CC BY
67
УДК 577.212.3: 635.25/.26: 615.322
КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ АЛЛИНАЗУ И СИНТАЗУ ФАКТОРА СЛЕЗОТЕЧЕНИЯ
И.В. КИРОВ, Д.В. РОМАНОВ, И.А. ФЕСЕНКО, Л.И. ХРУСТАЛЕВА
(Центр молекулярной биотехнологии, кафедра генетики и биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева)
Авторами клонированы и секвенированы гены aллинaзы и синтазы фактора слезотечения (LFS). Эти гены кодируют ферменты, вовлеченные в один метаболический путь и ответственные за выработку веществ, характеризующих специфический запах и вкус лука. Анализ нуклеотидных последовательностей клонов, несущих 1100 п.н. фрагмент гена аллиназы Allium cepa, показал идентичность к ДНК-последовательности гена аллиназы, экспрессирующегося в луковице A. cepa (L48614.1, номер в Gen Bank). BLASTN-анализ клонов с фрагментом гена аллиназы A. fistulosum выявил 95% гомологии к последовательности гена аллиназы, экспрессирующегося в луковице A. cepa, и 73% гомологии к последовательности аллиназы A. fistulosum (AF409954.1). Таким образом, мы впервые изолировали и секвенировали экзон-интронный фрагмент нового гена аллиназы A. fistulosum. Анализ последовательностей ДНК-клонов, несущих 550-570 п.н. вставки LFS гена A. cepa и A. fistulosum, показал высокую гомологию к гену LFS (AB089203). Путем множественного выравнивания последовательностей ДНК-гена LFS A. cepa и A. fistulosum было выявлено 15 однонуклеотидных замен, 80% которых составили транзиции. В работе обсуждается геномная организация и эволюция генов, кодирующих аллиназу и LFS.
Ключевые слова: фактор слезотечения, Allium cepa, Allium fistulosum, аллиназа, LFS, клонирование и секвенирование генов.
Долгое время считалось, что аллиназа — это ключевой фермент, отвечающий за специфический запах и вкус лука, а также за выработку пропантиал S-оксида, летучего соединения, вызывающего слезотечение (фактор слезотечения, lachrymatory factor, LF). Однако в 2002 г. Imai и др. [5] было показано существование ещё одного фермента, необходимого для образования пропантиал S-оксида, который был назван синтаза фактора слезотечения (lachrymatory factor synthase, LFS). Этот фермент взаимодействует с 1-пропенилсульфеновой кислотой, которая образуется из 1-пропенил-L-цистеин сульфооксида (PRENCSO) при участии фермента аллиназы и катализирует образование фактора слезотечения (LF).
После этого открытия картина образования соединений, ответственных за специфические характеристики лука, кратко сводилась к следующему: после расщепления ферментом аллиназой её субстрата — PRENCSO — образуется сульфеновая кислота, которая по своей природе нестабильна и трансформируется в тиосульфи-наты. Промежуточным продуктом трансформации сульфеновой кислоты является 1-пропенилсульфеновая кислота, которая, взаимодействуя с LFS, трансформируется в пропантиал S-оксид. В отсутствии LFS 1-пропенилсульфеновая кислота будет полностью трансформироваться в тиосульфинаты [5]. Последние очень неустойчивы
и могут давать начало целому ряду соединений, являющихся теми компонентами рода Allium, которые и обуславливают биологическую ценность этого рода для здоровья человека. Современные исследования показали, что содержащиеся в луке суль-фаторганические соединения обладают выраженным противораковым эффектом [1] и снижают агрегацию тромбоцитов [2], т.е. предупреждают образование тромбов.
Знания о метаболизме специфических соединений луковых и о ферментах, участвующих в их образовании, позволили выдвинуть предположение, что инактивация гена LFS могла бы привести не только к утере луками свойства вызывать слезотечение, но и к качественному и количественному изменению тиосульфинатов. Результаты, подтверждающие эту возможность, были предоставлены Eady и др. [4] в работе по исследованию лука репчатого c «выключеным» геном LFS.
Важная роль аллиназы и синтазы фактора слезотечения (LFS) в формировании специфических вторичных метаболитов у луковых и широкое использование видов этого рода не только в пищу, но и в медицинских целях обуславливают необходимость разносторонних исследований этих ферментов и генов, их кодирующих.
У A. cepa известны три различных гена аллиназ с тканеспецифической экспрессией — один ген экспрессируется в тканях луковицы [16] и два гена — в корне [3, 8]. Тем не менее общее количество копий каждого из этих генов неизвестно. Так, для A. cepa было показано наличие двух или трёх копий гена аллиназы (изоформа I), экспрессирующегося в корне (All1) [3]. Число копий двух других генов аллиназ (алли-наза корня (изоформа II) [8] и луковицы [16]), обнаруженных в геноме A. cepa, было примерно оценено при генетическом картировании. Так, в 1998 г. King и др. [7] показали наличие двух копий гена аллиназы из луковицы и картировали их в группе сцепления А (хромосома 1 [10]) на расстоянии 6.9 сМ друг от друга. Кроме этого недавно был картирован ген аллиназы (изоформа II), экспрессирующийся в корне в группе сцепления I (хромосома 6 [10]), а позднее показано наличие второй копии данного гена на хромосоме 4 [10].
Точная информация о генах аллиназ у видов, близких A. cepa, практически отсутствует. Гены были обнаружены у A. tuberosum (Chinese chives) [9], A. ascalonicum (shallot) [16] и A. sativum [16, 14]. Между тем многие из этих видов являются донорами агрономически ценных свойств. Один из таких видов — лук батун, A. fistulo-sum — является не только широко возделываемой культурой, но и потенциальным источником генов устойчивости к ржавчине (Urocystis cepulae Frost) [6], шейковой гнили (Botrytis squamosa Walker), луковой мухе (Hylemyia antique Bouche), корневой гнили (Phoma terrestris E.M. Hans.) [13], устойчивости к холоду, a также генов, контролирующих высокое содержание сухого вещества [17]. Наличие такого широкого спектра хозяйственно ценных признаков у этого вида побуждают к проведению работ по открытию и секвенированию новых генов, что позволит создавать маркеры и вести MAS-селекцию (маркер-опосредованная селекция). Последнее, в свою очередь, создаст платформу для более эффективного и быстрого получения новых сортов и гибридов между A. cepa и A. fistulosum.
Гены, кодирующие LFS, были выделены у A. cepa (номер в GenBank AB0S9203.1, AB094593.1), A. ascalonicum (AB094593), A. fistulosum (AB094590, AB094591), A. chi-nense (AB094592), A. porrum (AB094594, AB04595) и A. ampeloprasum (AB09496). Остаётся дискуссионным вопрос о количестве копий данного гена в геномах представителей рода Allium. Поиск новых вариантов гена LFS может пролить свет на данный вопрос и в то же время позволит изучить связь между проявлением ценных признаков рода Allium и аллельным состоянием данного гена. В своих исследованиях мы поставили задачу определить нуклеотидную последовательность генов, кодирую-
щих аллиназу в геноме A. fistulosum, и синтазы фактора слезотечения (LFS) в геноме двух близкородственных видов A. cepa и. A. fistulosum.
В данной статье представлены результаты клонирования и секвенирования фрагментов генов аллиназы и LFS у видов A. cepa и A. fistulosum, амплифицирован-ных при помощи ПЦР со специфицескими праймерами. Обсуждаются особенности организации данных генов.
Материалы и методы
Работа была выполнена на растениях лука репчатого Allium cepa L., сорт Халцедон, и A. fistulosum L., сорт Русский зимний, выращенных в горшках в теплице при естественном освещении.
Геномную ДНК выделяли из молодых листьев СТАВ-методом согласно протоколу [15].
Для подбора праймеров Allbe1(r, f), LFS1(r, f) и LFS2(r, f) использовали программу Primer 3.
Праймеры для гена аллиназы подбирали на нуклеотидную последовательность гена аллиназы из луковицы [16] — L4S614.1, а для гена LFS — на AB0S9203 (номера в GenBank).
Результаты подбора праймеров представлены в таблице.
ПЦР-смесь содержала: 1xTaq-буфер, 2,5 ед. Taq-полимеразы (Си-лекс), 2,5 М MgCl2, 0,2 мМ dNTP, по
0,2 цМ праймеров, 50 нг ДНК. Условия амплификации: 94° — 30 с, Tm° — 45 с, 72° — 90 с — 35 циклов. Tm — для Allbe1(r, f) — 5S°C, для LFS1(r, f) и LFSm(r, f) — 55°C.
Для клонирования использовали вектор pCR2.1-TOPO (Invitrogen).
Секвенироваиие полученных клонов проводили на генетическом анализаторе ABI 3130xl с использованием набора красителей BigDye v3.1 или BigDye v1.1 (Applied Biosystems).
Для постановки реакции были использованы следующее соотношение компонентов: смесь RR — 4 мкл, буфер для секвенирования — 2 мкл, праймер — 0,7 мкл.
Для проведения реакции были использованы следующие условия: начальная денатурация: 960С — 5 мин, (960С —
10 с, 500С —10 с, 600C — 4 мин) — 40 циклов, хранение при 40С.
Результаты и их обсуждение
Клонирование и секвенирование гена аллиназы. Для поиска и определения нуклеотидных последовательностей генов аллиназы в геноме A. fistulosum была использована пара праймеров Allbe 1, которая позволяет амплифицировать область гена между вторым и пятым экзонами. В результате ПЦР-реакции с геномной ДНК
1 2
1500
юоа. ш
Рис. 1. Результаты электрофореза продуктов ПЦР с праймерами Allbel и геномной ДНК A. cepa (1) и A. fistulosum (2)
Нуклеотидные последовательности подобранных праймеров
Allbelf ggt-cat-ctc-cct-ttc-acc-aa
Allbelr ttg-atc-aaa-ctc-aaa-cgc-ac
LFSIf aca-aag-cca-gag-caa-gca-tgg-aca
LFSIr ctg-caa-acc-tct-tcg-att-ttc-tga-cct-atc
LFS2f agt-cgc-tga-tag-tgc-taa-cgg-a
LFS2r tca-agc-act-gca-aac-ctc-ttc-g
бо
A. cepa и A. fistulosum были получены фрагменты ДНК размером около 1100 п.н. у обоих видов (рис. 1).
Длина ПЦР-продукта совпадала с теоретически ожидаемым размером. Поскольку фермент аллиназа кодируется семейством генов у лука репчатого, мы предположили, что полученный ПЦР-продукт может быть неоднородным. Поэтому для определения нуклеотидной последовательности амплифицированных ПЦР-про-дуктов использовали клонирование в плазмидный вектор, последующий отбор клонов и их секвенирование.
Всего были отобраны и секвенированы 10 клонов, содержащих Allbe 1 -фрагменты гена аллиназы A. cepa и A. fistulosum. Нуклеотидные последовательности были проанализированы с использованием программы BLASTN, с помощью которой был проведен поиск в базе данных GenBank. В результате была установлена идентичность полученных нами нуклеотидных последовательностей A. cepa к нуклеотидной последовательности гена аллиназы A. cepa (L4S614.1). При анализе в базе данных Allbe1-фрагментов гена аллиназы A. fistulosum наибольшая гомология наблюдалась к нуклеотидной последовательности гена аллиназы, экспрессирующегося в луковице A. cepa (L4S614.1), которая составила 91%, в то время как гомология к имеющемуся в базе данных сиквенсу гена аллиназы A. fistulosum (AF409954.1) составила лишь 73%.
Результаты обработки данных в программе GenDoc позволили определить, что нуклеотидные последовательности фрагментов аллиназы у A. cepa и A. fistulosum были схожи на 91%. Различия обусловлены как однонуклеотидными заменами, так и делециями от 1 до 12 п.н., встречающимися исключительно в интронах гена (рис. 2).
Для более точного отображения картины схожести генов трёх типов аллиназ с использованием программы ClustalW на сервере www.align.genome.jp была построена дендрограмма (рис. 3). Согласно данным дендрограммы, полученным для генов аллиназ A. cepa, выделяются три кластера, каждый из которых соответствует определённому члену семейства аллиназ: ген аллиназы A. cepa из луковицы и два гена, кодирующие две изоформы аллиназы A. cepa из корня. Аллиназы и их гены
Л ОСр! АішІмпі
А cef*» Л £*мкжт Л арі Л £*м1йшт Л OCfU A Mtlmm Aocpi A fratbwm
Л
Л й£р1 Л ЁтЬздт
А сер»
Л
А сс(Ч» A fiaikaam
Г 11.4; 14 ч I
ПСС ГО Л Г
гстст \ \
Ми; г Л Л
ЛАСТТАЛ Г ЛлСГГ ч г I \ССЛЛЛТС \ССЛЛАТС СТСТССТТ
«тстсстт
\ЛСТ ЛС'ЛА \АСТЛСЛА
С‘Г\С\Т \т ( ( К I I VL
л л г л і с Г т
А Ч I АС С <|Т (XCAGCGC t^GACCtit
исслсслт с;селселт \ТС ЧС АСА гТСССАСА , .... ... С. 1 \ К. I \ I ССС сCATC с.е; е і с; л гс \ATCCCCC \Лтсслее
СССТТТСлСС
СССТТТСАСС
nrvrvTvrvr
ThYrhn 2
ЛЛЛСЛЛЛлі л 4. ЛАСА А А ■ ■ Л ССС». ATT АСС СССЛЛТТЛСС
АЛЛ Г А ГСAC T
ЛЛАТ АТСACT
\ТСТТТГТ Л ГСТ1іиілл
ЛАТІ Л А ГС
л<лслс
А IЛСЛС
СССЛСТССТI GCCACTCCг•
отт^гтг \гтл и іілиилс1U стстт Г ЛСЛС С ТС Г Г с ас; ас;
С ТССЛССЛСЛ CTGlлееАСл
t-Cїлилеліл А А СА ЛАСАЛЛ
A IСТЛЛАСТТ ЛССТАЛЛСТТ
\С\СТТТЛТТ Л С и. I Л I Л I 1
лтлс тттслс ЛТЛIтттслс
С САП CCaT I
ЛАСТА
ЛАСТА
ССЛТСЛЛСЛ
ССЛССЛЛСЛ
тс; Л ЛС ЛСТ ТС Г IЛЛСЛСТТС АТ ААЛСССАТ АТС ААСССЛТ ТАТСлТСТТС
тлтелтеттс
гтгтш\^тгтугттгтк
1 1ALL 1 елел 1LI ! І і ІЛ ТЛЛЛТТАССТ СССССС ТСЛТ т лл а г г лея; г ссссс г гс; лт ТТСеССАСАА ЛСЛСЛССТлС ТТСIССаСал лСлСлССТСС СССлССТСлл слслтттсст ССС ЛССТСАЛ СаСаТт тсст
Ч \ \ \4.( I I I <
ллллсеттсс тгтттт чттг
г гстестлтс гтстестлтс
I е 1C 1 ЛІЛІ 1 Л І і <-ТАТСАТСАСА ССТ ТАТСАТСЛСЛ сет ТСЛЛТЛСССЛ АЛЛ ГСллт АС г Сл лас;
АТССЛТ
АТССЛТ
сс ЛС лс
СС ЛС АС
ЛАСТ ее \СЛС ллстееГСлС с; САЛА г селі сСалатеелт ТТТЛСЛЛТСТ ТТТЛСЛЛТСТ
rrrvr rtTr^
АЛАССЛТСЛА АЛЛСССТСЛЛ
слтсастс*а слтсч;с гс *.
Т ТТ САСЛАЛС
тттесслллс
лслллстслл
ТСАЛЛСТСЛЛ
гл лсїлтлтлт
АЛЛСЛIЛ LA L—
с;с;с; г с; л лс тс ссс; тс; л лс; гс; с;с; і тт сс а ас
ССс; ТТССЛЛС
САлТТСЛТ 1C Слс;ттелтс С
I 44 (. Ч I Ч И.
ГТлССлТАТС
СТЛАЛТЛСЛС
етлллтлслс
\Г\Т\Т ТТ\Г ALAlAlІІЛА АС ГС ТС Т ЛТ Л АСС СТСТАТА ЛАТТСТЛЛЛЛ >4 А т ’ СТЛАЛА
г г лсс;с лс лс
ТЛЛСЛС АС АС ТЛТТССЛЛТТ Т АТТССЛАТТ
**^ТТ \Т \fi \m
ТС.ЛАТСССАЛ ТС ЛАТССС АА 4ГАСС Г АС ТСС СлСС Слстес
лслтссттлс
ЛСЛТССТТЛС СТГТACTACT СТТТЛСТЛСТ ТССлСлСТСТ ТСС AC ACT СТ СТТ ^ГГТ \ \СГ
ЛТЛАЛТТСТТ АТллСТТСТТ СЛЛСТТЛ ГАС сллсттлс лс; стссстлллт
CTCCCTЛАЛТ лет ТСаСс; лС АС ГТСАСАЛС
G А АС; АСЛАЛС КЛАС ЛС'ЛА АС Г ГАТСТСССТ
ттлтстсест
СТ гс; СТ ел и; СТТССТСЛСС ТСТТ\ГТГ\Г леї і AL ,mmm AAGAAAGCCT л лс; a a лс;с;с; r ТТСАССТЛА Г ТТСАССТЛАС
сссетслттл
ссеетслттл
ССТлСТС'. ч I GGTACTCiSAT
ЖИтсл
СЛАТТЛСЛТС
САЛТТЛСЛТС
салтссттал
СЛАТССТТЛЛ АТСлСТССАТ лтелетсслт Л АТС АСл< < I ллтслДс С I \ТС
і \ і \Л LAA lii ATТССТАССЛ ЛТТСIТАССЛ Г ГСAGTTTCA Т ГС АС Г ГТСЛ
С С I I Ч I I ч
ест Г IТ ГА I
\Г\ТГ\ТТ I
.........
с; лс гс;с; лл с; ас; тс;с;лл ссслсллс ссс лсллс сесслл тс сесслл тс
с;с;с; i nc.f с;с;с; г л тс; г (ill
С I I I Ч Ч I Г
2
213 і Is 112 198 142
4TS
ЛТ2
5»
552
\ ч ч \ ч ч( ч
С АС ЛСЛАА с ч< чі. ч ч ч
ст сс; лтл ч СТССлТле
Л ГС С С С А Г ЛТССССЛТІ
CAT Г ТСЛС.
С АТТТСЛЛ
Л А 1№2 ЛЛ 1106
6JO
612
ТЮ
TI2
790
$Т0 *72 ■>1* 952 101s ICJ2
Рис. 2. Выравнивание сиквенсов фрагментов аллиназ у A. cepa и A. fistulosum
у A. fistulosum изучены слабо. Так, на сегодняшний день в мировой базе генетических данных GenBank помещена лишь одна нуклеотидная последовательность мРНК гена аллиназы A. fistulosum.
Рис. 3. Дендрограмма (алгоритм Neighbor-Joining) генов аллиназ после множественного выравнивания с помощью ClustalW (http://www.genome.jp)
Согласно данным дендрограммы, ген аллиназы A. fistulosum (AF409954.1) имеет высокую гомологию к гену A. cepa, кодирующему аллиназу из корня. Возможно, AF409954.1 также экспрессируется в ткани корня A. fistulosum. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена аллиназы A. fistulosum, клонированного в данной работе, имеет высокую гомологию к гену A. cepa, кодирующему аллиназу из луковицы. Полученные результаты позволяют предположить, что нами клонирован фрагмент нового гена аллиназы A. fistulosum. На основании схожести сиквенса данного фрагмента с изученными генами аллиназы A. cepa мы можем выдвинуть предположение об экспрессии данного гена в ткани луковицы A. fistulosum. Для подтверждения этих предположений необходимы дополнительные исследования по изучению экспрессии данного гена в различных тканях.
Клонирование и секвенирование гена LFS. Для амплификации гена LFS были разработаны две пары праймеров, одна из которых позволяла специфически ам-плифицировать данный ген только у A. cepa (LFS1), а вторая позволяла амплифицировать LFS-ген у обоих видов A. cepa и A. fistulosum (LFS2). После амплификации с праймерами LFS1 с геномной ДНК A. cepa был получен ПЦР-продукт размером около 550 п.н. (рис. 4 а), ас геномной ДНК A. fistulosum ПЦР-продукт не был получен (рис. 4 б). При использовании второй пары праймеров Рис- 4 ДЦР с праймерами LFS1 и геномной
(LFS2) были получены 1ЩР'-продукты размером 570 п.н. у днк a cepa (a) и обоих видов. p.. fistulosum (б)
I— 14
— 23
AB094S91.1 AB094590.1
7
11
г- 14.6
—AB094593.1
Полученные ПЦР-продукты были клонированы и секвенированы для изучения организации данного гена в геномах А. сера и А. fistulosum. Нуклеотидные последовательности были проанализированы с использованием базы данных ОепБапк. В результате нам удалось отобрать и отсек-венировать последовательности 6 клонов А. сера и 2 клонов А. fistulosum (рис. 5).
Полученные нуклеотидные последовательности А. сера и А. fistulosum были использованы для множественного выравнивания. Результаты выравнивания показывают наличие однонуклеотидных замен как у сиквенсов от разных видов, так и между сиквенсами внутри одного вида. Всего было обнаружено 15 однонуклеотидных замен между шестью сиквенсами А. сера и 18 — между сиквенсами А. сера и А. fistulosum. Следует отметить, что 80% вышеуказанных отличий представляют собой транзиции. Преобладание транзиций в общем числе однонуклеотидных замен было отмечено и ранее как у растений (Arabidopsis ЛаНапа [12]), так и у человека [11]. С использованием полученных нами сиквенсов и сиквенсов из ОепБапк была построена дендрограмма (рис. 6).
гС
14.8
АВ089203
10
Рис. 5. Укорененённое N-J дерево сиквенсов генов LFS А. сера (7, 11, 9, 14.6, 14.8, 10) и А. Ши!оэит (14, 23), секвени-рованных в данной работе, и сиквенсов генов, найденных в NCBI ^094591.1, AB094590.1 — А., сера и AB094593.1, AB089203 — А. №и1овит)
ЬР3 А. сера (сиквенс получен -рз а. сера в данной работе) V (сиквенс получен \ в данной работе)
\ 1 ЬР3 А. сера (номер в \Л/ N08! - АВ089203)
LFS A. fistulosum (номер в NCBI - AB094590.1) \ ЬР3 А. сера ■ ^-^грз А. сера (сиквенс получен (сиквенс получен в данной работе) / в данной работе)
LFS A. fistulosum' (сиквенс получен в данной работе) -Р3 А. ИвМОвит (сиквенс получен в данной работе)
Рис. 6. Дендрограмма (алгоритм Neighbor-Joining) генов LFS после множественного выравнивания с помощью ClustalW (http://www.genome.jp)
Нуклеотидные последовательности А. сера и А. fistulosum, как это показано на рисунке 6, образуют два кластера. Кроме того, нуклеотидные последовательности А. сера гетерогенны, и внутри кластера можно выделить подкластеры. Последнее может быть свидетельством того, что нам удалось клонировать не только разные аллели генов ЬБ8, но и разные копии этого гена в геноме. Дальнейшие исследования по маркированию отдельных копий генов и анализу расщепляющейся популяции помогут ответить на вопрос о числе копий и их локализации на хромосоме.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию Российской Федерации в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России». Государственный контракт № П809.
Библиографический список
1. Block E. Garlic and Other Alliums / The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK,
2010.
2. Briggs W.H., Xiao H., Parkin K.L., Shen C., Goldman I.L. Differential inhibition of human platelet aggregation by selected Allium thiosulfinates. Agric. Food. Chem., 2000. 48. 5731-5.
3. Do G.S., Suzuki G., Mukai Y. Genomic organization of a novel root alliinase gene, ALL1, in onion // Gene, 2004. T. 325. Р. 17-24.
4. Eady C.C., Kamoi T., Kato M., Porter N.G., Davis S., Shaw M., Kamoi A., Imai S. Silencing onion lachrymatory factor synthase causes a significant change in the sulfur secondary metabolite profile// Plant Physiology, 2008. T. 147. P 2096-2106.
5. Imai S., Tsuge N., Tomotake M., Nagatome Y., Sawada H., Nagata T., Kumagai H. An onion enzyme that makes the eyes water // Nature, 2002. T. 419.
6. Jones J.A., Mann I.K. Onions and their allies / New York, 1963. T. 15. P 522-528.
7. King J.J., Bradeen J.M., Bark O., McCallum J.A., Havey M.J. A low-density genetic map of onion reveals a role for tandem duplication in the evolution of an extremely large diploid genome // Theor. Appl. Genet., 1998. T. 96. Р 52-62.
8. Lancaster J.E., Shaw M.L., Joyce M.D.P., McCallum J.A., McManusM.T. A Novel Alliinase from Onion Roots. Biochemical Characterization and cDNA Cloning // Plant Physiology, 2000. T. 122. Р 1269-1279.
9. Manabe T., Hasumi A., Sugiyama M., Yamazaki M., Saito K. Alliinase [S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxide lyase] from Allium tuberosum (Chinese chive) — purification, localization, cDNA cloning and heterologous functional expression // Biochem., 1998. T. 257. Р. 21-30.
10. Martin W.J., McCallum J., Shigyo M., Jakse J., Kuhl J.C., Yamane N., Pither-Joyce M., Gokge A.F., Sink K.C., Town C.D., Havey M.J. Genetic mapping of expressed sequences in onion and in silico comparisons with rice show scant colinearity // Mol. Gen. Genomics, 2005. T. 274. Р 197-204.
11. Nachman M. W., Crowell S.L. Estimate of the mutation rate per nucleotide in humans // Genetics, 2000. T. 156. Р 297-304.
12. Ossowski S., Schneeberger K., Lucas-Lledo J.I., Warthmann N., ClarkR.M., Shaw R.G., Weigel D., Lynch M. The rate and molecular spectrum of spontaneous mutations in Arabidopsis thaliana // Science, 2010. T. 327. Р 92-94.
13. Porter D.R., Jones H.A. Resistance of some of the cultivated species of Allium to pink root (Phoma terrestris) // Phytopathology, 1933. T. 23.
14. Rabinkov A., Zhu X.Z., Grafi G., Mirelman D. Alliin lyase (alliinase) from garlic (Allium sativum): biochemical characterization and cDNA cloning // Appl. Biochem. Biotechnol., 1994. 48. Р 149-171.
15. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from plant tissues / Kluwer Academic Publ., 1988. T. 1. Р 1-10.
16. Van Damme E.J.M., Smeets K., Torrekens S., Van Leuven F., Peumansi W.J. Isolation and characterization of alliinase cDNA clones from garlic (Allium sativum L.) and related species // Biochem., І992. T. 209. Р. 75І-757.
17. Van der Meer Q.P., Van Bennekom J.L. Improving the onion crop (Allium сера L.) by transfer of characters from Allium fistulosum L. // Biul Warzywniczy, І978. T. 22. Р. 87-9І.
Рецензент — к. б. н. М.Г. Дивашук
SUMMARY
We cloned and sequenced both allinase and lacrymatory factor synthase (LFS) genes that encoded enzymes operating in one metabolic way which produces compounds responsible for onion’s characteristic flavour. Sequence analysis of clones that possess 1100 b.p. allinase gene fragments from Allium cepa shows identity to nucleotides of the bulb allinase gene of Allium cepa from Genebank (L48614. 1). BLASTN analysis of A. fistulosum clones reveals 91% homology to the sequence of bulb allinase of Allium cepa and 73% homology to the sequence of the allinase gene of Allium fistulosum (AF409954. 1). Thus, we’ve isolated and characterized the exon-intron fragment of a new bulb allinase gene in A. fistulosum. Sequence analysis of clones possessing 550 - 570 b.p. insert of LFS gene from both Allium cepa and Allium fistulosum has shown high homology to LFS gene sequence from Genebank (AB089203). Multi alignment reveals 15 mononucleotide substitutions, most of them being transitions. Both genome organization and evolution of allinase and LFS genes are discussed.
Key words, lacrimation factor, Allium cepa, Allium fistulosum, allinase, cloning and sequencing of genes.
Киров Илья Владимирович — магистрант Центра молекулярной биотехнологии. Тел. (499) 977-72-01.
Романов Дмитрий Викторович — асп. Центра молекулярной биотехнологии. Тел. (499) 977-72-01.
Фесенко Игорь Александрович — к. б. н. Тел. (499) 977-72-01, (499) 976-08-94. Хрусталева Людмила Ивановна — д. б. н. Тел. (499) 977-72-01, (499) 976-08-94. Эл. почта: [email protected]
