Клиническая иммунная экспресс-диагностика биологических патогенов с помощью динамической микротурбидиметрии в капиллярном чипе Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

2

Бионанотехнологии, биоэлектроника, биосенсорика

УДК 621.3.049.7.002

Соловьев А. В., канд. техн. наук, Зимина Т. М., канд. физ.-мат. наук,

Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ»

Клиническая иммунная экспресс-диагностика биологических патогенов с помощью динамической микротурбидиметрии в капиллярном чипе

Ключевые слова: диагностика патогенов, лаборатория на чипе, оптика спеклов, шигелла Зонне, летекс-агглютинация

Описан метод динамической турбидимет-рии, примененный для изучения реакции латекс-агглютинации в капиллярном чипе. Метод основан на анализе локальных флуктуаций спекл-поля, образуемого прошедшим через образец лазерным излучением. Показано, что с помощью этого метода удается производить экспресс-диагностику биопатогена. Так обнаружение инактивированных шигелл Зонне в концентрации 103 микробных тел на 1 мл было возможно за время менее минуты.

Введение

Интерес к использованию лабораторий на чипе [1] в клинической диагностике обусловлен требованиями к повышению скорости и чувствительности анализа, сокращению объема анализируемой пробы, миниатюризации и мобильности аналитических приборов.

В некоторых ситуациях применение аналитических микросистем существенно упрощает получение достоверной информации об исследуемом объекте. Так обстоит дело, например, при регистрации реакции латекс-агглютинации (РЛА), используемой для обнаружения комплекса антиген—антитело в иммунологических методах клинической диагностики. Обычно результат реакции в трудоемком процессе латексной диагностики оценивается визуально [2]. Разработка экспресс-диагностики с быстрым и автоматизированным анализом, а также с использованием малого количества реактивов позволит более широко применять этот принцип анализа. Эта задача может быть решена на базе технологий микросистемной техники и лазерной оптики [3].

При латексной диагностике используются частицы латекса с присоединенными к их поверхности молекулами, имеющими комплементарные участки к исследуемому биопатогену (рис. 1). Эти частицы диспергированы в жидкой среде и совершают броуновское движение. При наличии в среде

биопатогена частицы латекса начинают агглютинировать — образовывать агрегаты, растущие со временем. Обнаружение агрегатов является положительным результатом реакции.

Ранее для мониторинга очистки воды в проточной кювете [4], а также для исследования агрегации тромбоцитов в кювете с перемешиванием [5] применялись методы, основанные на анализе колебаний значения мутности. В данной работе рассматривается возможность применения лазерной оптики при миниатюризации аналитической системы для латексной диагностики и исследованы возможности снижения времени анализа.

Лазерное когерентное излучение при взаимодействии с динамическим гетерогенным объектом, каким является суспензия реагирующих латекс-ных частиц, претерпевает случайную модуляцию и в плоскости наблюдения образуются световые пятна — спеклы (от англ. speckle — пятнышко), расположение, размер и форма которых меняются со временем случайным образом [6]. Совокупность спеклов называют спекл-полем. Оно несет в себе информацию о состоянии частиц суспензии и, в частности, позволяет судить об их агглютинации уже на тэанней стадии этого процесса.

Рис. 1\ Латекс-агглютинация

Метод измерения флуктуаций интенсивности спекл-поля оказался весьма эффективным, особенно для детектирования РЛА в капиллярном чипе. В этом случае, на примере шигелл Зонне, было показано, что обнаружение биопатогена возможно за время менее минуты.

Экспериментальная часть

Материалы. В качестве объекта исследования использовали диагностикум шигеллезный Зонне (предприятие-изготовитель — Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург). Диагностикум представляет собой 1,5% -ную (по объему) взвесь частиц монодисперсного полистирольного карбокси-лированного латекса, сенсибилизированного антителами (иммуноглобулинами G) к шигеллам Зонне.

Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) получали стандартным методом путем смешивания в нужном соотношении растворов Na2HP04 х 12 Н20 и КН2Р04 до получения рН 7,1 ± 0,1 с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) в целях снижения неспецифической агглютинации латекса (ФСБ-БСА).

В экспериментах по агглютинации латекса использовали стандартную взвесь инактивированных шигелл Зонне (ИШЗ), прилагаемую производителем к диагностическому набору. ИШЗ содержит 1 млрд микробных тел в 1 мл.

Отсутствие спонтанной агглютинации проверяли, заменяя взвесь ИШЗ равным объемом ФСБ. Перед началом работы диагностикумы выдержали при температуре 20 °С в течение 15 мин. Непосредственно перед экспериментом диагностикум взбалтывали.

Чип. Экспериментальный капиллярный чип изготовили методом фотолитографии с применением фо-торезистивной защитной маски фирмы «Coats Inc.» (Великобритания). Этот материал позволяет получать топологический предел рельефа планарного чипа до 5 мкм. В качестве подложки и крышки применяли пластины из полиметилметакрилата толщиной 4 мм.

Фоторезист наносили методом сеткографии с получением слоев от 15 до 50 мкм. После экспонирования фоторезистивную пленку проявляли и подложку с полученным рельефным рисунком выдерживали при температуре 100 °C для завершения объемной сшивки. Затем подложку спекали с крышкой, в которой просверлены отверстия для ввода и вывода пробы. Температура спекания 110 °С.

Метод. Метод регистрации был выбран исходя из особенностей изучаемой системы: а) высокая концентрация диагностикума, необходимая для обеспечения достаточно быстрой агглютинации; б) присутствие крупных агрегатов с самого начала процесса.

В таких условиях эффективным способом слежения за динамикой агглютинации представляются измерения флуктуаций интенсивности спекл-поля, образованного прошедшим через кювету с исследу-

емым веществом лазерным пучком. Мы назвали этот метод динамической микротурбидиметрией (ДМТ). Он позволяет уверенно регистрировать агглютинацию на ее ранней стадии, когда обычные измерения мутности не обеспечивают достаточной точности, а измерения методами рассеяния света затруднены из-за высокой оптической плотности образца.

Похожие методы, основанные на анализе колебаний значения мутности, применялись ранее для мониторинга очистки воды в проточной кювете [2], а также для исследования агрегации тромбоцитов в кювете с перемешиванием [3]. Необходимо отметить, что в нашем случае, в отличие от известных работ [4, 5], где измеряли флуктуации мутности, внешнее возмущение системы отсутствовало: раствор во время измерений не перемешивался и не прокачивался через кювету. Флуктуации интенсивности спеклов вызывались исключительно броуновским (диффузионным) и седиментационным движением частиц. Отсутствие внешнего возмущения системы исключало паразитные флуктуации интенсивности, вызываемые рассеиванием лазерного пучка на макронеоднородностях в потоках жидкости. Кроме того, применение миниатюрного фотоприемного устройства с размерами, меньшими характерных размеров неоднородностей спекл-поля, позволило избежать пространственного усреднения и, следовательно, увеличить чувствительность метода. Оптическая схема установки представлена на рис. 2. Фотодиод диаметром около 100 мкм располагался на границе пятна образованного пучком лазера, прошедшим через образец (см. рис. 5).

Рис. 2

Установка для низкоапертурного измерения мутности взвеси латексов: а — оптическая схема; б — общий вид;

1 — лазерный диод 645 нм, 30 мВт; 2 — направление потока первичного излучения; 3 — собирающая линза; 4 — микрокапиллярный чип; 5 — фотоприемное устройство; 6 — поверхность фотодиода

Результаты и обсуждение

Для нахождения характерных времен РЛА и испытания метода регистрации проведена серия предварительных экспериментов в цилиндрической кювете диаметром 10 мм. Для того чтобы оптическая плотность образца позволяла проводить измерения, исходный диагностикум разбавлен буферным раствором в 75 раз. В кювету переносили 1,5 мл этого раствора и добавляли 40 мкл взвеси ИШЗ. Был приготовлен также контрольный образец, не содержащий ИШЗ. В ходе реакции измеряли интенсивность I проходящего через кювету света.

Результаты измерений приведены на рис. 3. Из графика видно, что флуктуации интенсивности прошедшего света возрастают в ходе РЛА (рис. 3, а) и существенно не меняются в контрольном образце (рис. 3, б). Надо отметить, что средний уровень интенсивности проходящего света не меняется в ходе эксперимента. Таким образом, флуктуации интенсивности оказываются гораздо чувствительнее к агглютинации, чем среднее значение мутности.

Флуктуации наблюдали и в контрольном растворе. Это говорит о том, что в нем также присутствует некоторое количество агрегатов. Однако в отличие от образца, в котором проходит РЛА, агрегация в контрольном растворе (неспецифическая агглютинация) происходит за 5-7 дней, что значительно больше времени эксперимента (около 2 ч).

На рис. 4 приведены среднеквадратичные отклонения £ флуктуаций интенсивности проходящего света в ходе РЛА и в контрольном образце. Из рисунка видно, что £ возрастает примерно на 30 % в течение 2 ч. Существенных изменений £ в контрольном образце за это время не происходит.

Для оценки характерного времени флуктуаций была вычислена автокорреляционная функция

2000

4000

6000

8000

Рис. 3

Эксперимент в кювете диаметром 10 мм. Динамика флуктуаций интенсивности проходящего света: а — в ходе реакции латекс-агглютинации; б — в контрольном образце

S 12 -

10

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

t, с

Рис. 4

Среднеквадратичные отклонения флуктуаций проходящего света в ходе реакции латекс-агглютинации 1 и в контрольном образце 2

интенсивности проходящего света (рис. 5)

1 Т

G(t) = < I(t)I(t + т) > = lim -1 J I(t)I(t + z)dt. (1)

о

Аппроксимируя автокорреляционную функцию экспонентой ехр(-^т), мы находим характерное время флуктуаций т= 1,7 с. Если считать, что это время определяется временем прохождения частицей лазерного луча в результате седиментации, то радиус частицы г можно оценить, используя следующую формулу [7]:

г =

9dn

2 (-Р)§т

(2)

где й = 0,15 мм — диаметр сфокусированного лазерного луча в кювете; ^ = 0,001 кг-с/м2 — вязкость жидкости; р8 = 1,1 г/см3, рг = 1,0 г/см3 —

0,6

0,4

0,2

0,0

• \ А = 0,53 ± 0,01 t = 1,70 ± 0,07 с

•

*

•

•

10

15

20

25 t, с

Рис. 5

Автокорреляционная функция интенсивности прошедшего через образец света в ходе реакции латекс-агглютинации

Бионанотехнологии, биоэлектроника, биосенсорика

плотности частиц и жидкости соответственно; g = = 9,98 м/с2 — ускорение свободного падения. Из (2) находим, что г ~ 20 мкм.

Надо отметить, что время корреляции почти не меняется в ходе процесса, что позволяет предположить, что верхняя граница распределения частиц по размерам также существенно не меняется. Это объясняется тем, что седиментация не позволяет оставаться в рассеивающем объеме агрегатам крупнее некоторого критического размера (более 20 мкм).

Наблюдаемые флуктуации интенсивности проходящего света возникают в результате постоянного перестроения спекл-поля в окрестности фотоприемника. Фотография одной из реализаций этого спекл-поля приведена на рис. 6.

Схематически его образование можно представить как результат наложения двух спекл-полей. Первое вызвано рассеянием лазерного пучка на основной массе частиц (неагрегированный латекс). Динамика этих так называемых частично развитых спеклов вызывает быстрые (менее 1 с), но небольшие по амплитуде флуктуации светопропус-кания. Второе спекл-поле, характеризующееся негауссовой статистикой, вызвано небольшим количеством крупных агрегатов, попадающих в лазерный пучок. Динамика этих спеклов вносит основной вклад во флуктуации интенсивности света на поверхности фотоприемника. Характерное время этих флуктуаций определяется из рассмотренной выше автокорреляционной функции (т= 1,7 с). Возрастание амплитуды флуктуаций прошедшего света в ходе РЛА объясняется увеличением числа крупных агрегатов (размером около 20 мкм) в растворе.

После того как мы убедились в том, что метод ДМТ позволяет регистрировать РЛА в цилиндрической кювете диаметром 10 мм, был проведен эксперимент с использованием капиллярного чипа (см. рис. 1). В его капилляре можно существенно увеличить концентрацию диагностикума. При этом оптическая плотность образца остается относитель-

нее. 6

Фотография епекл-поля, еоздаваемого лазерным пучком, прошедшим через образец:

1 — положение фотодиода; 2 — спекл

но низкой и позволяет проводить измерения методом ДМТ. В то же время высокая концентрация диагностикума обеспечивает большую скорость реакции, что необходимо для экспресс-диагностики.

Изготовлен полимерный чип с глубиной капилляра около 48 мкм и шириной 1 мм. Для проведения РЛА использовано 40 мкл латексного шигел-лезного диагностикума, 40 мкл буфера ФБР-БСА и 40 мкл раствора ИШЗ. В контрольном образце раствор ИШЗ был заменен тем же объемом буфера. На рис. 7 приведены временные зависимости интенсивности проходящего света в ходе РЛА и в контрольном растворе. Среднеквадратичное отклонение интенсивности проходящего света (в относительных единицах интенсивности) в ходе РЛА через 1 мин после начала реакции составляет 11,6, тогда как в контрольном растворе эта величина составляет 3,1. Интересно отметить, что, так же как и в эксперименте с использованием цилиндрической кюветы, индикатором агглютинации оказываются флуктуации проходящего света. При этом его средняя интенсивность остается неизменной во время эксперимента. Надо отметить также, что по сравнению с экспериментом в кювете в эксперименте с чипом амплитуда флуктуаций проходящего света меньше (как в контрольном растворе, так и в ходе РЛА). Это связано с тем что, несмотря на увеличение концентрации диагностикума, длина пути лазерного пучка в образце уменьшается еще сильнее, приводя в конечном итоге к уменьшению оптической плотности образца.

Резкое увеличение скорости РЛА в капиллярном чипе по сравнению с РЛА в кювете связано с увеличением концентрации диагностикума. Теоретически скорость агглютинации Л определяется парными столкновениями и, следовательно, должна расти как квадрат концентрации [8]. В нашем случае Л = (п2/п1)2 = 625, где п1 и п2 концентрации

I 250 200 150 100 50

0

-N3, 03.04.2007-

0

50

100 150 200 250 300 350

Рие. 7

Экеперимент в капиллярном чипе (толщина 40 мкм). Динамика флуктуации проходящего евета:

1 — в хода реакции латекс-агглютинации; 2 — в контрольном образце

диагностикума в кювете и в чипе соответственно. Для проверки этой оценки был проведен эксперимент, в котором РЛА в кювете наблюдалась в течение 12 ч. Было найдено, что среднеквадратичное отклонение флуктуаций проходящего света возрастало в 4 раза за время t1 = 10 ч, тогда как такое же увеличение £ в капиллярном чипе происходило за время t2 = 1 мин. Таким образом, t1/t2 = 600, что хорошо согласуются с теоретической оценкой.

Заключение

Исследованы возможности применения реакции латекс-агглютинации и метода динамической мик-ротурбидиметрии (ДМТ) в чипе для экспресс-диагностики биологических патогенов в пробах. Предложенный метод ДМТ основан на анализе локальных флуктуаций спекл-поля, образуемого прошедшим через образец лазерным излучением. Метод позволил регистрировать агглютинацию на ее ранней стадии, когда обычные измерения мутности не обеспечивали достаточной точности, а измерения методами рассеяния света были затруднены из-за высокой оптической плотности образца. Метод ДМТ показал особую эффективность именно при использовании капиллярного чипа. В этом случае удавалось производить экспресс-диагностику биопатогена с использованием малого количества реактивов: обнаружение шигелл Зонне с концентрацией 103 инактивированных микробных тел в пробе было возможно за время менее минуты с использованием 40 мкл латексного диагностикума.

Для практического применения разработанного метода в клинической практике необходимы дальнейшие исследования для оптимизации техники регистрации и усовершенствования чипа. В частности, очень важной является задача подачи и эффективного перемешивания реагентов в чипе.

| Л и т е р а т у р а |

1. Manz A., Graber N., Widmer Н. М. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing// Sensors and Actuators B1. 1990. C.244-248.

2. Инструкция по применению диагностикумов ла-тексных шигеллезных Зонне. Министерство здравоохранения Российской Федерации. 1995 г.

3. Зимина Т. М. Миниатюрные аналитические системы биомедицинского назначения//Биотехносфера. 2009.№ 1. C. 11-17.

4. Brown G. М., Gregory J., Jackson P. W. et al. Instrumentation and control of water and wastewater treatment and transport systems//Ed. By R.A.R.Drake. 1985, Oxford: Pergamon. Р. 239-245.

5. Gabbasov Z. A., Popov E. G., Gavrilov I. Yu., Posin E. Ya. Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension //Thromb. Res. 1989. 54(3). Р. 215-223.

6. Франсон М. Оптика спеклов. М.: Наука, 1980. 171 с.

7. Hunter R. J. Introduction to modern colloidal science. Oxford University Press Inc., 1999. 344 p.

8. Julien R. The application of fractals to investigations of colloidal aggregation and random deposition // New J. Chem. 1990. Vol. 14. Р. 239-253