CC BY
20
■ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕЖДИСЦИПЛИНАРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Зарубин Егор Алексеевич -аспирант Института клинической морфологии и цифровой патологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет);
врач-патологоанатом ГБУЗ «ММКЦ "Коммунарка" ДЗМ» (Москва, Российская Федерация) E-mail: zarubean@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-2548-9506
Ключевые слова:
коронавирусная инфекция; С0УЮ-19; патология легких; белки вируса БА1КБ-СсУ-2
Клинико-морфологический анализ поражения легких с определением клеточной локализации белков вируса SARS-CoV-2 в летальных случаях
Зарубин Е.А.1' 2, Коган Е.А.1, Жарков Н.В.1, Авдалян А.М.2, Проценко Д.Н.2
1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
2 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский многопрофильный клинический центр "Коммунарка" Департамента здравоохранения города Москвы», 108814, г. Москва, Российская Федерация
С0УШ-19 - быстрораспространяющееся вирусное заболевание, вызываемое вирусом БА1КБ-СсУ-2. При тяжелом течении С0УШ-19 основным органом-мишенью являются легкие, в которых развиваются различные формы поражения, обусловливающие отличающуюся морфологическую картину в дыхательной системе, клиническую картину и прогноз у различных пациентов.
Цель работы - анализ клеточной локализации белков вируса БА1КБ-СсУ-2 при различных формах поражения легких в летальных случаях С0УШ-19.
Материал и методы. Проспективное исследование на основании клинико-морфологического анализа вскрытий 118 пациентов в ММКЦ «Коммунарка» с использованием макроскопических и гистологических методов, а также иммуногистохимических реакций в парафиновых срезах для идентификации Брткв-белка и Nucleсcapsid вируса БА1КБ-СсУ-2. Полученный материал сканировался в цифровой формат, анализировался с применением морфометрических методик. Результаты. В ткани легких больных С0УШ-19 с летальным исходом изолированно или соче-танно могут развиваться диффузное альвеолярное повреждение и лимфоцитарный альвеолит. Вторичными формами являлись тромбоваскулит и бактериальная пневмония. Во всех исследованных случаях обнаружена С0УШ-ассоциированная коагулопатия. Вирусные белки определялись с различной интенсивностью и частотой преимущественно в цитоплазме макрофагов, пневмоцитов II типа и эндотелиоцитах при всех формах поражения легких. Заключение. Различные варианты поражения легких могут быть самостоятельными формами и развиваться изолированно друг от друга. Вирусные белки встречаются в одних и тех же клетках с разной частотой и интенсивностью при различных формах поражения легких, что может свидетельствовать о возможных общих механизмах поражения легких при С0УЮ-19 и о разных путях попадания вируса в ткань легких.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Зарубин Е.А., Коган Е.А., Жарков Н.В., Авдалян А.М., Проценко Д.Н. Клинико-морфологический анализ поражения легких с определением клеточной локализации белков вируса 5АКБ-СсУ-2 в летальных случаях С0УШ-19 // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского. 2023. Т. 11, № 1. С. 54-63. 001: https://dci.crg/10.33029/2308-1198-2023-11-1-54-63 Статья поступила в редакцию 01.02.2023. Принята в печать 22.02.2023.
Clinical and morphological analysis of lung lesions with determination of cellular localization of SARS-CoV-2 virus proteins in lethal cases of COVID-19
Zarubin E.A.1' 2, Kogan E.A.1, Zharkov N.V.1, Avdalyan A.M.2, Protsenko D.N.2
1 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
2 Moscow Multidisciplinary Clinical Center "Kommunarka", 108814, Moscow, Russian Federation
COVID-19 is a rapidly spreading viral disease caused by SARS-CoV-2 virus. In severe COVID-19, the main target organ is the lungs, in which various forms of damage develop, causing a different morphological picture in the respiratory system, clinical picture and prognosis in different patients in different waves.
The aim of the work is to analyze the cellular localization of SARS-CoV-2 virus proteins in various forms of lung damage in lethal cases of COVID-19.
Material and methods. A prospective study was performed on based of autopsies of 118 patients at the Kommunarka Medical Center using macroscopic and histological methods with immunohisto-chemical reactions. Antibodies against viral spike protein and nucleocapsid were used on paraffin sections of lung tissue. The resulting material was scanned into digital format and analyzed using morphometric techniques.
Results. In lung tissue of fatal COVID-19 patients diffuse alveolar damage and lymphocytic alveolitis may develop isolated or in combined. The secondary form was thrombovasculitis and bacterial pneumonia. In all examined cases, COVID-associated coagulopathy was detected. Viral proteins were determined with different intensity and frequency mainly in the cytoplasm of macrophages, type II pneumocytes and endotheliocytes in all forms of lung damage.
Conclusion. Various types of lung lesions can be independent forms and develop in isolation from each other. Viral proteins occur in the same cells with different frequency and intensity in different forms of lung damage, which may indicate possible common mechanisms of lung damage in COVID-19 and different ways the virus enters the lung tissue.
OORRESPONDENCE
Egor A. Zarubin -Graduate Student, Institute of Clinical Morphology and Digital Pathology, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University); Pathologist, Moscow Multidisciplinary Clinical Center "Kommunarka" (Moscow, Russian Federation) E-mail: zarubean@gmail.com https://orrid.org/0000-0002-2548-9506
Keywords:
coronavirus infection; COVID-19; lung pathology; SARS-CoV-2 viral proteins
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
For citation: Zarubin E.A., Kogan E.A., Zharkov N.V., Avdalyan A.M., Protsenko D.N. Clinical and morphological analysis of lung lesions with determination of cellular localization of SARS-CoV-2 virus proteins in lethal cases of COVID-19. Clinical and Experimental Surgery. Petrovsky Journal. 2023; 11 (1): 54-63. DOI: https://doi.org/10.33029/2308-1198-2023-11-1-54-63 (in Russian)
Received 01.02.2023. Accepted 22.02.2023.
Новая коронавирусная инфекция (С0УЮ-19) -быстрораспространяющееся инфекционное заболевание, вызванное вирусом SARS-CoV-2. В настоящее время количество зарегистрированных случаев заболевания во всем мире превышает 627 млн, а количество летальных исходов -более 6,5 млн [1]. Течение пандемии COVID-19 сопровождалось характерными для респираторных вирусных инфекций волнами, с периодичными, резкими всплесками заболеваемости. Даты начала и конца волн расплывчаты, официально не зарегистрированы и отличаются в зависимости от страны. В Российской Федерации 1-я волна заболеваемости пришлась на начало пандемии с марта по август 2020 г., 2-я волна - с октября 2020 г. по май 2021 г., 3-я волна - с сентября 2021 г. по январь
2022 г. С каждой новой волной течение заболевания отличалось от предыдущей по следующим параметрам: различная скорость распространения, вирулентность микроорганизма и тяжесть поражения восприимчивого организма. [2] Изменчивость течения болезни можно объяснить как появлением новых штаммов, так и совершенствованием медицинской помощи, которое приводило к изменению удельного веса морфологических вариантов поражения органов. При этом сходной характеристикой у большинства пациентов с COVID-19 является поражение дыхательной системы на всех ее уровнях: от полости носа до просвета альвеол. Поражение паренхимы легких неоднозначно: могут развиться несколько основных состояний, таких как диффузное альвеолярное повреждение (ДАП), лимфо-
цитарный альвеолит, бронхопневмония, тромбо-васкулиты с коагулопатией [3-6]. В патогенезе органных поражений при С0У10-19 важнейшую роль играют белки вируса - Б-белок (спайк) и нуклео-капсид. Имеются сообщения об экспрессии Б-белка и нуклеокапсида в различных клетках ткани легких, однако подробная информация в литературе отсутствует [3]. А. Zhu и соавт. показали, что определение локализации вируса может иметь клиническое значение. В частности, обнаружение БА1КБ-СсУ-2 в тромбоцитах является маркером потенциального летального исхода [4]. Однако до сих пор неизвестно, в каких клетках локализуются эти белки, связана ли их локализация с особенностями развивающейся патологии легких, может ли их расположение влиять на прогноз.
Цель данного проспективного исследования -клинико-морфологический анализ поражения легких, а также определение клеточной локализации белков вируса БА1КБ-СсУ-2 в летальных случаях С0У10-19. Задачи исследования - описание морфологических особенностей различных вариантов поражения легких, анализ клеточной локализации белков БА1КБ-СсУ-2, оценка различных форм поражения легких, определение частоты их встречаемости, а также сравнение полученных данных за периоды 1, 2 и 3-й волны в Москве.
Материал и методы
Нами проведено 118 вскрытий умерших от БА1КБ-СсУ-2, изучены клинико-лабораторные данные по историям болезни, установлены первоначальные и непосредственные причины смерти, проанализированы гистологические препараты. В зависимости от периода смерти больных составлены 2 группы: 1-я группа включала 59 пациентов (50%), умерших во 2-ю волну; 2-я группа - 59 (50%), умерших в период 3-й волны. Критериями включения в каждую группу явились следующие параметры: коронавирусная инфекция - первоначальная причина смерти; наличие вируса БА1КБ-СсУ-2, подтвержденное прижизненным и/или посмертной полимеразно-цепной реакцией (ПЦР) мазка слизистой оболочки полости рта и/или носа; упоминание о поражении легких в заключительном патолого-анатомическом диагнозе; полная стационарная медицинская документация.
Макроскопическое исследование: в каждом исследуемом случае на вскрытии забирались фрагменты из пораженных участков ткани легких, затем проводилась фиксация в буферном 10% растворе формалина и парафинизация.
Микроскопическое исследование: изготавливались серийные парафиновые срезы с последующей окраской гематоксилином и эозином. В 32 случаях (27%): была проведена иммуногистохимическая
реакция (ИГХ) с использованием моноклональных антител к нуклеокапсиду и S-белку. ИГХ-реакция проводилась на депарафинированном материале в 13 случаях 2-й волны и в 19 случаях 3-й волны. Основанием для отбора случая для ИГХ-исследова-ния являлось наличие определенного варианта поражения легких, выявленного при гистологическом исследовании.
ИГХ-реакция проводилась на серийных парафиновых срезах. Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 30 мин, согласно предусмотренной фирмой-производителем спецификации к антителу. В качестве первичных использовались следующие антитела: SARS-Cov-2 (COVID-19) Spike Polyclonal Rabbit Antibody, производитель GeneTex (cat. #GTX135356), разведение 1:500, а также SARS-Cov-2 (COVID-19) Nucleocapsid Polyclonal Rabbit Antibody, производитель GeneTex (cat. #GTX135357), разведение 1:500 по стандартным методикам. При постановке ИГХ-реакций в обязательном порядке ставили положительные и отрицательные контроли.
Морфометрический анализ: все ИГХ-микропре-параты были отсканированы с помощью гистоска-нера Leica Aperio AT2 и проанализированы с применением и количественной оценкой окрашенных клеток в приложении QuPath. В каждом препарате было выбрано не менее 150 макрофагов, 150 пнев-моцитов II типа и 150 эндотелиоцитов, среди которых подсчитывались окрашенные клетки. Проводился статистический анализ непараметрическим методом для малых выборок по Манну-Уитни.
Результаты
Клинико-морфологический анализ
В 83% случаев 2-й волны и в 81,3% случаев 3-й волны смерть наступила в период с 8-го по 28-й день заболевания. Самой распространенной непосредственной причиной смерти (54,2%) во 2-ю волну явилось ДАП (клинически - острый респираторный дистресс-синдром, ОРДС). 2-е место по частоте занимает легочно-сердечная недостаточность (22%), 3-е - септический шок (18,6%). В 3-й волне самой частой непосредственной причиной смерти явился септический шок (45,7%), на 2-м месте - ДАП (27,11%), на 3-м - легочно-сердечная недостаточность (23,7%). Среди остальных смертельных осложнений также встречались, но существенно реже: отек головного мозга, гемо-тампонада перикарда, тромбоэмболия легочных артерий и острая постгеморрагическая анемия.
Таким образом, самым опасным с точки зрения потенциального летального исхода был период с 8 по 28-й день заболевания, а самыми частыми причинами смерти - ДАП и сепсис.
В (С)
Макроскопическое исследование
У пациентов, умерших от COVID-19, в экссуда-тивную фазу ДАП макроскопически легкие увеличены в размере, полностью заполняют плевральные пространства. Консистенция легких плотная, поверхность разреза красного цвета, «лакированного» вида (рис. 1А). С поверхности обильно стекает розовая пенистая жидкость. В пролифе-ративную фазу легкие более плотные, серовато-бордового цвета, «мясистого» или «войлочного» вида на разрезе (рис. 1Б). При затяжном течении заболевания на макроскопической картине обнаруживались тяжи белесовато-серой волокнистой фиброзной ткани с формированием в отдельных случаях «сотового легкого».
При присоединении вторичной флоры развивалась крупозная (см. рис. 1Б) или очаговая пневмония (рис. 1В) с характерными для них морфологическими проявлениями в виде красного или серого «опеченения» легких либо зернистости поверхности разреза. В отдельных случаях пневмония носила деструктивный характер с формированием абсцессов (см. рис. 1В-Г).
У всех исследованных пациентов были выявлены макроскопические признаки COVID-ассоциированной коагулопатии либо в виде фокусов кровоизлияний в плевральных листках, слизистой дыхательных путей и в ткани легких,
■¿у кшШ< т
Б (В)
Г (D)
либо тромбов и тромбоэмболов в просветах ветвей легочных артерий, геморрагических инфарктов легких (см. рис. 1Б).
Гистологическое исследование
При микроскопическом исследовании в ткани легких были обнаружены следующие патологические процессы: диффузное альвеолярное повреждение, лимфоцитарный альвеолит, очаговая или крупозная пневмония при присоединении вторичной флоры.
Рис. 1. Макроскопическое исследования легких: А - диффузное альвеолярное повреждение, фаза экссудации. «Лакированная» красная поверхность разреза с кровоизлияниями (стрелка); Б - диффузное альвеолярное повреждение, фаза пролиферации. Красно-серая плотная «мясистая», «войлочная» ткань легких с геморрагическим инфарктом (стрелка), крупозная пневмония в стадии серого опеченения (пунктирная стрелка);
В - субтотальная очаговая пневмония;
Г - вирусно-бактериальная пневмония,хронический абсцесс легкого (стрелка)
Fig. 1. Macroscopic examination of the lungs. A - diffuse alveolar damage, exudation phase. Lacquered red cut surface with hemorrhages (arrow); B - diffuse alveolar damage, proliferation phase. Reddish gray dense "fleshy" "felt" lung tissue with hemorrhagic infarction (arrow), lobular pneumonia in the stage of gray hepatization (dashed arrow); C - subtotal bronchopneumonia; D - viral-bacterial pneumonia, chronic lung abscess (arrow)
Диффузное альвеолярное повреждение
При микроскопическом исследовании легких признаки диффузного альвеолярного повреждения в стадии экссудации (рис. 2А) были выявлены в 53 случаях 2-й волны (89,8%), причем у 10 (17%) пациентов они поражали практически всю площадь исследованных фрагментов. В 3-ю волну признаки ДАП в стадии экссудации наблюдались в 57 случаях (96,6%). ДАП в стадии пролиферации проявлялся в виде плоскоклеточной метаплазии альвеолярного и бронхиального эпителия в совокупности с остатками гиалиновых мембран (рис. 2Б). Во 2-ю волну процент наблюдений признаков пролиферативной фазы ДАП составил 35 случаев (59,4%), в 3-ю - 32 (54,3%). В единичных наблюдениях в ткани легких определялись немногочисленные гигантские многоядерные клетки по типу клеток инородных тел.
Рис. 2. Микроскопическое исследование легких: А - диффузное альвеолярное повреждение, фаза экссудации; Б - диффузное альвеолярное повреждение, фаза пролиферации; В - лимфоцитарный альвеолит, тромбоваскулит; Г - бактериальная очаговая пневмония. Окраска гематоксилином и эозином х 20
Fig. 2. Microscopic examination of the lungs. A - diffuse alveolar damage, exudation phase; B - diffuse alveolar damage, proliferation phase;
C - lymphocytic alveolitis, thrombovasculitis; D - bacterial focal pneumonia. Hematoxylin and eosin stain х 20
А (А)
Б (В)
В экссудативную и пролиферативную фазы ДАП, помимо вышеописанных проявлений, определялся реактивный аденоматоз в виде выраженной пролиферации пневмоцитов II типа с полной выстилкой просветов альвеол и формированием же-лезистоподобных структур.
Лимфоцитарный альвеолит
В 36 случаях (61%) 2-й волны наблюдались признаки альвеолита, сопровождающиеся воспалительной инфильтрацией межальвеолярных перегородок в виде очаговых и диффузных лим-фоцитарных скоплений (рис. 2В). Альвеолиты иногда протекали с развитием интерстициального фиброза. В нашем исследовании альвеолит регистрировался только при выраженной воспалительной инфильтрации. В большинстве случаев признаки альвеолита встречались не более чем
в 39 случайных полях зрения из 100, что может говорить о малом объеме поражения, а характер инфильтрации был очаговый. В 3-ю волну признаки альвеолита встречались в 24 случаях (40,7%) и не чаще чем в 29 полях зрения.
Тромбоваскулит и COVID-ассоциированная коагулопатия
В некоторых случаях было отмечено развитие васкулитов, характеризующихся нейтрофильной и лимфоцитарной инфильтрацией сосудов мелкого калибра с развитием в отдельных случаях фибриноидного некроза стенки. В просветах сосудов с вышеописанной морфологической картиной определялись тромбы красного и смешанного вида (см. рис. 2В). Во 2-й волне признаки тромбо-васкулита наблюдались в 19 случаях (32,2%), в 3-й волне - лишь в 7 (11,9%). У умерших
Клеточная локализация белков вируса и доля окрашенных клеток при разных вариантах поражения легких при 2-й и 3-й волнах пандемии в Москве
Средняя доля окрашенных клеток, % 2-я волна 3-я волна
макрофаги пневмоциты II типа эндотелио-циты макрофаги пневмоциты II типа эндотелио-циты
ДАП, фаза экссудации S 84,6 87,7 17 89,2 92,9 24,8
N 87 95,8 29,3 93,3 88,6 43,9
ДАП, фаза пролиферации S 78 100 28 96 98,8 31,9
N 89 100 39 97,3 99,5 43,9
Адено-матоз S 92,9 98,5 16,5 96,9 99,4 35,7
N 93,8 99,9 30,5 97,3 99,5 43,5
Альвеолит S 94 - 30 87,1 - 18,6
N 84,1 - 36,6 83,3 - 27,3
Тромбо-васкулит S - - 11 - - 13,3
N - - 23 - - 27,1
Примечание. ДАП - диффузное альвеолярное повреждение; S - Spike-протеин; N - nucleocapsid.
в 1-ю волну коронавирусной инфекции морфологические признаки воспаления сосудистой стенки встречались в 75% случаев.
Несмотря на то что воспаление сосудистой стенки встречалось относительно редко, признаки коагулопатии в виде красных тромбов в просветах сосудов мелкого и крупного калибра наблюдались во всех исследуемых случаях в 1, 2 и 3-й волнах [5]. Поражение сосудов микроциркуляторного русла и мелкого калибра проявлялось в виде сладж-феномена и образования тромбов. В некоторых случаях микротромбоз сопровождался дальнейшим развитием интраальвеолярных кровоизлияний, порой занимающих большую площадь микропрепарата.
Бронхопневмония
Бактериальная и грибковая пневмония диагностирована в виде скоплений лейкоцитов в просветах мелких бронхов и альвеол (рис. 2Г). Во 2-ю волну бронхопневмония встречалась в 47 (79,7%) случаях, в 3-ю волну - в 31 (52,6%).
Резюмируя вышесказанное, обращает на себя внимание то, что варианты поражения легких могут отличаться от случая к случаю, однако в различные волны картина схожая: на 1-е место выступает поражение микроциркуляторного русла с развитием особого варианта ДВС-синдрома при новой коронавирусной инфекции - СОУЮ-ассоциированной коагулопатии, проявляющейся преимущественно тромбообразованием, а не геморрагическим синдромом.
Иммуногистохимическое исследование
При проведении ИГХ-реакции с антителами против вирусных белков (Б-белок и нуклеокапсид) окрашивание обнаруживалось с самых ранних сроков заболевания в цитоплазме и реже в ядрах различных клеток (рис. 3А, Б). Наиболее часто ви-
русные белки обнаруживались в альвеолярных макрофагах, пневмоцитах как I, так и II типа, в эндо-телиоцитах, лейкоцитах и в бронхиальном эпителии.
Визуализация альвеолоцитов I типа представляла трудности ввиду их тонкой структуры и скудного количества цитоплазмы, но в случаях их набухания и слущивания экспрессия вирусных белков наблюдалась отчетливо. Вирусные белки были также обнаружены в мезотелии висцеральной плевры. Клеточная локализация вирусных белков и количество окрашенных клеток отличались в зависимости от варианта поражения легких.
Диффузное альвеолярное повреждение в стадии экссудации
При исследовании случаев 2-й и 3-й волны вирусные белки обнаружены в альвеолярных макрофагах, пневмоцитах 2-го порядка и эндотелиоцитах (см. рис. 3А-З) (см. таблицу).
Диффузные альвеолярные повреждения в стадии пролиферации
Белки вируса обнаруживались в тех же клетках, однако с большей частотой в пневмоцитах II типа, особенно в очагах аденоматоза. Кроме того, высокая частота окрашивания клеток антителами против вирусных белков выявлялась в очагах плоскоклеточной метаплазии эпителия, достигая 100% во 2-ю волну (см. таблицу). При этом отмечено некоторое увеличение частоты экспрессии вирусных белков в макрофагах и в эндотелии сосудов в 3-й волне.
Альвеолит
У пациентов, в ткани легких которых определялась выраженная воспалительная инфильтрация легочного интерстиция, окрашивание определялось в эндотелиоцитах, а также в макрофагах, которые присутствовали в составе воспалительного ин-
В (С)
Рис. 3. Иммуногистохими- А (А) ческое исследование: локализация Spike (А) и NucLeocapsid (Б) в цитоплазме альвеолярных макрофагов и эндотелиоцитов в начале заболевания (2-е сутки); локализация Spike (В) и NucLeocapsid (Г) в цитоплазме альвеолярных макрофагов, пневмоцитов II типа и в гиалиновых мембранах во время экссудативной фазы диффузного альвеолярного повреждения (ДАП); локализация Spike (Д) и NucLeocapsid (Е) в цитоплазме пневмоцитов II типа в состоянии плоскоклеточной метаплазии во время пролиферативной фазы ДАП; локализация Spike (Ж) и NucLeocapsid (З) в цитоплазме пневмоцитов II типа при аденоматозе. Иммунопероксидазная реакция с ДАП х 40
Fig. 3. Immunohistoche- Д (E)
micaL examination. Localization of Spike (A) and NucLeocapsid (B) in the cytopLasm of aLveoLar macrophages and endotheLiocytes at the earLy phase of the disease (2nd day). LocaLization of Spike (C) and NucLeocapsid (D) in the cytopLasm of aLveoLar macrophages, pneumocytes type II, and in hyaLine membranes during the exudative phase of DAP. LocaLization
of Spike (E) ж (G) and NucLeocapsid (F) in the cytopLasm of pneumocytes type II in a state of squamous metapLasia during the proLiferative phase of DAP. LocaLization of Spike (G) and NucLeocapsid (H) in the cytopLasm of pneumocytes type II in adenomatosis. Immunoperoxidase reaction with DAB х 40
Б (В)
Г (D)
Е (F)
З (H)
100 ■ ■ ■ 1 III I.- .Il II. Ill
Диффузионное Васкулит Бактериальная Альвеолит Коагулопатия
альвеолярное повреждение пневмония
И Умершие в 1-ю волну H Умершие во 2-ю волну H Умершие в 3-ю волну
фильтрата. Во 2-й волне экспрессия S-белка была обнаружена в 94% макрофагов и 30% эндотелио-цитов. Окрашивание нуклеокапсидом определялось в 84,1% макрофагов и 36,6% эндотелиоцитов (см. таблицу). В 3-ю волну окрашивание S-белком было выявлено в 83,3% макрофагов и 27,3% эндотелиоцитов. Окрашивание нуклеокапсидом обнаружено в 86,6 и 31,1% эндотелиоцитов.
Тромбоваскулит
Экспрессия вирусных белков анализировалась в цитоплазме эндотелиоцитов и макрофагов. Во 2-ю волну окрашивание S-белком была выявлено в 11% эндотелиоцитов, нуклеокапсид был обнаружен в 23% клеток. В 3-ю волну было обнаружено окрашивание антителами против S-белка 13,3% эндотелиоцитов, экспрессия нуклеокапсида составила 27,1%.
Обсуждение
Клинико-морфологический анализ летальных случаев SARS-CoV-2 инфекции показал, что непосредственной причиной смерти чаще всего являлось ДАП, а летальный исход наступал на 8-28-е сутки заболевания, что должно служить поводом к повышенному вниманию к пациентам, у которых данное состояние диагностируется клинически в виде ОРДС особенно в этот период заболевания.
В различные волны встречаемость разных форм поражения легких отличалась (рис. 4). В 1-ю волну признаки ДАП встречались несколько реже: в 76% случаев [5]. В нашем исследовании были обнаружены случаи развития только ДАП или только лимфоцитарного альвеолита без сочетания с какими-либо другими вариантами поражения легких, что говорит о самостоятельности этих форм пора-
жения легких. Все случаи тромбоваскулитов были ассоциированы с другой патологией ткани легких, что может говорить об их вторичности в патогенезе коронавирусной инфекции. Наше наблюдение о том, что ДАП является доминирующим вариантом поражения легких, находит свое подтверждение и в зарубежной литературе [9].
Альвеолит был обнаружен в 92% случаев 1-й волны, что существенно выше, чем в нашем исследовании. Данное наблюдение может являться следствием разных подходов к терапии пациентов с тяжелыми формами С0УЮ-19 и добавлением высоких доз глюкокортикоидов в последующие волны, имеющие положительный эффект в отношении снижения частоты данных вариантов поражения легких.
Бронхопневмония была выявлена в 25% случаев во время 1-й волны [5]. Количество случаев присоединения вторичной флоры разнится от волны к волне и, скорее всего, является не особенностью отдельных штаммов БА1КБ-СсУ-2, а особенностью отдельно взятых пациентов. Несмотря на более низкую встречаемость бактериальной пневмонии в 3-ю волну, сепсис чаще являлся непосредственной причиной смерти, что может быть связано как с наличием других инфицированных источников в организме, так и с возможными особенностями вирусных частиц в отношении запуска механизмов сепсиса, однако данная концепция до сих пор не нашла своего подтверждения.
Особенности клеточной локализации белков вируса
При ИГХ-исследовании мы обнаружили локализацию вирусных белков при различных вариантах поражения легких в одних и тех же клетках, что может свидетельствовать о широкой троп-ности вируса и наличии единых звеньев в пато-
Рис. 4. Частота встречаемости различных вариантов поражения легких у умерших в 1, 2 и 3-й волны в Москве, % общего числа исследуемых случаев
Fig. 4. The frequency of various variants of lung damage in patients who died in the 1st, 2nd and 3rd waves in Moscow, measured in % of the total number of cases studied. Burgundy - lethal cases in the 1st wave, violet -in the 2nd wave, blue -in the 3rd wave
генезе различных вариантов поражения легких вне зависимости от изученных волн С0УЮ-19. Самое частое и самое интенсивное накопление белков было обнаружено в альвеолярных макрофагах, пневмоцитах II типа и эндотелиоцитах, что может объясняться непосредственной тропностью вируса к вышеуказанным клеткам и их участием на различных этапах в патогенезе С0УЮ-19. По нашим данным и данным литературы, важную роль в патогенезе ДАП при коронавирусной инфекции играют альвеолярные макрофаги [6], которые в первую очередь контактируют с вирусными частицами, поступающими при помощи аэрогенного механизма, что подтверждается крайне высокой частотой окрашивания этих клеток при разных формах поражения легких: при затяжном течении диффузного альвеолярного повреждения эта частота достигала 100%. В фазе пролиферации ДАП было выявлено окрашивание всех (100%) исследованных пневмоцитов II типа, что указывает на их непосредственную роль в патогенезе С0УЮ-19, и это также подтверждается данными публикаций [7].
Большую роль играют и эндотелиоциты [8], окрашивание которых наблюдалось менее часто. Эндотелиоциты могут выступать как самостоятельные звенья в механизмах развития С0УЮ-19, а также как возможный источник гематогенной диссеминации вирусных частиц.
В совокупности с данными о том, что различные формы поражения легких могут встречаться изолированно друг от друга, можно судить о различных путях проникновения вируса в ткань легких: либо аэрогенно с развитием ДАП или острой интерсти-циальной пневмонии, либо гематогенно с развитием тромбоваскулитов и коагулопатии.
Литература
1. COVID-19 Map - Johns Hopkins Coronavirus Resource Center [Electronic resource]. URL: https://coronavirus.jhu.edu/ map.html
2. Tracking SARS-CoV-2 Variants [Electronic resource]. URL: https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-vari-ants/ (date of access March 31, 2022).
3. Zinserling V.A., Semenova N.Y., Bikmurzina A.E., Kruglova N.M., Rybalchenko O.V., Markov A.G. SARS-CoV-2-induced pathology - relevance to COVID-19 pathophysiology // Pathophysiology. 2022. Vol. 29, N 2. P. 281-297.
4. Zhu A., Real F., Capron C., Rosenberg A.R., Silvin A., Dun-smore G. et al. Infection of lung megakaryocytes and platelets by SARS-CoV-2 anticipate fatal COVID-19 // Cell. Mol. Life Sci. [Electronic resource]. 2022. Vol. 79, N 7. P. 365. URL: https://pmc/ articles/PMC9201269/ (date of access November 14, 2022).
5. Коган Е.А., Демура С.А., Березовский Ю.С., Эргешов А.Э., Голухова Е.З., Рыбка М.М. и др. Формы-фазы патологических изменений в легких при новой коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 // Вестник ЦНИИТ. 2020. № 4. С. 49-63.
References
1. COVID-19 Map - Johns Hopkins Coronavirus Resource Center [Electronic resource]. URL: https://coronavirus.jhu.edu/ map.html
Коагулопатия встретилась в 100% случаев, что в совокупности с наличием вирусных белков в гиалиновых мембранах также может свидетельствовать о первостепенности поражения сосудистого русла с дальнейшим распространением вирусных частиц из просветов сосудов в альвеолярные пространства, что, в свою очередь, позволяет рассматривать С0УЮ-19 не просто как респираторную инфекцию, а как системный сосудистый инфекционный процесс, полное понимание патогенеза которого требует дальнейших наблюдений и тщательного анализа.
Заключение
Поражение легких при инфекции БА1КБ-СсУ-2 может проявляться в виде ДАП и лимфоцитарного альвеолита, которые являются самостоятельными формами и могут развиваться изолированно друг от друга. Чаще всего встречались признаки С0УЮ-ассоциированной коагулопатии, однако доминирующей непосредственной причиной смерти явился ДАП. Встречающиеся тромбоваскулит и очаговая/ крупозная пневмония развиваются вторично по отношению к вышеописанным вариантам.
С учетом результатов ИГХ основными участниками в патогенезе коронавирусной инфекции являются альвеолярные пневмоциты II типа, макрофаги и эндотелиоциты. Окрашивание вирусными частицами этих клеток при различных формах поражения может свидетельствовать о перекрестных механизмах патогенеза. Наличие клеточных белков в вышеописанных клетках на поздних стадиях заболевания может являться потенциальной причиной дальнейшего развития постковидного синдрома, однако необходимы дальнейшие исследования.
6. Kosyreva A., Dzhalilova D., Lokhonina A., Vishnyakova P., Fatkhudinov T. The role of macrophages in the pathogenesis of SARS-CoV-2-associated acute respiratory distress syndrome // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. P. 1667.
7. Calkovska A., Kolomaznik M., Calkovsky V. Alveolar type II cells and pulmonary surfactant in COVID-19 era // Physiol. Res. [Electronic resource]. 2021. Vol. 70, suppl. 2. P. S195. URL: https:// pmc/articles/PMC8884364/ (date of access January 30, 2023).
8. Hui K.P.Y., Cheung M.C., Lai K.L., Ng K.C., Ho J.C.W., Pei-ris M. et al. Role of epithelial-endothelial cell interaction in the pathogenesis of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection // Clin. Infect. Dis. [Electronic resource]. 2022. Vol. 74, N 2. P. 199-209. URL: https://pubmed.ncbi.nlm. nih.gov/33956935/ (date of access January 20, 2023).
9. Upadhya S., Rehman J., Malik A.B., Chen S. Mechanisms of lung injury induced by SARS-CoV-2 infection // Physiology (Bethesda) [Electronic resource]. 2022. Vol. 37, N 2. P. 88-100. URL: https://journals.physiology.org/doi/10.1152/ph ysiol.00033.2021 (date of access November 7, 2022)
2. Tracking SARS-CoV-2 Variants [Electronic resource]. URL: https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-vari-ants/ (date of access March 31, 2022).
3. Zinserling V.A., Semenova N.Y., Bikmurzina A.E., Krug-lova N.M., Rybalchenko O.V., Markov A.G. SARS-CoV-2-induced pathology - relevance to COVID-19 pathophysiology. Pathophysiology. 2022; 29 (2): 281-97.
4. Zhu A., Real F., Capron C., Rosenberg A.R., Silvin A., Dun-smore G., et al. Infection of lung megakaryocytes and platelets by SARS-CoV-2 anticipate fatal COVID-19. Cell Mol Life Sci [Electronic resource]. 2022; 79 (7): 365. URL: https://pmc/articles/ PMC9201269/ (date of access November 14, 2022).
5. Kogan E.A., Demura S.A., Berezovsky Yu.S., Ergeshov A.E., Golukhova E.Z., Rybka M.M., et al. Forms-phases of pathological changes in the lungs in the new coronavirus infection caused by SARS-CoV-2. CTRI Bulletin. 2020; (4): 49-63. (in Russian)
6. Kosyreva A., Dzhalilova D., Lokhonina A., Vishnyakova P., Fatkhudinov T. The role of macrophages in the pathogenesis of SARS-CoV-2-associated acute respiratory distress syndrome. Front Immunol. 2021; 12: 1667.
7. Calkovska A., Kolomaznik M., Calkovsky V. Alveolar type II cells and pulmonary surfactant in COVID-19 era. Physiol Res [Electronic resource]. 2021; 70 (suppl 2): S195. URL: https:// pmc/articles/PMC8884364/ (date of access January 30, 2023).
8. Hui K.P.Y., Cheung M.C., Lai K.L., Ng K.C., Ho J.C.W., Peiris M., et al. Role of epithelial-endothelial cell interaction in the pathogenesis of severe acute respiratory syndrome coro-navirus 2 (SARS-CoV-2) infection. Clin Infect Dis [Electronic resource]. 2022; 74 (2): 199-209. URL: https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/33956935/ (date of access January 20, 2023).
9. Upadhya S., Rehman J., Malik A.B., Chen S. Mechanisms of lung injury induced by SARS-CoV-2 infection. Physiology (Bethes-da) [Electronic resource]. 2022; 37 (2): 88-100. URL: https:// journals. physiology.org/doi/10.1152/physiol.00033.2021 (date of access November 7, 2022)
