CC BY
84
Клинический случай преодоления бесплодия, обусловленного мужским фактором (глобозооспермией 1-го типа), методом интрацитоплазматической инъекции морфологически нормального сперматозоида с активацией ооцитов Оа2+-ионофором
В.В. Литвинов1, 2, А.Н. Сулима2, 3, М.А. Харитонова1, А.А. Клепуков1, И.Ю. Ермилова1, Ю.Ю. Маклыгина1
'ООО «ЭКО центр», клиника «АльтраВита»; Россия, 117186 Москва, ул. Нагорная, 4А; 2ООО «Медицинская клиника "Ваш Доктор"»; Россия, Республика Крым, 295017Симферополь, ул. Зои Жильцовой, 4; 3Медицинская академия им. С.И. Георгиевского — подразделение ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского»; Россия, Республика Крым, 295051 Симферополь, б-р Ленина, 5/7
Контакты: Владимир Валентинович Литвинов [email protected]
Представлен случай лечения супружеского бесплодия, вызванного мужским фактором — тяжелой формой тератозооспермии (тотальной глобозооспермией 1-го типа). Данная патология встречается крайне редко (у 0,1 % пациентов с андрологическими заболеваниями). Глобозооспермия 1-го типа — недостаточно изученное тяжелое нарушение сперматогенеза, которое приводит к абсолютному мужскому бесплодию. В описанном клиническом случае для лечения были использованы вспомогательные репродуктивные технологии, а именно метод интрацитоплазматической инъекции морфологически нормального сперматозоида с активацией ооцитов Са2+-ионофором А23187. Наступившая беременность и последующие роды протекали благоприятно.
Ключевые слова: глобозооспермия, Са2+-ионофор, экстракорпоральное оплодотворение, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида, интрацитоплазматическая инъекция морфологически нормального сперматозоида, беременность, клинический случай
Для цитирования: Литвинов В.В., Сулима А.Н., Харитонова М.А. и др. Клинический случай преодоления бесплодия, обусловленного мужским фактором (глобозооспермией 1-го типа), методом интрацитоплазматической инъекции морфологически нормального сперматозоида с активацией ооцитов Са2+-ионофором. Андрология и генитальная хирургия 2019;20(3):00—00.
DOI: 10.17650/2070-9781-2019-20-3-00-00
The clinical case of infertility treatment caused by male factor (globozoospermia type 1) by the intracytoplasmic morphologically normal sperm injection with activation of the oocytes by Ca2+-ionophore
V. V. Litvinov1,2, A.N. Sulima2,3, M.A. Kharitonova1, A.A. Klepukov1, I. Yu. Ermilova1, Yu. Yu. Maclygina1
ECO-Center, AltraVita Clinic; 4A Nagornaya St., Moscow 117186, Russia;
2Medical Clinic Vash Doctor; 4 Zoi Zhiltsovoy St., Simferopol 295017, Republic of Crimea, Russia;
3S.I. Georgievsky Medical Academy — structural unit of the V.I. Vernadsky Crimean Federal University; 5/7 Lenina Blvd,
Simferopol 295051, Republic of Crimea, Russia
A case of infertility treatment in couple with a male factor, the severe form of teratozoospermia (total globozoospermia (type 1)) was presented. This pathology is extremely rare (0.1 % at andrologicalpatients). Globozoospermia (type 1) is an insufficiently studied disease and is a severe disorder of spermatogenesis that leads to 100 % of male infertility. Assisted reproductive technologies with using of intracytoplasmic morphologically normal sperm injection and the activation of oocytes — by Ca2+-ionophore A23187 in a man with globozoospermia (type 1) helped in the treatment of infertility in matrimony. Pregnancy and childbirth proceeded favorably.
Key words: globozoospermia, Ca2+-ionophore, in vitro fertilization, intracytoplasmic sperm injection, intracytoplasmic morphologically normal sperm injection, pregnancy, clinical case
For citation: Litvinov V. V., Sulima A.N., Kharitonova M.A. et al. The clinical case of infertility treatment caused by male factor (globozoospermia type 1) by the intracytoplasmic morphologically normal sperm injection with activation of the oocytes by Ca2+-ionophore. An-drologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2019;20(3):00—00.
Введение
Первые в СССР экспериментальные исследования оплодотворения яйцеклетки человека in vitro проведены Григорием Николаевичем Петровым в 1955—1966 гг. в Крымском медицинском институте на кафедре гистологии и эмбриологии (руководитель Б. П. Хватов) [1]. Позже, в 1969 г., эмбриолог Роберт Эдвардс (Robert Edwards) и гинеколог Патрик Стептоу (Patrick Steptoe) из Кембриджа (Великобритания) заявили о разработке методики in vitro fertilization (оплодотворения яйцеклетки вне организма). Через 9 лет после неоднократных попыток оплодотворения полученных ооцитов в естественных циклах, их оплодотворения, дробления и переноса эмбриона в полость матки одна из них успешно завершилась наступлением беременности и родами 25 июля 1978 г. (Великобритания, Олдем, клиника Борнхолл). Так началась эра вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в мире.
В России первый ребенок, зачатый путем оплодотворения яйцеклетки in vitro, появился в 1986 г. благодаря группе проф. Б.В. Леонова, в которую входили гинекологи Е.А. Калинина и В.А. Лукин (г. Москва). Б. В. Леонов стал и автором термина «экстракорпоральное оплодотворение» (ЭКО). В первые годы развития ВРТ в программах ЭКО участвовали пациентки исключительно с трубно-перитонеальным фактором бесплодия. Позже, по мере развития ВРТ и с появлением метода аспирации сперматозоидов человека из эпидидимиса (microsurgical epididymal sperm aspiration) в 1988 г., метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) в 1992 г. [2] и метода интрацитоплазматической инъекции морфологически нормального сперматозоида (intracytoplasmic morphologically normal sperm injection, IMSI) в 1999 г. (разработанного проф. Б. Барту и соавт. (Израиль)), ЭКО стало незаменимой технологией в лечении мужского бесплодия. В 2005 г. на очередной конференции Европейской ассоциации специалистов по репродукции человека (European Society of Human Reproduction and Embryology) мужской фактор бесплодия признан абсолютным показанием к ЭКО.
По данным руководства Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), около 15 % сексуально активных пар обращаются за медицинской помощью с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 1 года. При этом около 50 % случаев бесплодия обусловлено мужским фактором [3]. Данные ВОЗ согласуются с результатами статистического анализа случаев бесплодия в супружеских парах, обратившихся за лечением в 2015—2017 гг. в клиники «ЭКО Центр» («АльтраВита», Москва) и «Ваш Доктор» (г. Симферополь), где мужской фактор бесплодия был диагностирован в 40 и 43 % случаев соответственно.
Причины снижения фертильности у мужчин разнообразны: врожденные аномалии мочеполовых органов, варикоцеле, нарушения эрекции и эякуляции, иммунологические факторы, урогенитальные инфекции, обструкция семявыносящих путей, заболевания эндокринной системы (гипо-, гипергонадотропный гипогонадизм), генетические отклонения, новообразования половой сферы, повреждение сперматогенно-го эпителия, вызванное облучением или химиотерапией, системные заболевания, вредные привычки, попадание в организм токсичных веществ, нередко прием лекарственных препаратов.
Почти в 30 % случаев мужского бесплодия диагностируются его идиопатические формы [3]. Для пациентов с идиопатическими формами бесплодия характерно отсутствие в анамнезе явных факторов риска, отсутствие отклонений от нормы при физикальном осмотре и нормальный гормональный профиль при наличии изменений в спермограмме: олигозооспермии, астенозооспермии или тератозооспермии, а также их сочетаний [4]. Согласно результатам исследований ВОЗ заболеваемость мужским бесплодием в странах Африки варьирует от 4,2 до 6,3 %, а в Центральной и Восточной Азии данный показатель самый низкий на планете — до 3 %. Развитые страны Европы и Северной Америки отличаются высокой заболеваемостью мужским бесплодием [5].
Генетически обусловленное мужское бесплодие относится к наименее распространенным формам. Так, по данным M.D. Johnson, частота выявления хромосомных аномалий у бесплодных мужчин составляет 5,8 % [6], при этом мутации, сцепленные с Y-хромо-сомой, составили 4,2 % случаев, а отклонения в ауто-сомных хромосомах — 1,5 %.
Одной из форм генетически обусловленного мужского бесплодия является глобозооспермия, представляющая собой грубые нарушения морфологической структуры сперматозоида. Распространенность данной патологии у мужчин с бесплодием, по данным I. AntonLamprecht и соавт., не превышает 0,1 %. Данная форма тератозооспермии наиболее характерна для североафриканской популяции, в которой ее частота у мужчин с бесплодием достигает 1,0 % [5].
Диагноз глобозооспермии ставят на основании данных морфологического исследования сперматозоидов, при котором выявлен дефект головки в виде ее округлой формы, а также отсутствие или выраженный дефект акросомы. Формирующаяся в результате мутации округлая головка не способна к связыванию с блестящей оболочкой (zona pellucida) яйцеклетки, а дефект акросомы приводит к отсутствию в сперматозоиде гидролитических ферментов (гидролаз), необходимых для растворения блестящей оболочки и проникновения сперматозоида в ооцит. При глобозооспермии в ряде случаев отсутствуют изменения количественных характеристик
спермограммы, а также подвижности сперматозоидов. Из-за характерного для данной патологии вида сперматозоидов при микроскопии в литературе встречается и другое название — «синдром круглой головки сперматозоида».
В зависимости от количества пораженных сперматозоидов выделяют 2 типа глобозооспермии: 1-й тип — тотальная глобозооспермия, при которой поражается 100 % сперматозоидов, и 2-й тип — частичная глобо-зооспермия, при которой доля пораженных сперматозоидов в эякуляте варьирует от 40 до 80 % [7].
Вопрос исключительно генетической природы развития глобозооспермии в определенной мере остается открытым, однако исследования последних лет все чаще указывают на связь с хромосомными аномалиями. Так, при анализе хромосомного аппарата сперматозоидов методом флуоресцентной гибридизации (fluorescence in situ hybridization) частота анеу-плоидии у пациентов с глобозооспермией превысила показатели контрольной группы в 1,8 раза (0,66 % против 0,37 %), преобладающими при этом являлись анеуплоидии 13, 16 и 21-й хромосом. На генетическую природу глобозооспермии указывают случаи семейной глобозооспермии. Предполагаются различные варианты наследования: Х-сцепленное, аутосомно-доминантное и аутосомно-рецессивное. На данный момент доказано развитие глобозооспермии в гомозиготном состоянии при делеции в гене DPY19L2 и миссенс-мутации в гене PICK, а также мутациях в гене SPATA16 [8]. Для всех вышеназванных мутаций характерно развитие у пациентов тотальной глобозооспермии (1-го типа).
PICK1 представляет собой цитозольный протеин, участвующий в белковом обмене. При миссенс-му-тации в гене PICK в гомозиготном состоянии не происходит слияния проакросомальных везикул и формируется округлая головка сперматозоида. Данный тип мутации также характеризуется аутосомно-ре-цессивным типом наследования.
SPATA16 — протеин, проявляющий свою активность в проакросомальных пузырьках и аппарате Гольджи, который участвует в формировании акро-сомы и сперматогенезе [9]. Для носителей мутаций в гене SPATA16 характерно снижение концентрации сперматозоидов в эякуляте.
DPY19L2 — акросомальный трансмембранный протеин, обеспечивающий фиксацию акросомы к ядру сперматозоида. Делеция в гене DPY19L2 в гомозиготном состоянии — наиболее часто выявляемая мутация при глобозооспермии. При мутации данного типа концентрация сперматозоидов в эякуляте пациентов нормальная или близкая к нормальной. Мутация в гене DPY19L2 характеризуется аутосомно-рецессив-ным типом наследования [10].
До разработки метода ICSI не существовало методов преодоления глобозооспермии вне зависимости
от ее типа. Первые сообщения об эффективном лечении глобозооспермии появились в 1994 г., когда K. Lundin и соавт. сообщили об эффективном оплодотворении методом ICSI и наступлении беременности от мужчины с частичной глобозооспермией (2-го типа) [11]. Однако, несмотря на достигнутый прогресс, эффективность ВРТ у данной категории пациентов остается крайне низкой, положительные результаты применения ВРТ у них получены в единичных случаях.
Исследования последних лет свидетельствуют, что у пациентов с тотальной глобозооспермией (1-го типа) исход лечения с применением ВРТ, возможно, взаимосвязан с типом генетической мутации. Так, ассоциированные с мутацией в гене SPATA16 глобозооспермии на сегодня являются наиболее неблагоприятными для реализации репродуктивных планов: в научной литературе нет сведений о случаях эффективного использования ВРТ и достижения положительных результатов у данной категории пациентов. Как правило, единственным выходом для таких пациентов становятся программы ВРТ с использованием донорской спермы.
При тотальной глобозооспермии (1-го типа), обусловленной делецией DPY19L2, в отличие от SPATA16, описаны случаи наступления беременности после ICSI с дополнительной активацией ооцитов Са2+-ионофо-ром [11-13].
Представляем случай лечения супружеского бесплодия, вызванного мужским фактором — тяжелой формой тератозооспермии (тотальной глобозооспер-мией 1-го типа).
Клиническое наблюдение
В 2012 г. в клинику «Ваш Доктор» (г. Симферополь) обратилась супружеская пара с жалобами на отсутствие беременности в течение 2 лет 6 мес регулярной половой жизни без использования контрацепции. Супруги были обследованы в объеме, регламентированном приказом Минздрава России от 30 августа 2012 г. № 107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению».
Супруга, 28лет, беременностей не было. Менструации с 14 лет 6 мес, установились сразу, регулярные (через 28 дней), по 4—5 дней, умеренные, безболезненные. На диспансерном учете у смежных специалистов не состояла, операций не было. Наследственный анамнез не отягощен. Результаты объективного осмотра, кли-нико-лабораторного и инструментального обследований в пределах физиологической нормы. Уровень гормонов крови в 3-й день менструального цикла в пределах нормы: фолликулостимулирующего гормона (ФС1) — 6,34мМЕ/мл, лютеинизирующего гормона (ЛГ) — 8,54 мМЕ/мл, эстра-диола — 176 пмоль/л, пролактина — 442 мМЕ/л, тире-отропного гормона — 2,5 мМЕ/л, свободного тироксина —
АНДРОЛОГИЯ
И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
ANDROLOGY
AND GENITAL SURGERY
3
10,6 пмоль/л. Ультразвуковое исследование органов малого таза особенностей не выявило, овариальный резерв достаточный. Инфекции, передающиеся половым путем, не обнаружены. Маточные трубы проходимы. Кариотип — 46;ХХ. Заключение смежных специалистов: соматически здорова.
Супруг, 34 года, детей не имел. На диспансерном учете у смежных специалистов не состоял, операций не было. У родного младшего брата есть ребенок. В семье по мужской линии проблем с фертильностью не было. Результаты объективного осмотра и общеклинического клинико-лабо-раторного и инструментального обследований в пределах физиологической нормы. Заключение смежных специалистов: соматически здоров. Уровень гормонов крови в пределах нормы: ФСГ — 1,78мМЕ/мл, ЛГ — 2,27мМЕ/мл, эстрадиола — 85пмоль/л, тестостерона — 20,06нмоль/л, тиреотропного гормона — 2,27 мМЕ/мл, пролактина — 243 мМЕ/л, глобулина, связывающего половые гормоны, — 19 нмоль/л; индекс свободного тестостерона — 107,8 %. Кариотип — 46;XY, микроделеции (в локусах AZFa, AZFb, AZFc) в участках Y-хромосомы не обнаружены. Предварительная оценка качества спермы выявила у 100,0 % сперматозоидов головку круглой формы без акросомы, т. е. тотальную глобозооспермию (1-го типа).
На основании полученных данных был поставлен диагноз: женское бесплодие первичное, связанное с мужским фактором (глобозооспермией 1-го типа) (N97.4).
Для выработки дальнейшей тактики обследования и лечения пациенты были направлены в ООО «ЭКО центр» (клиника «АльтраВита», г. Москва).
Анализ качества спермы дал аналогичные результаты: подтверждена тотальная глобозооспермия (1-го типа) (табл. 1). С целью оценки ультраструктуры нативных сперматозоидов 100 из них были исследованы методом NASUM (native assessment of sperm ultramorphology) в специальном микроскопе, увеличивающем изображение в 20 тыс. раз, для визуализации отдельных хромосом, степени конденсации хроматина, митохондрий, акросо-мального аппарата, целостности мембран сперматозоидов (метод разработан к.б.н. С.А. Яковенко (Россия, ООО «ЭКО центр», клиника «АльтраВита»; название принадлежит проф. Б. Барту (Израиль)) (табл. 2).
Таблица 1. Предварительная оценка качества спермы Table 1. Preliminary evaluation of sperm quality
Показатели микроскопического исследования эякулята Норма [14]
Microscopic characteristics of the ejaculate Normal values [14]
Период воздержания, сут Abstinence time, days 5 3-7
Время разжижения, мин Liquefication time, min 15 <60
Объем эякулята, мл Ejaculate volume, ml 2,7 >1,5
Показатели микроскопического исследования эякулята Норма [14]
Microscopic characteristics of the ejaculate Normal values [14]
Вязкость эякулята, см Ejaculate viscosity, cm 2,0 <2,0
Цвет эякулята Ejaculate color Желтовато-серый Yellowish grey Серо-молочный Grey-opalescent
Агглютинация сперматозоидов Sperm agglutination Нет No Нет No
Агрегаты Aggregates Нет No Нет No
Эритроциты Erythrocytes Нет No Нет No
Эпителиальные клетки Epithelial cells Единичные Solitary Единичные Solitary
Лейкоциты, млн/мл Leukocytes, million/ml 0,2 <1,0
Незрелые половые клетки Immature germ cells Единичные Solitary 2-4 на 100 сперматозоидов 2-4 per 100 spermatozoa
Концентрация сперматозоидов
Камера анализа 1, млн/мл Counting chamber 1, million/ml 95
Камера анализа 2, млн/мл Counting chamber 2, million/ml 93 >15
Среднее значение, млн/мл Mean value, million/ml 94
Подвижность сперматозоидов (при 25 °С)
Категории А (с быстрым прямолинейным движением (>20 рм/с)), % Category A (rapid linear (>20 pm/s)), % 20 >20
Категории B (с медленным прямолинейным движением (<20 рм/с)), % Category B (slow linear (<20 pm/s)), % 43 >32 >40
Категории C (с непрямолинейным движением (<5 рм/с)), % Category C (non-linear (<5 pm/s)), % 3 <2
Категории D (неподвижные), % Category D (immotile), % 34 <60
Морфология сперматозоидов (по Крюгеру)
Нормальные формы, % Normal, % 0 >4
Дефекты головки, % Head defects, % 100
Дефекты шейки или средней части, % Neck and midpiece defects, % 19
Дефекты хвоста, % Principle piece defects, % 2
Цитоплазматические капли, % Excess residual cytoplasm, % 18
АНДРОЛОГИЯ
И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
ANDROLOGY
AND GENITAL SURGERY
3
Таблица 2. Результаты исследования сперматозоидов методом NASUM (native assessment of sperm ultramorphology) Table 2. Results of sperm evaluation using the NASUM method (native assessment of sperm ultramorphology)
Параметр строения Частота дефектов строения сперматозоидов, %
■iiiiiiiiililliilil Detects of sperm structure rati, %
Организация хроматина Chromatin organization 15
Хромоцентр Chromocenter 29
Ядерная мембрана Nuclear membrane 54
Митохондриальная оболочка Mitochondrial membrane 60
Аксонема Axoneme 8
Акросома Acrosome 100
Шейка Neck 30
Мембранные вакуоли Membrane vacuoles 5
В результате исследования сперматозоидов данным методом в 100 % случаев было обнаружено отсутствие акросомы и только в 5 % — мембранных вакуолей. Обращает на себя внимание то, что 85 % из них характеризовались нормальной организацией хроматина, а нормальная организация хромоцентра была выявлена в 71 % наблюдений.
Учитывая полученные результаты, пациентам была предложена программа ВРТс использованием донорской спермы, от которой супруги отказались. Ввиду отсутствия литературных данных об эффективности программ ЭКО у пациентов с тотальной глобозооспермией
(1-го типа) и с учетом категорического желания пациентов осуществить попытку искусственного оплодотворения проведено пробное оплодотворение донорских криоконсервированных ооцитов спермой мужа методом ICSI — без эффекта (табл. 3). Спермограмма супруга в день оплодотворения: объем эякулята — 1 мл. Концентрация сперматозоидов — 200млн/мл. Доля сперматозоидов категории А — 12 %, категории B — 28 %. Морфологическое исследование сперматозоидов: 0 % нормальных форм по Крюгеру. Глобозооспермия (1-го типа).
После неудачного оплодотворения пациенты на протяжении 4 лет не проходили лечение. В 2016 г. супружеская пара вновь обратилась в ООО «ЭКО центр» (клиника «АльтраВита», г. Москва) с целью возобновить лечение с применением ВРТ, за исключением программ с использованием донорской спермы. Результаты обследования соответствовали полученным в 2012 г. и представленным выше.
Совместно с пациентами принято решение провести программу IMSI по протоколу с использованием антагонистов гонадотропного рилизинг-гормона (ГнРГ). Алгоритм индукции суперовуляции включал применение фоллитропина-а (гонала-Ф) в дозе 150 МЕ/сут с 3-го дня цикла (суммарная доза за курс — 1500 МЕ) и антагонистов ГнРГ цетрореликса (цетротида) в дозе 0,25мг/сут с 5-го дня цикла, а также введение в качестве триггера хориогонадотропина-а (овитреля) в дозе 250мкг (6500 МЕ) в 12-й день цикла. Пункцию фолликулов осуществляли на 14-й день цикла. В результате были получены 12 ооци-тов, 11 из которых были зрелыми (на стадии метафазы II деления мейоза).
Спермограмма супруга в день оплодотворения: объем эякулята — 2мл. Концентрация сперматозоидов — 70 млн/мл. Доля сперматозоидов категории А — 15 %, категории B — 21 %. Морфологическое исследование сперматозоидов: 0 % нормальных форм по Крюгеру. Глобозооспермия (1-го типа).
В результате проведенного оплодотворения методом IMSIс дополнительной активацией ооцитов Са2+-ионофором
Таблица 3. Результаты пробного оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида Table 3. Results of test fertilization using the intracytoplasmic sperm injection
Ооцит Oocyte День 0 Day 0 День 1 Day 1 День 2 Day 2 День 3 Day 3 День 4 Day 4 День 5 Day 5 День 6 Day 6
1 MII 0pN - - - - -
2 MII 0pN - - - - -
3 MII 0pN - - - - -
4 MII 0pN - - - - -
5 MII 0pN - - - - -
Примечание. MII — зрелые ооциты (на стадии метафазы IIделения мейоза). Note. MII — mature oocytes (at the metaphase of meiosis II).
3
Таблица 4. Результаты оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции морфологически нормального сперматозоида (intracytoplasmic morphologically normal sperm injection)
Table 4. Results of fertilization using the intracytoplasmic morphologically normal sperm injection procedure
Ооцит День 0 День 1 День 2 День 3 День 4 День 5 День 6
Oocyte Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6
1 MII 2pN 2b 4b 9b 12b 3BA
2 MII 0pN - - - - -
3 MII 0pN - - - - -
4 MII 0pN - - - - -
5 MII 0pN - - - - -
6 MII 0pN - - - - -
7 MII 0pN - - - - -
8 MII 0pN - - - - -
9 MII 0pN - - - - -
10 MII 0pN - - - - -
11 MII 0pN - - - - -
12 GV - - - - - -
Примечание. GV — герминальный везикул; MII — зрелые ооциты (на стадии метафазы II деления мейоза). Note. GV — germinal vesicle; MII — mature oocytes (at the metaphase of meiosis II).
был получен на 6-е сутки 1 эмбрион визуально хорошего качества (3ВА), который был криоконсервирован. Перенос криоконсервированного эмбриона проведен после размораживания через цикл с использованием заместительной гормональной терапии на 21-й день менструального цикла: эстрадиола валерат (прогинова) в дозе 2 мг 1 раз в день и эстрадиола гемигидрат (дивигель) в дозе 1 г 1 раз в день, микронизированный прогестерон (утрожестан) в дозе 600мг/сут интравагинально по стандартной схеме. Беременность не наступила (табл. 4).
В 2017 г. был начат короткий протокол индукции суперовуляции с антагонистами ГнРГ. Алгоритм индукции суперовуляции включал использование фоллитропина-а (гонала-Ф) в дозе 75 МЕ/сут (суммарная доза — 825МЕ) со 2-го дня цикла, менотропинов ФСГ и ЛГ (менопура) в дозе 75 МЕ/сут (суммарная доза ФСГ — 825 МЕ, ЛГ— 825МЕ), антагониста ГнРГ цетрореликса (цетротида) в дозе 0,25 мг/сут с 6-го дня цикла, а также введение в качестве триггерахорионического гонадотропина (Московский эндокринный завод ФГУП, Россия) в дозе 9000 МЕ на 12-й день цикла. Пункцию фолликулов осуществляли на 14-й день цикла. В результате были получены 9 ооцитов, 8 из которых были зрелыми (на стадии мета-фазы IIделения мейоза) (1 ооцит дегенеративный (deg)).
Спермограмма супруга в день оплодотворения: объем эякулята — 2 мл. Концентрация сперматозоидов — 76 млн/мл. Доля сперматозоидов категории А — 9 %, категории В — 24 %. Морфологическое исследование спер-
матозоидов: 0 % нормальных форм по Крюгеру. Глобо-зооспермия (1-го типа).
Ввиду выраженной патологии морфологической структуры сперматозоидов для обработки эякулята в данном протоколе был выбран метод «всплытия», что позволило избежать центрифугирования в градиенте плотности. После «всплытия» разжиженный эякулят помещали в пробирку, поверх наслаивали культуральную среду HEPES с 5 % содержанием белка в количестве 2 мл, пробирку помещали в термостат с температурой 37 °С на 30мин. Далее верхнюю часть среды перемещали в чистую пробирку и держали при комнатной температуре до проведения IMSI. Для оплодотворения отбирали сперматозоиды с прямолинейным движением.
После выполнения IMSIпроводили активацию оплодотворенных ооцитов Са2+-ионофором А23187, для чего выдерживали их в течение 15мин в СО2-инкубаторе в специальной среде, приготовленной на основе бикарбонатной культуральной среды с добавлением Са2+-ионофора А23187 в дозе 10мкмоль/л, после чего ооциты отмывали и культивировали по стандартной технологии.
В результате проведенного оплодотворения на 5-е сутки был получен 1 эмбрион визуально хорошего качества (3ВА) и осуществлен его перенос в полость матки. На 6-е сутки получен еще 1 эмбрион качества 4ВВ, который был криоконсервирован (табл. 5).
На 21-й день после эмбриотрансфера путем трансвагинального ультразвукового исследования была диагностирована
Таблица 5. Результаты оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции морфологически нормального сперматозоида (intracytoplasmic morphologically normal sperm injection) с активацией ооцитов Ca^-ионофором А23187
Table 5. Results of fertilization using the intracytoplasmic morphologically normal sperm injection procedure with Ca2+-ionophore А23187oocyte activation
Ооцит День 0 День 1 День 2 День 3 День 4 День 5 День 6
Day 5 Day 6
1 MII 2pN 2b 4b 6b cod A c. mor B (st)
2 MII 2pN 4а 6b 9b 12b st
3 MII 2pN 3b 5b 7b c. mor 4CC (st)
4 MII 2pN 3b 6b 14b cod B 4BB
5 MII 2pN 2b 6b 16a cod A 3BA
6 MII 2pN 4b 7b 12b c. mor 1С (st)
7 MII 0pN - - - - -
8 MII 0pN - - - - -
9 Deg - - - - - -
Примечание. Deg — дегенеративный ооцит; MII — зрелые ооциты (на стадии метафазы II деления мейоза). Note. Deg — degenerative oocyte; MII — mature oocytes (at the metaphase of meiosis II).
клиническая беременность. Наблюдение за течением беременности осуществлялось в женской консультации г. Симферополя. Беременность протекала без особенностей и завершилась срочными естественными родами (мальчик массой 3500 г, ростом 54 см, оценка по Апгар на 1-й минуте — 8 баллов, на 5-й минуте — 9 баллов). На данный момент развитие ребенка соответствует возрасту.
Заключение
1. Оплодотворение с использованием обработки сперматозоидов методом «всплытия» и проведением IMSI с активацией ооцитов Са2+-ионофором А23187 может быть использовано у пациентов с тяжелой формой тератозооспермии — тотальной глобозоо-спермией (1-го типа) с целью достижения положительного результата программ ВРТ.
2. Для уточнения генетической природы тотальной глобозооспермии (1-го типа) рекомендуется генетическое обследование пациента, а также его родственников-мужчин, не имеющих детей, для выявления мутаций и делеций в генах SPATA16, Р1СК1 и DPY19L2.
3. Ввиду отсутствия полных данных об этиологических факторах развития тотальной глобозооспермии (1-го типа), в том числе генетически детерминированных форм, а также наличия единичных случаев эффективного лечения методами ВРТ данной категории пациентов без использования донорской спермы оценить степень генетического риска у потомства не представляется возможным. Целесообразно проведение преимплантационного генетического тестирования эмбрионов у данной категории пациентов.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Петров Г.Н. Оплодотворение яйцеклеток у человека вне организма. Труды Крымского мединститута 1957;17:25-6. [Petrov G.N. Fertilization in humans outside the body. Trudy Krymskogo medinstituta = Proceedings of the Crimean Medical Institute 1957;17:25-6. (In Russ.)].
2. Thonneau P., Marchand S., Tallec A.
et al. Incidence and main causes of infertility in a resident population (1,850,000) of three French regions (1988-1989). Hum Reprod 1991;6(6):811-6. DOI: 10.1093/oxfordjournals.humrep. a137433.
3. WHO Manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple. Available at: https://www.who. int/reproductivehealth/publications/ infertility/9780521431361/en.
4. Andrology: male reproductive health and dysfunction. Ed. by E. Nieschlag,
H.M. Behre, S. Nieschlag. 3rd edn. Berlin; Heidelberg: Springer-Wag, 2010. Pp. 83-87.
5. Мужское бесплодие: возможные причины олигоспермии. Доступно по: http://medbe.ru/news/urologiya-i-andrologiya/muzhskoe-besplodie-vozmozhnye-prichiny-oligospermii.
[Male infertility: possible causes of oligospermia. Available at: http:// medbe.ru/news/urologiya-i-andrologiya/ muzhskoe-besplodie-vozmozhnye-prichiny-oligospermii. (In Russ.)].
6. Johnson M.D. Genetic risks
of intracytoplasmic sperm injection in the treatment of male infertility: recommendations for genetic counseling and screening. Fertil Steril 1998;70(3):397-411. DOI: 10.1016/s0015-0282(98)00209-x.
7. WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile
male. Cambridge: Cambridge University Press, 2000. 102 p.
8. Anton-Lamprecht I., Kotzur B., Schopf E. Roundheaded human spermatozoa. Fertil Steril 1976;27(6):685-93.
DOI: 10.1016/s0015-0282(16)41900-x.
9. Chansel-Debordeaux I., Dandien S., Bechoua S., Jimenez C. Reproduction outcome in globozoospermie men update and prospects. Andrology 2015;3(6):1022-34.
10. Koscinski I., Elinati E., Fossard C. et al. DPY19L2 deletion as a major cause of globozoospermia. Am J Hum Genet
2011;88(3):344-50.
DOI: 10.1016/j.ajhg.2011.01.018.
11. Lundin K., Sjogren A., Nilsson L., Hamberger L. Fertilization and pregnancy after intracytoplasmic microinjection
of acrosomeless spermatozoa. Fertil Steril
1994;62(6):1266-7.
DOI: 10.1016/0020-7292(96)88705-4.
12. Tejera A., Molla M., Muriel L. et al. Successful pregnancy and childbirth after intracytoplasmic sperm injection with calcium ionophore oocyte activation
in a globozoospermic patient. Fertil Steril
2008;90(4):1202.e1-5.
DOI: 10.1016/j.fertnstert.2007.11.056.
13. Egashira A., Murakami M., Haigo K.
et al. A successful pregnancy and live birth after intracytoplasmic sperm injection with globozoospermic sperm and electrical oocyte activation. Fertil Steril 2009;92(6):2037.e5-9. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2009.08.013.
14. WHO laboratory manual
for the examination and processing of human semen. 5th edn. WHO Press, 2010.394 p.
Вклад авторов
В.В. Литвинов: разработка дизайна исследования, получение данных для анализа, анализ полученных данных, обзор публикаций по теме статьи, написание текста статьи;
А.Н. Сулима: анализ полученных данных, обзор публикаций по теме статьи, написание текста статьи;
М.А. Харитонова: получение данных для анализа, анализ полученных данных, проведение эмбриологического этапа исследования; А.А. Клепуков, И.Ю. Ермилова: проведение эмбриологического этапа исследования, анализ полученных данных; Ю.Ю. Маклыгина: обзор публикаций по теме статьи, проведение генетических исследований. Authors' contributions
V.V. Litvinov: developing the research design, obtaining data for analysis, analysis of the obtained data, reviewing of publications of the article's theme, article writing;
A.N. Sulima: analysis of the obtained data, reviewing of publications of the article's theme, article writing; M.A. Kharitonova: obtaining data for analysis, analysis of the obtained data, carrying out the embryological stage of the study; A.A. Klepukov, I.Yu. Ermilova: carrying out the embryological stage of the study, analysis of the obtained data; Yu.Yu. Maclygina: reviewing of publications of the article's theme, genetic screening.
ORCID авторов/ORCID of authors
В.В. Литвинов/V.V. Litvinov: https://orcid.org/0000-0003-2850-799X А.Н. Сулима/A.N. Sulima: https://orcid.org/0000-0002-2671-6985. М.А. Харитонова/M.A. Kharitonova: https://orcid.org/0000-0002-9341-3044 А.А. Клепуков/A.A. Klepukov: https://orcid.org/0000-0002-7364-9068 И.Ю. Ермилова/I.Yu. Ermilova: https://orcid.org/0000-0001-7155-3321 Ю.Ю. Маклыгина/Yu.Yu. Maclygina: https://orcid.org/0000-0002-7985-1574
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. Financing. The study was performed without external funding.
Информированное согласие. Пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании и публикацию своих данных. Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study and for the publication of their data.
Статья поступила: 17.02.2019. Принята к публикации: 20.06.2019. Article received: 17.02.2019. Accepted for publication: 20.06.2019.
