
GISH я вляется одним из методов флуоресцентной in situ ДНК:ДНК-гибридизации, при которой в качестве пробы используетс тотальна геномная ДНК. Метод был впервые разработан и использован дл анализа межвидовых гибридов [22]. GISH позвол ет четко различать родительские хромосомы в межвидовом гибриде [3]. Метод основан на визуализации на хромосомах ДНК-после-довательностей, различающихся у родителей, путем гибридизации меченной геномной ДНК одного родите-л и использовани немеченой геномной ДНК другого родител . Немечена ДНК используетс дл блокиро-вани общих дл обоих родительских видов гомологичных последовательностей ДНК. На протяжении двух последних дес тилетий GISH вл -етс основным методом генетиков и систематиков растений дл вы сне-ни гибридной природы натуральных и синтетических гибридов. Так, с помощью GISH был проведен мониторинг интрогрессии генов устойчивости к гербицидам от Aegilops cylindrica Host. в пшеницу [23], анализ соматических гибридов картофеля [24, 25, 26], а также была доказана аллополиплоидной природы Milium montianum [27]. GISH-метод был успешно применен и дл вы с-нени гибридной природы синтетических гибридов между A. cepa и A. fistulosum [28, 29].
В данной работе проведен GISH-анализ межвидовых гибридов между A. cepa и A. fistulosum, встречающихся в природе (A. wakegi Araki) и созданных человеком. GISH показал наличие 16 хромосом, принадлежащих A. cepa, и 8 хромосом — A. fis-tulosum в синтетическом гибриде, полученном во ВНИИСОК. В природном гибриде A. wakegi Araki было подтверждено наличие 8 хромосом A. cepa и 8 хромосом A. fistulosum.
Для идентификации хромосом, несущих рибосомальные гены, был проведен анализ локализации 5S рДНК с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).
Материалы и методы
Растительный материал. Луковицы A. wakegi Araki экотип «Mashi-ma», собранный на острове Машима, и свободный от вирусов клон «Hiroshima 2go»> экотипа «Kanshirazu-wase» были любезно предоставлены доктором Masayoshi Shigyo (Yamaguchi University, Japan). Луковицы были высажены в горшки и выращивались в условиях теплицы, а затем перенесены в климатические камеры c 12-часовым световым днем и температурой 24°С.
Растение межвидового гибрида
лука BC1 [F5 (A. cepa х A. fistulo-sum) х A. cepa] получены в лаборатории генетики и цитологии ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИСОК). В качестве материнской формы при проведении насыщающего скрещивани использовали растени гибридного потомства A. cepa х A. fistulosum, в качестве отцовского был взят сорт Йыгева-3 лука репчатого прибалтийской селекции как более устойчивый (по наблюдениям) к Peronospora destruktor Berk.
Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК выдел ли из молодых листьев A. fistulosum и проростков семян A. cepa сорта «Халцедон») с помощью CTAB-метода согласно ранее описанной методике [30].
Приготовление проб. Г еномную ДНК фрагментировали путем кипя-чени в течение 25 мин. Размер фрагментов ДНК составил 300-2000 п.н. Фрагментированную геномную ДНК метили Dig-11-dUTP (Digoxigenin-11-2'-deoxy-uridine-5 '-triphosphate) или Biotin-16-dUTP и (Biotin-16-2' deoxyuridine-5'-triphosphate) с помощью коммерческих наборов для ник-трансляции (Roche Applied Science).
Плазмидную ДНК pScT7, содержащую 462 п.н. BamHI фрагмент 5S рДНК ржи [31], метили Biotin-16-dUTP, используя ник-трансляцию. Немеченую геномную ДНК фрагментировали до размеров 300-1000 п.н. кип чением в течение 30 мин.
Приготовление препаратов митотических хромосом. Для приго-товлени цитологических препаратов митотических метафазных хромосом был использован метод распластыва-ни клеток [32]. Молодые корни обрабатывали a-бромнафталином при 4°С в течение ночи, затем фиксировали в 3:1 (v/v) спирт — уксусная кислота в течение 1 ч. Зафиксированные корни несколько раз промывали дистиллированной водой и инкубировали в течение 40 мин в ферментной смеси, содержащей 0,1% (w/v) пектолиа-зу Y-23 (Seishin Pharmaceutical Co., Japan), 0,1% (w/v) целлюлазы RS и 0,1% (w/v) цитогеликазы (Sigma, USA) в 10 мМ цитратном буфере (рН 4,8). Затем корневые меристемы переносили на предметное стекло и ма-церировали в капле 60% уксусной кислоты с последующим нагреванием при 42°С в течение 1 мин. Полученную клеточную суспензию окаймл ли раствором фиксатора 3:1 (v/v, спирт — уксусна кислота), а затем предметное стекло с фиксированными клетками промывали в 96%-м спирте и сушили при комнатной температуре.
GISH и FISH. Денатурацию ДНК и процедуру GISH проводили согласно описанной ранее методике [28]. В 60 мкл гибридизационной смеси содержалось: 50% (v/v) формамида, 10% (w/v) декстрансульфата, 2хSSC, 0,25% (w/v) SDS (додецилсульфат натрия), 1,67 нг/мкл меченой Dig-11-dUTP ДнК и 83,5 нг/мкл блок ДНК;
0,83 нг/мкл Biotin-16-dUTP меченой ДНК pScT7. Гибридизационную смесь денатурировали 10 мин при 80°С, оставляли на 5 мин при 0°С и наносили на препарат, затем снова проводили денатурацию при 80°С в течение 5 мин. Послегибридизационную от-
мывку проводили в Q.^SSC, 3Q мин при 4В°С. Такие условия позволяют оставить на хромосомах гетеродуплексы с 7В% гомологии. Пробы, меченные Dig-11-dUTP, детектировали с помощью последовательного использования антител, коньюгирован-ных с FITC: антидигоксигенин, выработанный в организме овцы (Roche, Germany), и антитела к антидигокси-генину из овцы, продуцируемые в организме кролика (Vector Laboratories, Burlingame, Calif., USA). Пробы, меченные Biotin-16-dUTP, детектировали с последовательным использованием: стрептавидина, коньюгирован-ного с TexasRed, антистрептавиди-на, коньюгированного с биотином, и повторно стрептавидина, коньюгиро-ванного с TexasRed (Vector Laboratories, Burlingame, Calif., USA). Хромосомы окрашивали DAPI и заключали в Vectashield (Vector Laboratories, http://www.vectorlabs.com).
Препараты изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio Imager (http://www.zeiss.com/), оснащённого ртутной лампой, набором фильтров для DAPI, TexasRed и FITC флуорохромов, цифровой камерой Axio Cam MRm. Oбpабoткy изображений производили с помощью программы Axio Vision, верси 4.6.3.
Результаты
A. wakegi Araki. GISH-анализ c использованием Dig-меченой геномной ДHK A. cepa в качестве пробы и немеченой геномной ДHK A. fistulosum в качестве блока вы вил В хромосом с зеленой флуоресценцией, равномерно распределенной вдоль хромосом и В хромосом со слабой флуоресценцией в отдельных регионах хромосом. Kаpиoтип В хромосом с более выраженной гибридизацией ДН^пробы соответствовал кариотипу A. cepa [33] и кариотип В хромосом — кариотипу A. fistulosum (рис. 1 Г). При использовании геномной ДHK A. fistulo-sum в качестве пробы и геномной ДHK A. cepa в качестве блока был
получен четкий флуоресцентный сигнал на В хромосомах A. fistulosum. Следует отметить наличие ярко выраженного гибрдизационного сигнала на теломерных окончаниях хромосом A. fistulosum. Практически отсутствовал сигнал на A. cepa хромосомах (рис. 1 B). B результате проведенного эксперимента по адаптации GISH-метода была достигнута более четка идентификаци родительских геномов в варианте с использованием в качестве пробы геномной ДHK A. fistulosum. B дальнейших исследо-вани х мы использовали геномную ДHK A. fistulosum в качестве пробы.
GISH-анализ двух форм A. wakegi Araki, а именно «Mashima» и «Kan-shirazu-Wase», подтвердил их гибридную природу. B обеих формах было выявлено В хромосом, принадлежащих A. fistulosum, и В хромосом — A. cepa (см. рис. 1 А, Б).
Гибридная природа A. wakegi Araki была также подтверждена FISH-методом, который позволил установить локализацию двух сайтов 5S pДHK на хромосоме 7 A. cepa и одного сайта на гомеологичной ей хромосоме A. fistulosum (см. рис. 1 B, Г). Наши результаты согласуютс с ранее полученными данными GISH- и FISH-анализа A. wakegi Araki [21].
BC1 [F5(A. cepa x A. fistulosum) x x A. cepa]. GISH-анализ c использованием Dig-меченной геномной ДHK A. fistulosum в качестве пробы и немеченой геномной ДHK A. cepa в качестве блока выя вил четкий флуоресцентный сигнал ДН^ДН^гибриди-зации на В хромосомах A. fistulosum. 16 хромосом, не несущих сигнала гибридизации, принадлежали A. cepa (рис. 2 А). Анализ карио-типа подтвердил наличие полного диплоидного набора A. cepa и гаплоидного набора A. fistulosum (рис. 2 Б). Таким образом, было установлено, что анализируемая форма межвидового гибрида вл етс аллотриплои-дом (2n = 3x = 24). Проведенный ранее пропионо-лакмоидным методом ана-
Рис. 1. In situ гибридизация с меченой дигоксигенином геномной ДНК A. fistulosum (зелёная флуоресценция) и меченой биотином 5S (pScT7) рДНК (красная флуоресценция) на метафаз-ные хромосомы A. wakegi сорта «Mashima» (А) и «Kanshirazu-Wase» (Б). Кариотипы A. wakegi после in situ гибридизации с меченой геномной ДНК A. fistulosum (В) и A. cepa (Г). Восемь хромосом в каждом кариотипе принадлежат A. cepa (слева) и восемь хромосом принадлежат A. fistulosum (справа). Стрелки показывают сайты локализации 5S рДНК
лиз кариотипа данной формы путём приготовления давленых препаратов меристемы корешков лука с предобработкой 0,1% раствором колхицина также указывал на т риплоидную природу гибрида.
Обсуждение
С филогенетической точки зрения , А. сера и А. ^вЬиІошш явля ются близкородственными видами. Оба этих вида принадлежат к подроду ИЬІ2Ігі^ Іит секции Сера [34]. Выделенные и клонированые повторя ющиеся последовательности ДНК А. сера и А. іовиш показали высокую степень гомологии [35, 36]. Поэтому при проведении СІБН-анализа гибридов между этими двумя видами ожидалась вы-
сокая степень кроссгибридизации, т.е. когда сигналы гибридизации меченной геномной ДНК одного вида частично детектируются вдоль хромосом другого в силу их высокой гомологии. Нами проведен сравнительный анализ использовани в качестве пробы геномной ДНК А. сера и геномной ДНК А. ^ШЬоэиш для идентификации хромосом соответствующего вида в геноме А. юакед{. Было установлено, что мечена геномна ДНК А. сера про вл ет равномерный относительно слабый сигнал вдоль хромосом, в то время как А. ^8п1о8пш проя вля ет сильные сигналы гибридизации в суб-теломерной области хромосом А. ^эи-1оэиш и более слабые сигналы вдоль хромосом. Использование в качестве
ЮсШ<і»йШ(цц
Рис. 2. In situ гибридизация с меченой дигоксигенином геномной ДНК A. fistulosum (зелёная флуоресценция) и немеченой геномной ДНК А. cepa (DAPI, синяя флуоресценция) на ме-тафазные хромосомы синтетического гибрида BC1 [(A. cepa * A. fistulosum) * A. cepa] (А); Кариотип этого синтетического гибрида после геномной in situ гибридизации: 16 хромосом (синяя флуоресценция) в кариотипе принадлежат A. cepa и восемь хромосом (зелёная флуоресценция) принадлежат A. fistulosum (Б)
пробы ДHK A. fistulosum позволило лучше различать родительские геномы в межвидовом гибриде между A. cepa и A. fistulosum из-за хорошо идентифицируемых субтеломерных сигналов на хромосомах A. fistulosum и их отсутствия на хромосомах A. cepa. Хот проведенный анализ 27 видов из 14 секций и 4 подродов, включая A. cepa и A. fistulosum, доказал, что все эти виды содержат общий субтеломерный сателлитный повтор [37], выраженный флуоресцентный сигнал на хромосомах A. fistulosum, полученный нами при гибридизации с меченой геномной ДHK A. fistulosum и блокировании общих последовательностей геномной ДHK A. cepa, может указывать на наличие в геноме A. fistulosum субтеломерно-го повтора, отсутствующего в геноме A. cepa. Поиск видоспецифично-
го субтеломерного повтора в геноме A. fistulosum является объектом наших дальнейших исследований.
Проведенный нами GISH-анализ вместе с FISH-локализацией 5S pДHK у природного гибрида A. wakegi Ara-ki подтвердил его аллодиплоидную природу. A. wakegi Araki является гибридом между определенными ф ор-мами A. cepa и A. fistulosum. Форма A. cepa, которая является одним из родителей A. wakegi Araki, принадлежит к группе Aggregatum (A. cepa var. ascalonicum Backer = A. ascaloni-cum auct.) [20]. B GISH-эксперименте мы использовали геномную ДН^ выделенную из формы A. cepa, относя -щейся к группе Cepa. Mеченая геномная ДHK A. cepa гибридизовалась с хромосомной ДHK A. wakegi Araki, о чем свидетельствует распределенный вдоль всех A. cepa хромосом флуо-
ресцентный сигнал (см. рис. 1А). Это указывает на высокую гомологию геномов этих двух типов A. ceра.
GISH-анализ синтетического гибрида между A. ceра. и A. fistulosum выявил наличие В хромосом, принадлежащих A. fistulosum, и 16 хромосом — A. ceра. Было установлено, что межвидовой гибрид я вля ется ал-лотриплоидом. B попытке объ снить триплоидную природу изучаемого гибрида мы можем предположить, что материнская форма гибридного потомства A. cepa x A. fistulosum была аллотетраплоидом (4n=4x=32). Такое спонтанное удвоение генома в межвидовом гибриде A. cepa x A. fistulosum могло произойти в результате соматического удвоени и образовани
луковицы с тетраплоидным набором хромосом. Известно, что эндоредупликация , т.е. нерасхождение хромосом в митозе, явля ется одной из ф орм дифферинцировки клеток [1]. Случаи спонтанной аллополиплоидизации,
когда стерильные F1 межвидовые гибриды в результате соматического удвоени отдельных отростков давали фертильное потомство, описаны для Arabidopsis, Primula, Solanum, Mimulus, Raphanobrassica (B. olera-cea, Raphanus sativus) и Nicotiana [3В,
39, 40].
Другая гипотеза о происхождении изучаемого аллотриплоида, основан-на на образовании 2n гамет, нами была отвергнута, так как GISH-анализ не вы вил рекомбинантных хромосом. С помощью GISH можно четко визуализировать места рекомбинаций на хромосомах межвидовых гибридов [29]. Mеханизм образования 2n гамет заключаетс в отмене первого (first division restitution) или второго (second division restitution) редукционного делени в мейозе [41]. По характеру распределения гомео-логических рекомбинаций в GISH-эксперименте можно установить, какой механизм лежит в основе об-разовани 2n гамет [42]. Отсутствие
рекомбинантых хромосом в изучаемом гибриде может свидетельствовать о том, что не было гомеологи-ческой рекомбинации между А. сера и А. ^вЫОиш. Мы можем предположить, что во время макроспороге-неза в мейозе хромосомы А. сера и А. ^зіиіовиш не конъюгировали между собой. Конъюгация хромосом и образование бивалентов вл етс критическим событием в прохождении мейоза и расхождении хромосом в дочерние клетки. Отсутствие конъюгации хромосом приводит к нарушения м в мейозе и неравному расхождению хромосом. В нашем случае, по-видимому, происходило образование гамет, несущих полный гаплоидный набор А. сера и А. ^вЫОиш, что могло быть лишь при наличии диплоидных наборов обоих видов, которые не конъюгировали между собой, т.е. хромосомы А. сера образовывали биваленты только с гомологичными хромосомами А. сера и хромосомы
А. ^віпіовиш с гомологичными хромосомами А. ^віпіовиш.
Заключение
Итак, в результате изучения с помощью ОІБН-геномного состава и хромосомной структуры естественных и синтетических гибридов луковых была установлена аллотриплоидная природа синтетического гибрида и подтверждена аллодиплоидна природа естественного гибрида. Надежная идентификация хромосом родителя в геноме гибрида и возможность визуализации мест рекомбинаций на физической хромосоме с помощью ОІБН-метода позволили разобратьс в механизме образовани триплоидного набора хромосом у синтетического гибрида.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», Государственный контракт № П809.
1. Бродский В.Я., Урываева И.В. Kлетoчная полиплоидия, пролиферация и дифференцировка. M.: Наука, 19В1.
2. Казакова А.А. Лук. Л., 197В.
3. Хрусталева Л.И. Moлекyлярная цитогенетика в селекции растений // Известия ТСХА, 2007. № 1. С. 45-55.
4. Jones R.N. Cytogenetic evolution in the genus Allium / Swaminathan MS, Gupta PK, Sinha U (eds) // Cytogenetics of crop plants. MacMillan, New York, 19В3. C. 516-554.
5. Currah L. , Maude R.B. Laboratory tests for leaf resistance to Botrytis squamosa in onions // Ann Appl Biol., 19В4. № 105. С. 277-2В3.
6. Netzer D. , Rabinowitch H.D. , Weintal Ch. Greenhouse technique to evaluate pink root disease caused by Pyrenochaeta terrestris // Euphytica, 19В5. № 34. С. 3В5-391.
7. Galvan G.A., Wietsma W.A., Putrasemedja S., Permadi A.H., Kik C. Screening for resistance to anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides Penz.) in Allium cepa and its wild relatives // Euphytica, 1997. № 95. C. 173-17В.
В. Ponti de OMB, Inggamer H. Resistance to the onion "y in Allium cepa and Allium ~stulosum / van der Meer QP // Proc 3rd Eucarpia Allium Symp. PUDOC Wageningen, The Netherlands, 19В4. C. 21-23.
9. Meer van der QP, Bennekom van J.L. Improving the onion crop (Allium ce-pa L.) by transfer of characters from Allium fistulosum L // Biul Warzywniczy, 197В. № 22. С. В7-91.
10. Emsweller S.L., Jones H.A. An interspeci~c hybrid in Allium // Hilgar-dia, 1935. №9. C. 265-273.
11. Emsweller S.L., Jones H.A. Meiosis in A. ~stulosum, A. cepa, and their F1 hybrid // Hilgardia, 1935. № 9. C. 277-294.
12. Van der Valk P. , de Vries S.E. , Everink J.T. , Verstappen F. , de Vries J.N. Pre-and post-fertilization barriers to backcrossing the interspeci^c hybrid between Allium ~stulosum L. and A. cepa L. with A. cepa // Euphytica, 1991. № 53. C. 201-209.
13. Ulloa-G M., Corgan J.N., Dun ford M. Evidence for nuclearcytoplasmic incompatibility between Allium ~stulosum and A. cepa // Theor Appl Genet, 1995. № 90. С. 746-754.
14. Kurita M. On the karyotypes of some Allium species from Japan // Mem. Ehime Univ. Sect. 2,1952. №1. C. 179—1ВВ.
15. Kurita M. Further note on the chromosomes of Allium Wakegi Araki // Mem. Ehime Univ. Sect. 2,1953. №2. С. 65-6В.
16. Kurita, M.. Heterochromaty in the Allium-chromosomes // Mem. Ehime Univ. Sect. 2, 1959. № 3. С. 23-2В.
17. Vosa C.G. Heterochromatic patterns in Allium. 1. The relationship between the species of the cepa group and its allies // Heredity, 1976. №36. С. 3В3-392.
1В. Adaniya S., Fujieda K., Matsuo E., Ogawa T. Karyotypes and origin of Allium wakegi // Chrom. Inform. Serv., 197В. № 24. C. 16— 1В.
19. Tashiro Y. Cytogenetic studies on the origin of Allium wakegi Araki. I. Meiosis in A. wakegi and the interspecific hybrid between A. fistulosum L. and ascalonicum L // Bull. Fac. Agr. Saga Univ, 19В0. № 49. C. 47-57.
20. Tashiro Y. Karyotype, meiotic behavior, and fertility of the hybrid between the tetraploid Allium wakegi Araki and the amphidiploid (A. ascalonicum L. X A. fistulosum L.) // J. Japan. Soc. Hort. Sci., 19В4. №52. С. 40В-431. (in Japanese).
21. Hizume M. Allodiploid nature of Allium wakegi Araki revealed by genomic in situ hybridization and localization of 5S and 45S rDNA // J. Genet., № 69. C. 141-148.
22. Schwarzacher T., Leitch A.R., Bennett M.D., Heslop-Harrison J.S. In situ localization of parental genomes in a wide hybrid // Ann. Bot., 1989. № 64.
C. 315-324.
23. Wang Z., Zemetra R.S., Hansen J. et al. Determination of the Paternity of Wheat (Triticum aestivum L) x Jointed Goatgrass (Aegilops cylindrica Host) BC1 Plants by Using Genomic In Situ Hybridization (GISH) Technique // Crop Science, 2002. № 42. C. 939-943.
24. Horsman K., Gavrilenko T., Bergervoet M. Alteration of the genomic composition of Solanum nigrum (+) potato backcross derivatives by somatic hybridization: selection of fusion hybrids by DNA measurements and GISH // Plant Breeding, 2001. № 120. C. 201-209.
25. Dong F., Novy R.G., Helgeson J.P., Jiang J. Cytological characterization of potato — Solanum etuburosum somatic hybrids and their backcross progenies by genomic in situ hybridization // Genome, 1999. № 42. C. 987-992.
26. Gavrilenko T. , Larkka J. , Pehu E. , Rokka V.-M. Identification of mitotic
chromosomes of tuberous and non-tuberous Solanum species (Solanum tuberosum and Solanum brevidens) by GISH in their interspecific hybrids // Genome, 2002. № 45. C. 442-449.
27. Bennett S.T., Kenton A. Y., Bennett M.D. Genomic in situ hybridization reveals the allopolyploid n ature of Milium montianum (Gramineae) // Chromosoma, 1992. № 101. C. 420-424.
28. Khrustaleva L.I.,Kik C. Cytogenetical studies in the bridge cross Allium cepa x (A. fistulosum x A. roylei) // Theor Appl Genet, 1998. № 96. C. 8-14.
29. Khrustaleva L.I., Kik C. Introgression of Allium fistulosum into A. cepa
mediated by A. roylei // Theor. Appl. Genet, 2000. № 100. C. 17-26.
30. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from plant tissues / Gelvin SB, Schilperoort RA Plant molecular biology manual A6 // Kluwer Academic Publ, Dordrecht, The Netherlands, 1988. C. 1-10.
31. Lawrence G.J., Appels R. Mapping the nucleolar organizer region, seed protein loci and isozyme loci on chromosome 1R in rye // Theor. Appl. Genet., 1986. № 71. C. 742-749.
32. Pijnacker L.P., Ferwerda M.A. Giemsa C-banding of potato chromosomes // Can J Genet Cytol, 1984. № 26. C. 415-419.
33. De Vries J.N. Onion chromosome nomenclature and homoelogy relationships — workshop report // Euphytica, 1990. №49. C. 1-3.
34. Raamsdonk van LWD, Smiech M.P., Sandbrink J.M. Introgression explains incongruency between nuclear and chloroplast DNA-based phylogenies in Allium section Cepa // Bot J Linn Soc, 1997. №123. C. 91-108.
35. Barnes S.R., James A.M., Jamieson G. The organization, nucleotide sequence, and chromosomal distribution of a satellite DNA from Allium cepa // Chromosoma, 1985. № 92. C. 185-192.
36. Irifune K. , Hirai K. , Zheng J. et al. Nucleotide sequence of a highly repeated DNA sequence and its chromosomal localization in Allium fistulosum // Theor. Appl. Genet., 1995. № 90. C. 312-316.
37. Pich U. , Fritsch R. , Shubert I. Closely related Allium species (Alliaceae) share a very similar satellite sequence // Plant Syst. Evol., 1996. № 202. C. 255-264.
38. Beaulieu J. , Jean M., Belzile F. The allotetraploid Arabidopsis thaliana-Ara-bidopsis lyrata subsp.petraea as an alternative model system for the study of poly-ploidyin plants // Mol. Genet Genomics, 2009. № 281. C. 421-435.
39. Caputo D., Frusciante L., Peloquin S.J. The role of 2n gametes and endosperm balance number in the origin and evolution of polyploids in tuber-bearing Solanums // Genetics, 2003. №163. C. 287-294.
40. Nasrallah M.E. , Yogeeswaran K., Snyder S., Nasrallah J.B. Arabidopsis species hybrids in the study of species differences and evolution of amphiploidy in plants // Plant Physiol, 2000. № 124. C. 1605-1614.
41. Mok D.W. , Peloquin S.J. The inheritance of three mechanisms of diploid (2n pollen) formation in diploid potatoes // Heredity, 1975. № 35. C. 295-302.
42. Karlov G.I., Khrustaleva L.I., Lim K.B., van Tuyl J.M. Homoeologous recombination in 2n-gamete producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by Genomic in situ hybridization (GISH) // Genome, 1999. № 42. C. 681-686.
Рецензент —д. б. н. А.А. Соловьев
SUMMARY
In modern onion (A. cepa L.) breeding close relative species are used for im-
proving the onion crop stock. Bunching onion (A. fistulosum L.) a number of desirable agronomical traits for the breeding of onions. Genomic in situ hybridization (GISH) has been used for analysis of hybrid origin of the natural hybrid A. wakegi Araki and the synthetic hybrid BC1 [F5(A. cepa x A. fistulosum) x A. cepa], GISH allows to distinguish parental genomes in interspecific hybrids. GISH study of synthetic hybrid showed the presence of 8 chromosomes belonging to A. fistulosum and 16 chromosomes belonging to A. cepa. Due to a powerful GISH technique we were able to establish allotriploid nature of synthetic hybrids. GISH analysis and FISH probing with 5S rDNA confirmed allodiploid nature of A. wakegi Araki.
Key words: onion, Allium interspecific hybrids, GISH, FISH.
Кан Людмила Юрьевна — к. с.-х. н. Тел. 599-24-42.
Хрусталева Людмила Ивановна — д. б. н. Тел. 977-70-01.
Эл. почта: chrustaleva@timacad.ru.
Киров Илья Владимирович — Центр молекуля рной биотехнологии РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 977-70-01.
Сальник Алёна Александровна — Центр молекулярной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева.
