Миниатюрные аналитические системы биомедицинского назначения - лаборатории на чипе Текст научной статьи по специальности «Медицинские технологии»

УДК 621.3.049.7.002

Т. М. Зимина, канд. физ.-мат. наук, Санкт-Петербургский электротехнический университет «ЛЭТИ»

МИНИАТЮРНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ — ЛАБОРАТОРИИ НА ЧИПЕ

Ключевые слова: лаборатория на чипе, микросистемное аналитическое устройство, биочип, микрофлюидные чипы, портативные аналитические приборы, биомедицинский анализ

Обсуждаются результаты физико-технологических исследований и конструирования микроаналитических систем (лабораторий на чипе, биочипов, микрофлюидных чипов) и портативных аналитических приборов для работы с микрочипами (ридеров). Представлены примеры макетной реализации приборов, предназначенных для проведения биомедицинского анализа методами капиллярного электрофореза, электрохроматографии, латекс агглютинации.

Технологии микроэлектроники открыли возможности развития нового направления инструментальной аналитической химии — микро- и наноаналитических систем [1, 2]. Предназначение таких систем — повышение скорости и автоматизация аналитического процесса для осуществления массового скрининга параметров среды обитания, технологических процессов и живых

организмов. Переход инструментальной аналитической химии к применению разработок микросистемной техники превратил ее в индустрию генерирования и классификации аналитических данных. Этот переход можно назвать научно-технической революцией, так как он характеризуется скачкообразным увеличением производительности аналитического процесса [1].

Для создания микроаналитических систем основные операции аналитической процедуры необходимо детализировать и представить как совокупность более простых операций (табл. 1), выбрать физические принципы и технологии для их микрореализации.

Проявление новых свойств системы при ее миниатюризации — это повышение скорости функционирования без дополнительных затрат интенсивных факторов — энергии, вещества, при этом существенно влияют на процессы фрактальные подмножества: скорость адсорбции на искривленной поверхности, геометрическая комп-

Таблица 1

Некоторые аналитические операции, физические принципы и конструктивно-технологические решения при создании микроаналитических систем на их основе

Аналитическая операция

Физический принцип, процесс

Конструктивно-технологическое решение

Применение

Адресная доставка вещества

Электроосмос

Механический импульс

Нестационарная микрогидравлика

Электрофорез Магнетофорез

Планарный капилляр, характерный размер 10-100 мкм, пористая среда, электрическое поле

Клапанный, роторный микромеханический насос, в том числе интегрированный

Интегрированные микронасосы с динамическими пассивными клапанами

Заряженные частицы, электрическое поле заданной конфигурации, платиновые, углеродные электроды

Магнитные частицы с молекулярными распознавателями, селективное связывание с мишенью и транспорт в магнитном поле

Доставка веществ, растворенных в электролитах низкой концентрации

Прокачка жидкости и газа

Прокачка жидкости и газа

Доставка и концентрирование заряженных молекул

Доставка клеток, содержащих диагностический биомаркер

Подготовка пробы

Загрузка вещества

Размол, термообработка, лизис, гидролиз

Мембранная микрофильтрация

Седиментация Диализ

Входной резервуар большого диаметра с защитной мембраной

Гидроэлектроудар, микронагревательные элементы, микроразряд, химическая обработка, замораживание и компрессионное воздействие

Встроенный микрофильтр с порами заданного размера

Ловушка для седимента и препятствие для отделения супернатанта

Диализная мембрана во входном резервуаре

Предочистка пробы, содержащейся в грунте, биомассе

Высвобождение молекулярных компонентов тканей, клеток

Разделение клеток крови

Разделение клеток и частиц по размеру

Концентрирование пробы

Продолжение табл. 1

Аналитическая операция Физический принцип, процесс Конструктивно-технологическое решение Применение

Подготовка пробы Осмотический «шок» Селективная сорбция Обессоливание Перемешивание Резервуар, мембрана, доставка де-ионизованной воды Картридж с селективным адсорбентом Резервуар с обратноосмотической мембраной Смесительная камера заданной геометрии, канал для диффузионного перемешивания, актюатор, поверхностно-акустические волны Разрушение эритроцитов Выделение минорных компонентов биопробы Снижение ионной силы раствора Нанесение меток с якорной группировкой, латекс агглютинация

Разделение на компоненты Электрофорез Хроматография Диализ Электрическое поле высокой напряженности, капилляр свободный или заполненный инертной средой Межфазное распределение, планарные интегрированные колонки, электроосмотический или гидравлический поток Встроенная мембрана, камеры Сыворотка крови, экстракты всех биологических объектов, фрагменты ДНК Сыворотка крови, лекарственные препараты, гормоны, витамины Очистка белков

Детектирование Биораспознавание, гибридизация Химическая реакция Поглощение света Флуоресценция Иммобилизация активных биомолекул, синтез на поверхности Иммобилизация ионов, реагентов Источник излучения малой апертуры, 200-600 нм, фотоприемник Источник первичного излучения, система сбора вторичного излучения Определение нуклеотидной последовательности фрагментов Хемилюминесценция (определение гемсодержащих белков) Белки, витамины, гормоны Ароматические соединения, биологические объекты, содержащие триптофан, рибофлавин, никотинамид аденин динуклеотид

Физическая обработка Термоциклирование Диспергирование Удаление растворенной газовой фазы Управление нагревом и охлаждением — терморезистивные элементы на базе SiC, металлов, полупроводников Электроудар, ультразвуковое поле Барботирование гелием, ультразвуковое поле, вакуум, камера, пьезоэлектрический актюатор, микросопло Определение присутствия фрагмента ДНК, идентичного матрице Получение гомогенной суспензии реагента Электрофорез, электрохроматография

лементарность объектов, системы двойных электрических слоев и многие другие.

Развитие всего спектра конструктивно-технологических и методических подходов для реализации промышленных образцов таких систем продолжается уже более 15 лет. Оказалось, что реализация аналитических микро- и наносистем является более сложной технической и технологической задачей, чем это виделось в начале пути [2, 3].

Рассмотрим некоторые из этих функций и способы их микрореализации.

Современный химический анализ трудно представить без разделения пробы на компоненты, например, с помощью хроматографии или электрофореза. Рассмотрим интегрированный на микрофлюидном чипе вариант хроматографии. Основным средством разделения пробы на составляющие является хроматогра-фическая колонка — пористая среда с перфузионны-ми свойствами, ограниченная, как правило, цилиндрической или, в случае планарного варианта, плоскопараллельными поверхностями (рис. 1). Пространственная структура и свойства поверхности пористой среды (сорбента) определяют ее способность разделять вещества. Колонка может представлять собой плотно упакованную сферическими пористыми частицами среду, а может являться «монолитной» пористой структурой. В первом случае очень важна плотность упаковки частиц, поскольку наличие пустот в перфузи-

10

11

Рис. 1

Хроматографический микрофлюидный чип: 1 — база; 2 — оптоволокно; 3 — детекторный объем; 4 — слой с рельефом топологии микрофлюидной системы; 5 — колонка; 6 — порт жидкостного доступа; 7 — кинформ; 8 — фотодиод; 9 — реактор; 10 — крышка, являющаяся светофильтром и содержащая микрооптический элемент; 11 — тоководные ламели; 12 — светодиод; 13 — шаровая линза

9

4

2

Бионанотехнологии, биоэлектроника, биосенсорика

а)

■ в» I

9

i Г , 1

V-4- i-S.. i" 1

Рис. 2

Канал для разделения фрагментов ДНК, выполненный из фоторезиста Би-8 на кремнии: а — х240; б — х1200

онных каналах приводит к ухудшению эффективности разделения.

Появление фоторезистивных материалов нового поколения, таких как SU-8, позволило изготавливать разделительные дорожки с геометрическими препятствиями (колонки) любой формы с топологическим размером до 10 мкм на основе толстопленочных технологий. Такая дорожка для сепарации фрагментов ДНК представлена на рис. 2 [1].

Рассмотрим процесс температурной обработки пробы. Такая пробоподготовка нужна в генном анализе, где

можно увеличить количество молекул ДНК в пробе с использованием реакции амплификации. Проведение этой реакции (полимеразной цепной реакции — ПЦР) требует термоциклирования. На рис. 3 представлены планарное устройство для термоциклирования и конструкция модуля для проведения полимеразной цепной реакции с водяным капиллярным охлаждением [4].

Другим важным принципом анализа является мембранная сепарация молекул и частиц. На рис. 4, а представлена схема выделения лимфоцитов для иммунофлюорес-центного анализа в миниатюрном модуле с прецизионной мембраной. Наномембрана на базе анодного оксида алюминия, разработанная совместно с ИЭ АНБ (Минск), показана на рис. 4, б. Преимущество наномембран, полученных методом нанотехнологий, заключается в том, что положение и размер пор заданы с высокой точностью. Это свойство позволяет контролировать проницаемость мембраны при разделении веществ с близкими размерами, таких как клетки крови. При диагностическом применении получение полной выборки клеток заданного типа становится особенно важным для количественного определения диагностических параметров. Мембранная пробоподготовка в настоящее время привлекает внимание именно благодаря появлению мембран нового поколения,

а)

7

8

9

10

11

5

15

14

13

12

Проба

в)

б)

Рис. 3

Модуль для генного анализа с термоциклером и системой водяного охлаждения: а — сечение модуля; б — капиллярная система аналитического чипа; в — реактор; г — расположение охлаждающего змеевика:

1 — элемент Пельтье; 2 — термоизолирующий материал; 3 — кремниевая или полимерная подложка; 4,11 — тоководные ламели; 5 — многослойный капиллярный микрочип, материал Би-8; 6 — кремниевая подложка реактора; 7 — нагревательный элемент; 8 — температурный датчик; 9 — камера генного реактора; 10 — фрагмент ДНК; 12 — поперечное сечение охлаждающего змеевика; 13 — направление движения охлаждающей жидкости; 14 — капилляр для подачи жидкости и электрод высокого напряжения; 15 — охлажденная жидкость

г)

7

8

Бионанотехнологии, биоэлектроника, биосенсорика

а)

л

б)

/

гтжш

в)

{2 I ОД 'V: " »У

НГЩПМШ1

Рис. 4

Мембранная сепарация: а — стадии предфильтрации образца крови; б — мембрана на основе анодного оксида алюминия; в — мембрана с фракцией лимфоцитов: 1 — эритроцит; 2 — пора; 3 — лимфоцит; 4 — раствор красителя; 5 — меченый лимфоцит

как представлено на рис. 4, б и в. Микрочипы с интегрированными мембранами в сочетании с видеоцифровыми средствами позволяют проводить экспрессный анализ опасных инфекций на основе иммунофлюоресцентных меток и компьютерной обработки изображения [12].

В микроаналитических системах реализуются практически все физические принципы детектирования, традиционно используемые в аналитических приборах [1, 4, 6, 7]. Следует отметить, что особое место здесь занимает принцип биораспознавания [5]. Перечень основных принципов детектирования приведен в табл. 1.

Иммунитет проявляется в способности организма к распознаванию и связыванию всех чужеродных веществ (антигенов) с помощью вырабатываемых им специфических веществ (антител) [20]. Молекулярный механизм иммунного биораспознавания заложен в основу иммунных методов анализа, широко применяемых в медицинской диагностике. Одним из способов учета реакции связывания антиген—антитело является наблюдение за флокуля-цией (агглютинацией) латексных частиц, несущих на своей поверхности соответствующие биораспознающие компоненты, как схематически представлено на рис. 5 для двух типов латексных препаратов: антигенного (рис. 5, а) и антительного (рис. 5, б).

При сопряжении микрочиповых платформ с видеоцифровыми сенсорами и источниками первичного из-

лучения возможна регистрация изображений, связанных с агглютинацией латексных частиц в результате антиген-антительного взаимодействия патологического фактора в матрице. Оптическая схема представлена на рис. 6 [5].

Высокие чувствительность и специфичность в иммунологической диагностике достигаются путем использования высокоочищенных компонентов проводимой реакции и современных технических средств с программным обеспечением: фотометрия, люминометрия (основанные на хеми- и биолюминесценции), флуори-метрия. При этом достигается чувствительность 10-610-12 г/л вещества. Однако высокая стоимость обору-

а)

б)

Рис. 6

Рис. 5

Принцип латексной диагностики: 1 — латексная частица; 2 — антитело; 3 — антиген

Датчик для оптической регистрации реакции иммунной латекс агглютинации в проходящем свете с помощью микропланшета, сопряженного с видеосенсором:

1 — база; 2 — воздушный зазор; 3 — подложка микрочипа; 4 — рельеф микрочипа; 5 — частица латекса; 6 — источник излучения; 7 — проходящий свет; 8 — агрегат латексных частиц; 9 — лунка; 10 — КМОП-сенсор

1

2

2

3

1

5

6

дования, программного обеспечения, самих тест-систем делают эти методы недоступными для многих лабораторий. Поэтому ценность представляют быстрые, мобильные и одновременно достоверные методы, реализуемые на доступных приборах. Использование ридера на базе видеосенсора и микроплатформ для учета реакции латекс агглютинации позволит сделать этот метод экспрессным, достоверным и мобильным.

На рис. 7 представлены ридер, набор матричных платформ и результаты учета реакции латексного диа-гностикума при определении дифтерийного токсина. Из рис. 7, в видно, что при агглютинации латексного диа-гностикума изображение лунки светлеет.

Развитие элементной базы микроэлектроники открывает возможности разработки многоканальных микроплатформ для массового биомедицинского анализа. В данном случае представляет интерес флюори-метрическое детектирование как метод, обладающий высоким квантовым выходом излучения и позволяющий детектировать вплоть до нескольких десятков молекул флюорофора.

Детектирование сверхмалых количеств флюорофора, таких как 10-18 моля и менее, требует оптимизации оптической схемы. Одним из приемов, позволяющих поднять уровень сигнала на один-два порядка, является повышение светосилы оптической схемы, т. е. повышение апертуры приема сигнала сенсором (рис. 8). На рис. 9, а представлен вид записи с помощью КМОП-матрицы сигнала флюоресценции микролунок планшета, содержащих по 200 нл раствора флюоресцеина концентрации 10-8 моль/л-1. На рис. 9, б представлены такие же, как на рис. 9, а, образцы, но на платформе с сопряженными линзами, выполненными в термопласте. Очевидно существенное повышение отношения сигнал/шум в результате выполнения рельефа сопряжен-

б)

а)

в)

Рис. 7

Ридер и аналитические чипы с микроячейками: а — общий вид макета; б — аналитические чипы; в — результат реакции, записанный с помощью КМОП-видеосенсора в контактном режиме в проходящем свете:

1 — аналитический чип с микроячейками и КМОП-видеосенсор; 2 — осветитель; 3 — контроль; 5 — латексный диагностикум, выдержанный с пробой дифтерийного токсина; 4, 6 — пустые ячейки

10

Рис. 8 Датчик для оптической регистрации реакции иммунофлюо-ресцентного, генного и других видов аналита, включающих вторичное излучение в видимой области с помощью микропланшета, сопряженного с видеосенсором:

1 — база; 2 — воздушный зазор; 3 — подложка микрочипа; 4 — рельеф микрочипа; 5 — капсула с контрольным раствором; 6 — поток первичного излучения; 7 — источник излучения; 8 — капсула с аналитом; 9 — КМОП-сенсор; 10 — микролинза

ных линз (рис. 9, в, г) в едином технологическом цикле с термокомпрессионной обработкой микроплатформы. На рис. 9, д представлены сравнительные данные измерения светового потока флюоресценции для случаев на рис. 9, а и б по флюоресцеину. Группа концентрационных зависимостей флюоресценции 1 (рис. 9, д) соответствует данным флюориметрии для различных

а)

б)

в)

г)

Г* +

д)

ей

я,

и ц

н

е ц

с

е р

о ю

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

—(—

10

11

—I— 12

-Т-1-♦-•-*-*

13 14 15 16 17 18

-т

Рис. 9

Измерение предела обнаружения флюорофора в лунках различного объема, сопряженных с КМОП-матрицей: 1 — лунка; 2 — микролинза

9

1

2

2

1

9

концентраций и объемов лунок от 0,8 до 0,02 мкл, зависимость 2 соответствует лункам объемом 0,2 мкл с сопряженными микролинзами. Из рис. 9, д можно оценить предел обнаружения флюоресцеина в лунке платформы, сопряженной с КМОП-сенсором как 0,2 х 10-13 моля, а с применением сопряженных микролинз — до 10-17 моля.

На рис. 10 представлен макет ридера для считывания данных по флюоресценции с матричного чипа. Такие ридеры миниатюрны и дешевы, при этом позволяют получать высокое разрешение и чувствительность.

Более высокая чувствительность наблюдается в капиллярной системе при использовании оптимизированной оптической схемы освещения и сбора вторичного излучения. Такая схема реализована в флюориметри-ческом детекторе для капиллярного электрофореза, представленном на рис. 11, а. Появление на рынке сверхъярких светодиодных источников излучения позволило осуществлять такие схемы без использования дорогостоящих лазеров. В представленной схеме применен полимерный световод (рис. 11, б, в) для транслирования светового потока в заданную точку канала [6].

Приборы с флюориметрическим детектированием предназначены для определения фракционного состава и электрофоретической подвижности фракций растворов в целях биохимической диагностики в клинической практике и в научных исследованиях методом капиллярного электрофореза в планарном капилляре или для электрохроматографии в планарных модулях.

Разработанный на этой основе макет миниатюрной аналитической системы представляет собой считывающее устройство (ридер) и сменный чип, в том числе одноразовый (рис. 12, а). Общий вид прибора показан на рис. 12, б.

Для улучшения предела обнаружения в такой системе можно также повысить апертуру приема, в частности, за счет интегрированных оптических элементов, таких как киноформы. В этом случае чувствительность повышается на один порядок [7].

Показано, что процессы взаимодействия макромолекул в капилляре можно регистрировать с помощью лазер-

а)

Рис. 10

10

7 6 5

б)

в)

Рис. 11 Сечение электрофоретического микрочипа в области детектора флюоресценции пространственно выделенной зоны флюорофора в капилляре:

1 — светодиод; 2 — шаровая фокусирующая линза; 3 — свето-водный канал с входной микролинзой; 4 — фотоприемное устройство (фотодиод с предусилителем); 5 — крышка из прозрачного диэлектрика оптического качества, служащая светофильтром; 6 — фоторезистивный материал, формирующий рельеф; 7 — вторичное флюоресцентное излучение; 8 — капилляр с флю-орофором; 9 — база; 10 — направление первичного излучения

ного доплеровского светорассеяния [1]. Принцип метода доплеровского электрофоретического светорассеяния основан на измерении спектра когерентного света, рассеянного на частицах, движущихся с постоянной скоростью V, и смешанного с возбуждающим светом, используемым в качестве гетеродина. Тогда в измеренном спектре центральная частота спектральной линии связана со скоростью V, а ее ширина — с диффузионной подвижностью частиц. Если в поле движутся частицы, имеющие различные групповые скорости, то спектр может содержать линии с характерными для данных скоростей центральными частотами, имеющими соответствующую диффузионную ширину. Измерение характеристик объектов методом электрофореза и оптического смешения позволяет в одном эксперименте измерить подвижность и коэффициент диффузии, а для многокомпонентных систем — измерить подвижность и коэффициент диффузии каждого из компонентов.

Оптическая схема представлена на рис. 13. Реализация такой схемы позволяет достигать высоких элект-рофоретических скоростей макромолекул, например

б)

а)

2 3

Рис. 12

Макет ридера для считывания данных флюоресценции с матричного микрочипа

Макет прибора для капиллярного электрофореза с флюориметрическим детектированием на основе одноразовых микрочипов:

1 — канал; 2 — оптоволокно; 3 — детекторный объем; 4 — емкость; 5 — микрочип

8

9

1

5

4

а)

б)

7 11

8

5 +1

6 9 2 10

4 в)

Рис. 13 Прием сигнала рассеянного света при капиллярном

электрофорезе (а), рассеивающий объем (б), фотошаблон и реализация профиля кюветы на полиакрилатной подложке (в):

1 — лазер; 2 — направление луча лазера; 3 — светоделитель-ная пластинка; 4 — фокусирующая линза; 5 — микрочип с капилляром; 6 — электроды для электрофореза; 7 — фотоприемный модуль; 8 — объем измерительного капилляра; 9 — частицы, мигрирующие в поле; 10 — гетеродинирующий луч; 11 — сигнал (биения мощности потока рассеянного пучка)

белков, за счет высоких значений напряженности поля в капилляре при токах до 100 мкА и эффекта стабилизации потока стенками,наподобие капиллярного электрофореза. При этом планарное исполнение дает возможность достичь оптического качества окон, не искажающих волновой фронт, что существенно для получения сигнала доплеровского светорассеяния.

На рис. 14, а представлен макет миниатюрного доплеровского электрофоретического анализатора. Изме-

б)

а)

в) S(a>) 0,8

1

500

1000 Aw, Гц

1500

Рис. 14

Макет миниатюрного доплеровского электрофоретического анализатора: а — общий вид; б — измерительный капилляр в одноразовом полимерном микрочипе; в — Фурье-спектр корреляционной функции электрофорети-ческого доплеровского светорассеяния нормальной сыворотки крови человека [твердотельный лазер с диодной накачкой (Лазер-экспорт, Москва), X = 532 нм, Р = 20 мВт; 1 - Е = 0; 2 - Е = 1000 В-см-1]

рительная кювета выполнена в виде сменного планар-ного капиллярного микрочипа, содержащего измерительный капилляр прямоугольного сечения диаметром d = 50 + 200 мкм — перпендикулярно к падающему лучу и d = 20 + 50 мкм — по ходу луча, с плоскопараллельными оптическими окнами (рис. 14, б). На рис. 14, в представлен частотный спектр, соответствующий значениям групповых скоростей фракций сыворотки крови. Видно, что максимальное смещение частоты приближается к 1500 Гц, что указывает на большой динамический диапазон метода и возможность разрешить пять и более электрофоретических фракций сыворотки крови за 10 с.

Миниатюризация аналитических систем биомедицинского назначения является естественным процессом эволюционного технического развития, который приведет к переоснащению клинических лабораторий, врачей общей практики и специалистов, биологов и экологов в полевых условиях. Миниатюризация и интегрирование функциональных элементов аналитических приборов позволяет не только снизить материа-ло- и энергоемкость, но и повысить аналитические возможности, главным образом скорость и разрешение анализа, благодаря синэргетическим эффектам миниатюризации, возможности реализации параллельных либо сотовых конфигураций.

| Л и т е р а т у р а |

1. Зимина Т. М. Микро- и наноаналитические систе-мы//Нанотехнология. Физика. Процессы. Диагностика. Приборы/Под ред. В. В. Лучинина и Ю. М. Таирова. М.: Физматлит, 2006.

2. Planar chips technology for miniaturization of separation systems: A developing perspective in chemical monitoring (review)/A. Manz, D. J. Harrison, E. Verpoorte, H. M Widmer// Adv. Chromatogr. 1993, т. 33. P. 1-66.

3. Зимина Т. М. Интегральные капиллярные сепара-ционные микросистемы для химического анализа //Петербург. журн. электроника. 2000, № 3-4. C. 79.

4. Пат. № 2171467 РФ. G01N27/00. 2000. Микрореактор для химического и генетического тестирования// В. В. Лучинин, А. В. Корляков, Т. М. Зимина, И. В. Никитин.

5. Пат. № RU 2298 798 C1 РФ. G01N 33/546.2006.01. Способ контроля биологической пробы в реакции латекс агглютинации и аналитическая система для его осуществ-ления//Т. М. Зимина, В. В. Лучинин, В. Е. Мигунова и др.

6. Пат. № 2229699 РФ. G01N21/00. 2000. Аналитический капиллярный микрочип//Т. М. Зимина, М. Н. Полянский, В. В. Лучинин.

7. Пат. № 2280247 РФ. G01N21/64, 03. 2006. Биочип для флюоресцентного и люминесцентного анализа// Т. М. Зимина, В. В. Лучинин.

8

1

2

3

0