CC BY
87
УДК 621.3.049.7.002
Т. М. Зимина, канд. физ.-мат. наук,
A. В. Соловьев, канд. техн. наук,
B. В. Лучинин, д-р. техн. наук, Г. А. Баранов, аспирант,
Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ» Б. П. Николаев, канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр., Л. Ю. Яковлева, канд. хим. наук, ст. науч. сотр., Я. Ю. Марченко, аспирант, зам. зав. лаб., О. В. Елисеев, инженер,
Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
Исследование магнитных наносуспензий биомедицинского применения
Ключевые слова: магнитные наносуспензии, магнитофорез, магнитофоретическая подвижность, лазерное динамическое светорассеяние, гетерофазный синтез, лаборатория на чипе
Key words: magnetic nanosuspensions, magnetophoresis, magnetophoretic mobility, laser dynamic light scattering, heterophase synthesis, laboratory-on-a-chip
Данная статья является развитием работ по синтезу и исследованию магнитных наносуспензий (МНС) биомедицинского применения. Рассматриваются миниатюрные методы исследования размера и подвижности суперпарамагнитных наночастиц на примере МНС, полученных с помощью гетерофазного синтеза. Обсуждаются некоторые аспекты конструирования аналитических чипов для анализа МНС и биопроб с помощью магнитных средств доставки. Определены значения магнитной силы и магнитного потока в капилляре при генерировании градиента магнитного поля через магнитопроводные ламели. Определена магнитофоретическая подвижность частиц в МНС.
Введение
Магнитные наночастицы (МНЧ) находят все более широкое применение в бионанотехнологиях [1]. Наряду с известными применениями in vivo для гипертермии при лечении новообразований [2] или повышения контрастности изображений в магнитно-резонансной томографии (МРТ) [1] весьма интересным и быстро развивающимся направлением является применение МНЧ in vitro в биомедицинском анализе при создании гибридно-интегральных аналитических микро- и наносистем [3, 4]. Одной из ключевых технических проблем создания таких систем для биомедицины является организация в них адресного транспорта веществ к функцио-
нальным компонентам [5, 6]. С этой точки зрения магнитные наночастицы представляют большой интерес, с одной стороны, как микроскопические средства доставки, «вылавливающие» и доставляющие к аналитическим компонентам вещества-мишени из белковой матрицы, а с другой — как актюаторы, генерирующие движение объема жидкости, в частности на основе известного принципа магнитогидро-динамического насоса [7].
В рамках развития указанного направления проводятся исследования свойств магнитных микро- и наночастиц различной природы в целях определения их характеристик и оптимизации выделения с их помощью целевых компонентов из белковых матриц путем избирательного связывания и транспорта к функциональным узлам аналитических микросистем в магнитном поле заданной геометрии. В работе [8] рассматриваются свойства наночастиц, содержащих ядро из оксида железа размером 35 нм, покрытых полимерной оболочкой и затем золотом, для трассирования индивидуальных частиц с помощью плазмонного резонанса при микроскопии на темном поле. Показано, что, несмотря на значительное броуновское движение и Стоксовы силы, возможно манипулирование такими частицами в магнитном поле с большими градиентами. Движущую силу определяли путем оценки скорости движения методом трассирования. Показано, что при градиенте магнитного поля до 3000 Т • м-1, наблюдаются силы всего 1,5 • Ю-15 Н, а скорости перемещения — до 30 • 10-6 м • с-1. В ряде работ исследовали топологии микрофлюидных лабораторий на чипе, источники магнитного поля, магнитные наночастицы, по-
76
Микро- и нанотехнологии в новом технологическом укладе
лученные различными способами, для определения эффективности транспорта макромолекул и клеток к аналитическим узлам, учета особенностей формирования магнитного поля в элементах микросистем [9-11]. Для таких систем необходимо использовать методы слежения за частицей, исключающие прямую микроскопическую визуализацию наночастицы, неспецифическую адсорбцию частиц на поверхностях каналов и их агрегацию. Особый интерес для указанных применений представляют суперпарамагнитные частицы из-за динамичности их «магнитного заряда», включающегося только в нужном месте и в нужное время. МНЧ, заключенные в полимерную оболочку, имеют поверхность, способную присоединять всевозможные лиганды, в частности био-распознающие группы, избирательно присоединяющие целевые молекулы и клетки, а организованная внешними источниками конфигурация магнитного поля позволяет перемещать их к функциональным компонентам лаборатории на чипе.
Одним из основных применений магнитных на-носфер в медицинской диагностике является иммунный анализ. Известны методы иммунного анализа на основе немагнитных микросфер, среди которых широко распространена в клинической практике реакция латекс-агглютинации (РЛА) [12, 13]. В этом методе визуализация положительной реакции осуществляется за счет образования видимых кластеров при слипании (агглютинации) микро- или на-носфер, нагруженных комплементом к искомым патогенным биомолекулярным структурам. Недостатками ручного метода РЛА являются трудоемкость и низкая скорость реализации результата. При миниатюризации метода, т. е. реализации РЛА в малом объеме пробы (до 200 нл) в микролунках, время завершения реакции можно существенно снизить, а чувствительность повысить на два-три порядка [12]. Однако автоматизацию этого метода затрудняет адресная доставка образцов. В этом случае технические решения с применением «интеллектуальных», т. е. содержащих молекулярные ключи для распознавания и связывания целевых биообъектов, суперпарамагнитных наночастиц представляются очень перспективными [10].
Производство МНЧ осуществляется с помощью многообразных химических технологий. Большинство известных и нашедших наибольшее практическое применение МНЧ изготавливаются на основе ферро- и ферримагнитных окислов железа по технологии осаждения магнетита из растворов солей Ге2+, Ге3+ при рН >10. Существенным требованием к синтезу МНЧ является получение наноразмерных одно-доменных частиц узкого мономодального распределения в диапазоне 10 нм. Известно, что средний размер и распределение по размерам таких МНЧ подвержены влиянию многих факторов, что приводит к снижению воспроизводимости результатов [1]. Ге-терофазный синтез в наноэмульсии является простым и удобным способом получения магнитных на-
ночастиц оксида железа, воспроизводимых по размеру. Для синтеза используют наноэмульсии (НЭ), содержащие обратные мицеллы, в ядре которых заключены нанокапли водного раствора солей железа. Наиболее целесообразно использовать в таких системах неионные ПАВ, которые меньше влияют на биологическую активность МНЧ [1]. Однако, проблемой использования неионных ПАВ является снижение солюбилизации ионов железа в мицеллах [1]. Эту проблему позволяет решить, например, применение неионного поверхностно-активного вещества Twееn 81 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат) в качестве диспергатора наноэмульсии [14], что позволяет получить высокодисперсные системы с большим содержанием ионов железа. Такие эмульсии пригодны и для получения МНЧ с возможной гиб-коуправляемой модификацией поверхности частиц биосовместимым полисахаридом — декстраном [1, 15]. Получение воспроизводимых по размерам МНЧ в форме устойчивых водно-органических наноэмуль-сий служит базой для отработки аналитических методов измерения главных характеристик МНЧ — гидродинамического радиуса и суммарного магнитного момента частицы, которые могут быть использованы при конструировании лабораторий на чипе. Малые размеры МНЧ определяют требования при выборе методов их исследования:
• отсутствие возмущения структуры МНЧ в процессе измерения;
• возможность измерения размера и намагниченности наночастицы непосредственно в жидкой фазе без пробоотбора и процедур фиксации микроскопического анализа.
Использование в конструкции измерительной системы метода динамического рассеяния света в комбинированном варианте статического рассеяния и рассеяния частицами МНЧ при направленном движении под действием магнитного поля может быть положено в основу контрольно-измерительных устройств мониторинга МНЧ в капиллярных ячейках. Справедливость этого положения доказана на образцах МНЧ оксида железа, полученных методом наноэмульсионного синтеза в присутствии неионного диспергатора Twееn 81, и образцах магнитных наночастиц, стабилизированных декстраном, в том числе нагруженных белком — интерфероном.
Экспериментальная часть
Материалы
В синтезе использовали следующие материалы: Twееn 81 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат, «Sig-та-АЫпсЬ»); пентадекан чистый (Реахим, Санкт-Петербург); деионизованная вода, 17 МОм • см-1; МН4ОН особо чистый (Нева реактив, ГОСТ 24147-80); ГеС13 х 6Н2О чистый (Нева реактив, ГОСТ 4147-74); ГейО4 х 7Н2О чистый (Нева реактив, ГОСТ 4148-78).
Синтез
Гетерофазный синтез наноэмульсий магнетита, подробно описанный ранее [1], проводился с помощью формирования обратных мицелл из неионного поверхностно-активного вещества (НиПАВ) в соответствие со схемой, приведенной на рис. 1. На первом этапе исследовали совместимость НиПАВ с пен-тадеканом путем неводного титрования. Титрование показало полную совместимость во всем диапазоне концентраций компонентов, при этом бинарная система представляла собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета. Солюбилизационная способность воды в пентадекане для Tween 81 исследована с помощью титрования водного раствора НиПАВ с пен-тадеканом и определения пороговых концентраций путем наблюдения точки помутнения при комнатной температуре. В гетерофазном синтезе использовали смесь водного раствора солей железа с пентаде-каном в объемной пропорции 1:4.
Условия синтеза НЧ магнетита отрабатывались для осаждения оксидов Ее по схеме Массарта [16]
Гев04 х 7Н20 + 2ЕеС13 х 6Н20 + 8КН40Н = = Ее304 + 6КН4С1 + 23Н20 + (КН4)2804, (1)
при условиях: 0,3МЕе804 х 7Н20 — 25 мл; 0,3МЕеС13 х 6Н20 — 25 мл; 6нКН40Н — 35 мл.
а)
Оптимальный выход оксида железа в реакции осаждения наблюдали при объемном отношении Ее2+ и Ее3+ 1 : 5. Реакция формирования дисперсии Еез04 проходила при комнатной температуре в течение 5 мин с выходом черной суспензии, быстро агрегирующей с образованием черного осадка, движущегося по направлению магнитного поля, что указывает на его ферромагнитную природу. Осадок в основном содержит агломераты размером от 10 до 100 мкм.
В целях уменьшения размеров и улучшения монодисперсности магнитных наночастиц реакцию провели в наноэмульсионной фазе. Соотношение компонентов: 0,3 М Ее804 х 7Н20 — 0,25 мл; 0,3 М ЕеС13 х х 6Н20 — 0,25 мл; 6нЫН40Н — 0,35 мл; 25%-ный (об.) раствор Tween 81 в пентадекане — 25 мл. Реакцию осаждения проводили при смешивании двух образцов наноэмульсий (НЭ): один из них содержал смесь водных растворов Ее2+ и Ее3+, а другой — водный раствор аммиака. Смешение НЭ ведет к образованию в обратных мицеллах наночастиц Ее304 (рис. 1, в). При образовании Ее304 жидкость изменяет вид от молочно-белой эмульсии до коричневой прозрачной фазы. Полученную НЭ магнетита подвергали ультразвуковой обработке при частоте f = 24 кГц и мощности 0,1 кВт и затем фильтровали на мембранных фильтрах МЕ-МПНроге™ (МПНроге, США) со средним размером пор 0,22 мкм.
б)
Рис. 1 Гетерофазный синтез наносуспензий магнетита: а — схема синтеза и исследования наносуспензий; б — структура обратных мицелл в НЭ состава: неионное НиПАВ/неполярный растворитель (НПР)/вода; в — обратная мицелла с наночастицей магнетита:
1 — НиПАВ; 2 — НПР; 3 — водно-солевой раствор; 4 — НЧМ; ЛДС — лазерное динамическое светорассеяние; СЭМ — сканирующая, электронная микроскопия; ЯМР — ядерный магнитный резонанс; ДЛС — доплеровская лазерная спектроскопия; f( Ь, °С) — калориметрическое титрование, fиW — частота и мощность ультразвука соответственно; ^^ — выход продукта, указанного в соответствующих модулях схемы синтеза, а именно частиц НЭ (обратные мицеллы) с включением НЧМ
Таблица 1 Характеристики образцов магнитных наносуспензий (НС)
Номер образца Внешний вид Происхождение
1 Бесцветный НС с обратными мицеллами (ГосНИИ ОЧБ)
2 Светло-коричневый
3 Темно- коричневый
4 Светло-коричневый НС магнетита, стабилизированного декстраном
5
6
7 НС магнетита, стабилизированного декстраном (образец № 6) с иммобилизованным интерфероном
Приборы и методы
Определение размера магнитных наночастиц.
Размеры МНЧ оценивали методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) [17-19]. Экспериментальная установка представлена на рис. 2. Угол рассеяния а = 45° при длине волны падающего излучения X — 645 нм и световой мощности 30 мВт. Диаметр цилиндрической ячейки 10 мм. Низкая оптическая плотность образцов позволила проводить измерения в режиме однократного рассеяния. В эксперименте измеряли автокорреляционную функцию (АКФ) интенсивности рассеянного света. Вре-
мя накопления сигнала 1 мин, длительность выборки 1 с.
Время корреляции тк, связанное с эффективным гидродинамическим радиусом частицы, находили из следующего выражения, аппроксимирующего АКФ:
С ~ А + В ехр (-2Ъд2т) = А + В ехр(-т / тк). (2)
ЗдесьА и В — безразмерные константы, зависящие от геометрии эксперимента; В — коэффициент диффузии частиц; д — волновой вектор рассеяния,
? =
4 пп вш (0 /2)
X
(3)
где 0 = 45° — угол рассеяния; X - 645 нм — длина волны падающего излучения; п - 1,33 — показатель преломления воды при 20 °С.
Средний гидродинамический радиус МНЧ вычисляли по следующей формуле:
И =
кТд2 тс 3 пц
(4)
где к — константа Больцмана; Т — температура среды; ^ — вязкость среды.
Особенностью экспериментальной установки (рис. 2) является использование относительно низкого частотного предела измерений (44,1 кГц) и аналогового сигнала интенсивности рассеяния. Ана лого-цифровое преобразование и вычисление АКФ выполняются непосредственно в ПК в противоположность традиционным методам, в которых используются специализированные устройства, основанные на технике счета фотонов, а вычисление АКФ осуществляется микропроцессорами на независимых пла-
Рис. 2 Экспериментальная установка для определения размера наночастиц методом ЛДС: а — оптическая схема; б — общий вид:
1 — фотоприемное устройство, содержащее фотодиод с размерами активной поверхности 50 х50 мкм и предусилитель; 2 — модуль фокусирования сигнала (линза и диафрагма); 3 — кювета; 4 — собирающая линза с фокусным расстоянием f =60 мм; 5 — лазерный диод с выходной оптической мощностью 30 мВт и длиной волны излучения Л =645 нм; 6 — диафрагма с диаметром отверстия й =1 мм; 7 — поляризационная пластина;
в — образцы магнитных наносуспензий с частицами различных размеров и концентрации, обнаруживаемыми проходящим пучком излучения лазерного диода
Рис. 3 Экспериментальная установка для измерения магнитофоретической подвижности наночастиц методом доплеровского лазерного светорассеяния: а — оптическая- схема; б — общий вид;
I — измерительная ячейка; 2 — магнит; 3 — фотодиод; 4 — оптический сигнал; 5,6 — вход и выход для загрузки магнитной наносуспензии; 7 — падающий пучок излучения; 8 — линза; 9 — светоделительная пластинка; 10 — лазерный диод (характеристики см. подпись к рис. 2);
II — пучок излучения лазера; 12 — опорный (гетеродин) пучок света; 13 — гониометр
тах (корреляторах) [19]. Разработанная конструкция имеет низкую стоимость и применима для многих приложений, таких как контроль и оптимизация процесса синтеза НЧ [20].
Вязкость измеряли с помощью вискозиметра Оствальда.
Лазерное доплеровское светорассеяние в капилляре. Экспериментальная установка для измерения скорости МНЧ в магнитном поле представлена на рис. 3 [20].
При применении техники оптического смешения АКФ интенсивности рассеянного света частицами, движущимися со скоростью V, выглядит следующим образом:
G ~ cos (qvi)ехр(-q2Di).
(5)
С помощью формулы (3) находим, что при 0 -
- 7°, X- 645 нм, п - 1,33 (показатель преломления воды при 20 °С) волновой вектор рассеяния д -
- 1,58 • 106
м
-1
Используя приближенное выражение gvтм - п, можно оценить скорость движения как
п
qt
(6)
где тм определяют из экспериментальной АКФ по положению ее первого минимума (рис. 4, б).
Рис. 4
Измерение магнитофоретической подвижности в капиллярном чипе с магнитопроводами: а — измерительный капиллярный чип; б — пример реализации автокорреляционной функции G(t), вычисленной с помощью программы отображения сигнала и обработки данных установки для- ДЛС. Капиллярный чип содержит два магнитопровода (MG1 и MG2) для измерения магнитофоретической подвижности магнитных наночастиц. Состав магнитопроводов: MG1 — композит: полимер/железная
пудра; MG2 — фольга из магнитной стали толщиной 60 мкм; а.
расстояния от торца
магнитопровода до точек измерения скорости. На интерфейсе верхнее окно — сигнал, нижнее окно — свертка в АКФ интенсивности рассеянного движущимися наночастицами света в капилляре
Для измерения скорости направленного движения МНЧ под действием градиента магнитного поля была изготовлена специальная ячейка в форме капиллярного чипа. На рис. 4, а представлена фотография измерительного капиллярного чипа с двумя магнитопроводами: MG^ и MG2, в котором точки измерения находятся на расстояниях от торца маг-нитопровода а^ = 3 мм и а2 = 13 мм. На рис. 4, б представлена реализация АКФ, полученная с помощью программы для отображения сигнала, и его свертки в АКФ, разработанной с помощью пакета LabView (National instruments, США).
Микрогауссметр и источники магнитного поля. Для измерения конфигурации магнитного поля в капиллярном чипе был изготовлен простой прибор, в основе которого лежит гальваномагнитный метод измерения. Чувствительным элементом в нем является датчик Холла ss495a компании Honeywell. Типичный диапазон измерений этого датчика от -670 до +670 Гс, чувствительность 3,125 ■ ■ 0,125 мВ/Гс. Размеры датчика 4,06 х 2,99 мм. Общий вид гауссметра представлена на рис. 5, а, а схема измерения магнитной индукции — на рис. 5, б. В качестве источника питания датчика использовались элементы питания типа АА.
-SR
Риг. а
Измерение напряженности магнитного поля: а — микрогауссметр, изготовленный на основе датчика Холла зв495а (Honeywell, США); б — схема измерений;
1 — датчик Холла ss495a; 2 — блок питания; 3 — сенсор; 4 — усилитель; 5 — вольтметр;
в — постоянный магнит неодим—железо—бор в виде цилиндров радиусом 9 мм и высотой 8 мм
Проведены измерения характеристик датчика. Для этого на измерительном стенде на плоскости нанесена угловая координатная сетка с различными углами подхода магнита к датчику. Плоскость магнита параллельна плоскости чувствительного элемента. При движении магнита к датчику измеряли показания милливольтметра. Таким образом, удалось измерить характеристики датчика в диапазоне от -45 до +45° от оси и характеристики магнита по основной оси (результаты приведены на рис. 9).
В качестве источников магнитного поля для перемещения МНЧ использовали постоянные супермагниты ^ГеВ (неодим—железо—бор) (рис. 5, в) марки N40 (радиус 9 мм, высота 8 мм) с остаточной намагниченностью 1,2 Тл и простой электромагнит с ферритовым сердечником. Для изготовления электромагнита с заданными характеристиками на стандартный стержень диметром 5 мм с заточенным торцом и длиной 100 мм намотали проволоку сечением 0,4 мм в пять слоев. Заточенный конец стержня подводили к датчику. На катушку подавали электрическое питание в двух режимах: 1) I = 250 мА, и = 10 В; 2) I = 300 мА, и = 12 В.
Результаты и их обсуждение
Магнитная наносуспензия
Тройная система Tween81—пентадекан—вода, приготовленная в соответствие со схемой на рис. 1, использована для синтеза МНЧ. Фазовая диаграмма системы представлена на рис. 6. Разделение фаз имеет резкий характер и проходит через стадию мутных эмульсий, после которой происходит быстрое разделение фаз на верхнюю водную фазу и нижнюю фазу наноэмульсии. Точки перегиба, показанные на фазовой диаграмме (рис. 6), образуют непрерывную линию, соответствующую границе гомогенной фазы, занимающей широкую область фазового треугольника. Это означает, что Tween 81 обеспечивает хороший уровень солюбилизации воды в пентадекане и, следовательно, гидрофильных молекул и ионов. Тройная система, показанная на рис. 6, имеет следующие области: изотропную фазу МНЧ, содержащую набухшие обратные мицеллы при низкой влажности (фазу 1); небольшую фракцию (до 1 % об.) — так называемую, бинепрерывную жидкокристаллическую вязкую фазу, наблюдаемую с помощью дей-териевого ядерного магнитного резонанса 2Н-ЯМР [1]; непрерывный водный мицеллярный раствор и двухфазную структуру (фазу 2).
Фаза 1 на рис. 6 представляет собой прозрачную жидкость, которая сохраняет стабильность в течение 30 суток после приготовления. Вязкость ^ фазы 1, измеренная с помощью вискозиметра Оствальда, близка к вязкости сухих растворов Tween 81 в пентадекане и составляет 10,2 сР. В случае водных суспензий магнитных наночастиц для вычислений брали
Пентадекан 0,00 1,0
1,00 Ттееп 81
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
0,0 Вода
Рис. 6 Фазовая диаграмма тройной системы Ттееп 81 — пентадекан—вода, полученная для объемных долей компонентов при £ = 20 °С:
1 — изотропная, фаза; 2 — эмульсия
вязкость воды. Оптимизированная при комнатной температуре тройная система, таким образом, содержит Twееn 81—пентадекан в объемном соотношении 1: 4 и имеет состав: Twееn 81 (19,8 % об.), пентадекан (79,0 % об.), вода (1,2 % об.). Фаза 1 представляет собой наноэмульсию, которая содержит обратные мицеллы, включающие свободную и гидратиро-ванную воду (рис. 1, б). Свободная вода в обратных мицеллах выполняет роль среды микрореактора ге-терофазного синтеза наночастиц магнетита. Гетеро-фазная зона 2 содержит целый ряд сложных структур, рассмотрение которых выходит за рамки данной статьи.
Наблюдается температурная зависимость объема солюбилизированной воды в системе Twееn 81—пентадекан (рис. 7, а). Минимальный объем воды, необходимый для получения двухфазной системы, измеряли путем наблюдения момента расслаивания изотропной фазы для заданного объемного соотношения компонентов при нагревании со скоростью
1 °С • мин-1 в интервале 20-50 °С. Повышение температуры приводит к уменьшению количества солюбилизированной воды, поэтому все дальнейшие исследования проводили при t — 20 °С в условиях максимальной солюбилизации воды.
Известно, что повышение ионной силы полярного растворителя может снижать стабильность систем с неионным ПАВ, приводя к разделению фаз, снижению уровня солюбилизации электролитов [1]. Экспериментально установлено, что тройная система Twееn 81—пентадекан—вода остается стабильной при варьировании ионной силы растворов Ге+2, Ге+3 в пределах экспериментальных концентраций, т. е. система может использоваться для получения наноэмульсии МНЧ. Не наблюдалось и изменения цвета, что указывает на отсутствие гидролиза солей железа.
Спектры наноэмульсий, полученные методом протонного магнитного резонанса 1Н-ЯМР для различ-
ных объемных концентраций воды при комнатной температуре, показали наличие концентрационной зависимости с насыщением химических сдвигов протонов р в группах —СН2—СН2—О— (рис. 7, б). Уровень насыщения наблюдали при влажности, соответствующей двум молекулам Н2О на одну группу —СН2—СН2—О—, что подтверждает капельную структуру наноэмульсии.
Таким образом, наноэмульсия, образованная Twееn 81, состоит из обратных гидратированных мицелл, содержащих связанную и свободную воду (см. рис. 1). Пороговая концентрация 9,9 % об. соответствует соотношению 10 молекул связанной Н2О на одну молекулу Twееn 81. Существование фракции свободной воды обеспечивает солюбилизацию ионов Ге+2 и Ге+3 и протекание реакции осаждения
0 20
30 35 40 Температура, °С
5 10 15
Объемная доля воды, %
Рис.. 7
Данные физико-химического состояния солюбилизированной воды в наноэмульсии: а — температурная зависимость максимальной объемной доли солюбилизированной воды в наноэмульсии Тюееп 81—пентадекан (25:75 % об.); б — химический сдвиг протона р в группе —СН2—СН2—О— Тюееп 81 при изменении объемной доли воды (%об.) в системе Тюееп 81—пентадекан (0,25 % об.), наблюдаемый в 1Н-ЯМР
магнетита в раздельных каплях с размером, близким размеру обратных мицелл.
Суперпарамагнитные свойства эмульсии МНЧ исследованы с помощью измерения протонной релаксации и ширины резонансных линий воды, Tween 81 и пентадекана в присутствии МНЧ. Абсолютное значение времени спин-спиновой Т2 и спин-решеточной Т релаксации измеряли для наноэмульсии и водного раствора Ге3+ при различных концентрациях железа. Результаты, представленные на рис. 7, а, показывают, что в наноэмульсиях магнетита величина Т2 снижается более эффективно, чем в парамагнитных растворах Ге+3. Соответствующие значения ширины линии — величины, обратно пропорциональной Т2 и являющейся индикатором пространственной неоднородности магнитного поля вокруг МНЧ, свиде-
— Раствор Ре3+
магнетита
0,4 0,6
С, мм
б)
Ц — Раствор Ре3+ О — НЭ магнетита
Рис. 8
Зависимости концентрации железа в наноэмульсии и вводном растворе Же+3: а — от времени спин-спиновой релаксации Т 2 протонного магнитного резонанса; б — от ширины линии протонного магнитного резонанса
тельствуют о сильном возмущении магнитного поля в окрестности МНЧ, что является следствием их суперпарамагнитной природы (рис. 8, б). Таким образом, на основе данных ЯМР показано, что полученные гетерофазным синтезом эмульсии магнитных наночастиц магнетита обладают свойством суперпарамагнетизма.
Определение размеров частиц
в магнитных наноэмульсиях
Средний размер частиц й (й = 2Я, где Я — гидродинамический радиус) для диамагнитных наноэмуль-сий и нанодисперсий магнетита (как показано на рис. 1, б, в) вычисляли на основе времени корреляции тк и вязкости среды ^ = 10,2 сР при 20 °С. Данные представлены в табл. 2 как средние по пяти измерениям. Размер частиц в дисперсиях магнетита находится в пределах 10 ± 1 нм.
Данные в табл. 2 показывают, что формирование наночастиц магнетита в каплях увеличивает размер обратных мицелл. Наблюдаемые АКФ имеют экспоненциальную форму, что указывает на монодисперсность распределения по размерам частиц в наносус-пензии (табл. 3).
Измерение характеристик источников магнитного поля и датчика магнитного поля
С помощью микрогауссметра исследовано магнитное поле постоянного неодимового супермагнита. Получены экспериментальные зависимости магнитной индукции магнита В от расстояния по основной
Таблица 2 Время корреляции тк и средний размер 4 капель в НЭ и НЭ с магнетитом
Система тк, мс с1, нм
Капля НЭ Капля НЭ с магнетитом 1,48 + 0,01 2,59 + 0,03 5,8 + 0,3 10,1 + 1,0
Таблица 3 Размеры частиц синтезированных
магнитных наносуспензий
Номер образца Визуальная оценка интенсивности рассеяния по 10-балльной Время корреляции тк, Ю 6 с Гидродинамический радиус Л, нм
шкале
1 4 0,80 10
2 7 0,90 11
3 8 1,10 15
4 10 22,40 112
5 10 21,00 106
6 8 2,56 36
7 9 2,86 40
оси симметрии (торец магнита располагается перпендикулярно к плоскости датчика) и характеристики самого датчика как на основной оси, так и под углами отклонения от нее: +30, -30, +45, -45° (рис. 9). Из графика (рис. 9) видно, что поле постоянного магнита убывает экспоненциально.
Полученные данные сравнивали с характеристиками электромагнита при различных токах в обмотке. На основе полученных данных определены геометрические параметры экспериментального чипа. Выбор был сделан в пользу постоянных магнитов, так как они создавали большее значение магнитной индукции. Но применение электромагнитов представляется более интересной задачей, поскольку с их помощью можно управлять силой магнитного поля без механических перемещений. Значения магнитной индукции у острия сердечника электромагнита при токах 250 и 300 мА соответственно составили 65 и 75 • 104 Тл.
Поскольку магнитная индукция убывает экспоненциально, для применения магнитных полей в качестве движущей силы в чипе необходимо решить задачу локального приложения магнитного поля. Для этой цели исследованы магнитопроводы двух типов: магнитная сталь и композит. В пользу второго решения говорит возможность применения техники печати для создания заданных топологий магнитопроводов на чипе. Исследована эффективность композитных магнитопроводов по сравнению с магнитной сталью, которую считали эталонным материалом. Проведены три типа измерений: 1) проверка эффективности магнитопроводов по сравнению со средой; 2) влияние длины магнитопровода на затухание магнитной индукции; 3) сравнение магнитопроводов двух типов.
На рис. 10 приведен график зависимостей магнитной индукции постоянного магнита от расстояния при распространении поля через воздух и с при-
1000
2 4
Расстояние, 10~2, м
Рис. 10
Зависимость магнитной индукции В от длины магнитопровода
менением магнитопровода. Из рис. 10 видно, что применение магнитопровода эффективно при расстояниях более 1 см. Применение магнитопровода позволяет снизить потери магнитной индукции и локально прикладывать магнитное поле в заданных точках лаборатории на чипе.
Исследован характер затухания магнитной индукции при удалении от магнитопровода (рис. 11). Из рис. 11 видно, что намагниченный магнитопро-вод представляет собой источник магнитного поля, но более слабый по сравнению с намагничивающим неодимовым магнитом.
При использовании стального магнитопровода магнитный момент для МНС 152, табл. 1 составил рст = 5,345 • 10 16 А/м2, а при использовании композитного магнитопровода — рКОмп = 5,103 • 10 16 А • м2. Небольшая разница между величинамирст ирКОмп связана с различиями в магнитной восприимчиво-
600
400
л
Еч
<200
В
0
0,1
Расстояние,
Рис. 9
10,0
Зависимости магнитной индукции В от расстояния между магнитом и датчиком Холла: 1 — по основной, оси магнита; 2 — под углом ±30°; 3 — под углом ±40°
140
120
100
В, 60
Рис. 11
5 10 15
Расстояние, 10~8, м
Зависимость индукции магнитного поля В от расстояния между торцом магнитопровода и датчиком Холла в воздухе. Точками представлены экспериментальные значения, а сплошной линией — аппроксимация экспоненциальной функцией
Таблица 4 Градиент магнитной индукции dB/dx в воздухе на различных расстояниях L от магнитопровода
L, 10- 3 м дВ/дх, Тл • м-1
10 228
20 186
сти магнитопроводов и локальном индуцированном в среде поле. В то же время показана эффективность композитного магнитопровода, имеющего технологические преимущества при формировании промышленных изделий методом печати. Время проведения анализа составляет 1-3 мин. Это дает возможность осуществлять экспрессные методы анализа.
Измерен характер угасания поля в воздухе на различных расстояниях от торца композитного магнитопровода (табл. 4). Измерения показывают, что в капилляре на расстоянии 20 мм от торца интегрированной магнитопроводной ламели уровень магнитной индукции высок.
Из графика рис. 11 найдено следующее эмпирическое выражение для магнитной индукции В, выраженной в Тл, в зависимости от расстояния от намагниченного магнитопровода:
В - 1,39ехр(-х/0,005). (7)
Градиент магнитного поля 5В/5х, выраженный в Тл • м-1, находится дифференцированием выражения (7) по переменной х:
дВ / дх = 2,78 • 102ехр(-х /0,005). (8)
Исследование подвижности наночастиц методом доплеровского магнитофоретического рассеяния света
Для оценки эффективности магнитных наночастиц в аналитических приложениях измеряют их способность двигаться в данной среде под действием внешнего магнитного поля. Методом доплеровского лазерного рассеяния света (или магнитофоретического рассеяния) можно одновременно измерять размеры и подвижность частиц в очень широком диапазоне размеров и скоростей (например: радиус г в пределах от 0,001 нм до 3-5 мкм, а скорость V от 10~5 до 10 мм • с-1). Надо отметить, что при использовании метода треков нижний размер наблюдаемых частиц составляет десятки нанометров, что связано с необходимостью визуализации образов НЧ в оптическом микроскопе.
Использование микрокапиллярного чипа при измерении магнитофоретической подвижности магнитных НЧ имеет следующие преимущества:
1) капилляр имеет небольшие размеры, и в нем легко создать нужный градиент магнитного поля, не прибегая к использованию специальных громоздких магнитов со сверхвысокими магнитными полями;
2) тонкий капилляр позволяет исследовать образцы с высокой концентрацией, так как в этом случае измерения проводятся в режиме однократного рассеяния, когда возможен однозначный анализ АКФ на основании формулы (4).
Сила ¥, действующая на частицу в магнитном поле, зависит как от магнитного поля, так и от его градиента и может быть записана следующим образом:
F = М VB 0B, ах
(9)
где — это разность магнитных восприимчивостей МНЧ и среды; Цо — магнитная постоянная; V = = (4/3)яг3 — объем НЧ (в приближении сферической частицы).
Чтобы найти скорость движения МНЧ в жидкости, необходимо приравнять эту силу к силе сопротивления Стокса, = 6я"^г, которая возникает при движении сферической частицы радиусом г со скоростью V в жидкости с вязкостью ". Тогда скорость магнитофоретического движения
v = 2 [ Ах ] г2Б дВ = щмф Е ЭВ 9 J дх дх '
(10)
Здесь вводится величина тмф, которая характеризует способность магнитной частицы двигаться в данной среде под действием внешнего магнитного поля и называется ее магнитофоретической подвижностью. Магнитофоретическая подвижность имеет размерность м3А-1Тл-1с-1 и определяется следующим выражением:
m
мф ■
! (f1
(11)
Измеряя скорость магнитных частиц, магнитное поле и его градиент в точке нахождения частицы, можно определить тмф по формуле
тмф -
В(дВ/ дх)'
(12)
Проведено исследование магнитофореза МНЧ в капиллярном чипе, представленном на рис. 4, а, с помощью установки, показанной на рис. 3. Для исследования использовали композитный магнито-провод, так как он более технологичен и эффективен, чем стальной. С использованием этого магнитопровода измерены скорости движения магнитных наночастиц в капилляре на расстояниях: а-1 = 3 мм и а£ = 13 мм от торца магнитопровода, как показано на рис. 4, а. Значения скоростей, измеренных для семи различных образцов, приведены в табл. 5.
Определены значения магнитофоретической подвижности образцов тмф по формуле (12) (табл. 6).
Из табл. 6 видно, что магнитофоретическая подвижность существенно меняется в различных образцах. Это вызвано главным образом влиянием радиуса Я на величину тмф, что согласуется с формулой (11).
Таблица 5 Скорость магнитных наночастиц
в магнитном поле
Номер ^М» Ю-3 с V, Ю-6 м • С"1 тм, Ю-з с V, 10-е м • С"1
образца а1 = 3 мм а2 = 13 мм
1 35,30 56,7 280,0 7,14
2 30,60 65,4 243,0 8,23
3 24,80 80,6 185,0 10,80
4 5,05 396,0 38,7 51,70
5 6,43 311,0 49,5 40,60
6 15,40 129,0 124,0 16,10
7 13,30 150,0 107,0 18,70
Таблица 6 Магнитофоретическая подвижность
тмф магнитных наночастиц
Номер образца тпмф, 10-13 мз • Т-1 • А-1 • с-1
1 4,54
2 5,23
3 6,45
4 31,70
5 24,90
6 10,30
7 12,00
Время проведения анализа подвижности НЧ методом доплеровского магнитофоретического рассеяния света составляет 1-3 мин, что дает возможность проводить экспресс-анализ магнитных суспензий.
Следует, однако, отметить, что после заливки жидкости в чип магнитная суспензия полностью
приходит в равновесное положение не сразу, а спустя некоторое время — порядка нескольких минут, что видно из рис. 12, где представлены автокорреляционные функции О(х) для МНС, записанные через 6 и 20 с после начала эксперимента. Видно смещение первого минимума функции О(х) в сторону увеличения времени корреляции от 0,0305 до 0,0644 с. Поэтому для получения достоверных результатов измерения необходимо принимать этот факт во внимание.
Заключение
Изготовлены образцы магнитных наносуспензий (МНС), обладающих суперпарамагнитными свойствами и размерами 10-15 нм. Для гетерофазного синтеза МНЭ использовали тройную систему Т'№ееп 81— пентадекан—вода. Суперпарамагнитные свойства МНЭ наблюдали с помощью ЯМР-спектроскопии, а размеры частиц определены методом лазерного динамического светорассеяния на чипе. Изготовлена модель капиллярного чипа с магнитопроводами и исследованы характеристики последних. Показано, что эффективность композитного магнитопровода не уступает параметрам магнитной стали, при этом композитный магнитопровод обладает формуемостью и перспективен для создания гибридно-интегральных лабораторий на чипе с применением магнитных на-ночастиц в качестве носителей. Подвижность синтезированных магнитных наночастиц в обратных мицеллах сравнивается с данными, для наночастиц магнетита стабилизированных декстраном. Определены магнитные моменты, движущая сила, скорости и магнитофоретическая подвижность наночастиц в суспензиях. Полученные данные находятся в хорошем соответствии с данными, полученными методом трассирования.
а)
1
б)
1
-1
\ \
\ / ^1^
0,06444
0,00
0,05
0,10
0,15
0,00
0,05
0,10
0,15
Рис. 12 Автокорреляционные функции т) для самопроизвольного перетекания магнитной наносуспензии
в капиллярной системе. Уменьшение скоростипроявляется в смещении первого минимума функции С( т) в сторону увеличения: а — измерение через 6 с после начала эксперимента, тм = 0,0305 с; б — то же через 20 с, тм = 0,0305 с. Время накопления сигнала 2 с
| Л и т е р а т у р а |
1. Nikolaev В. P., Eliseev О. V., Marchenko Ya. Yu. et al.
// AIP Conf. Proc. V. 1311, P. 458-465, 2010, 8-th Int. Conf. on the scientific and clinical applications of magnetic carriers, Rostock, (Germany), 25-29 May 2010.
2 Kapp D. S., Hahn G. M., Carlson R. W. // Principles of Hyperthermia. In: Bast R. C. Jr., Kufe D. W., Pollock R. E., et al., editors. / Cancer Medicine e.5. 5th ed. Hamilton, Ontario: B.C. Decker Inc., 2000.
3 Hahn Y. K., Jin Z., Kang J. H. et al. // Magnetophoretic immunoassay of allergen specific IgE in an enhanced magnetic field gradient / Anal. Chem., 2007. V. 79. P. 22142220.
4 Gijs M. A. M. // Magnetic bead handling on-chip: new opportunities for analytical applications / Microfluid. Nano-fluid. 2004. V. 1. P. 22-40.
5 Зимина Т. M. Микро- и наноаналитические системы / Зимина Т. М.// Микро- и наносистемная техника. — 2007. № 8. — С. 27-49.
6 Zimina Т. M., Luchinin V. V., Soloviev A. V., Kuznetso-va N. V., Mukhurov N. I., Gasenkova I. V., Kraeva L. A., Tseneva G. Ya // Functional Elements of Laboratory-on-a-Chip for Express Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bac-terial Respiratory Tract Infections. / Proc. of 2010 Lab-on-a-Chip European Congr., Abstract 116. Dublin, 24-27 May, 2010.
7 West J., Karamata В., Lillis В. et al. // Application of mag-netohydrodynamic actuation to continuous flow chemistry / Lab. Chip. 2002. V. 2. P. 224-230
8 Lim J. K., Lanni C., Evarts E. R. et al. // Magnetophoresis of Nanoparticles/ACS Nano. 2011. V. 5, NO. 1, p. 217-226.
9 Hahn Y. K., Jin Z., Jang J.-В., Kim H. S., Park J.-K. // Magnetophoretic position detection for multiplexed immunoassays using colored microspheres in a microchannel / Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24, P. 1870-1876.
10 Kim K. S., Park J.-K. //Magnetic force-based multiplexed immunoassay using superparamagnetic nanoparticles in micro-fluidic channel / Lab. Chip. 2005. V. 5, P. 657-664, 2005.
11 Schaller V., Kraling U., Rusu C. et al.// Motion of nanometer sized magnetic particles in a magnetic field gradient / J. Appl. Phys. 2008. V. 104. P. 093918 (1-14).
12 Патент 2298798 РФ МПК7 G01N33/546. Способ контроля биологической пробы в реакции латекс-агглютинации и аналитическая система для его осуществления / Т. М. Зимина, В. В. Лучинин, В. Е. Мигунова, Л. А. Краева, Г. Я. Ценева, А. Ю. Меньшикова, Б. М. Шаб-сельс, М. В. Дулатова, Г. Ф. Шпилюк № 2006101355/ 15, заявл. 01.17.2006, опубл. 05.10.2005, Бюл. № 13.
13 Kang Joo Н., Hahn Y. K., Sung Kim K., Park Je-Kyun. Microfluidic sandwich immunoassays for sub-femtomole detection using magnetic field-induced nanoparticles. Proc. of ц-TAS 2005 Conference. Boston. USA. Oct. 9-13.
14 Corot C., Robert P. Recent advances in iron oxide nanocrys-tal technology for medical imaging // Adv. Drug Deliv. Rev./ 2006. Vol. 58. P. 1471-1504.
15 Eastoe J., Hollamby M. J., Hudson L., Recent advances in nanoparticle synthesis with reversed micelles. Colloid Interface Sci. 2006. V. 128-130, P. 5-15.
16 Massart R. // Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media /IEEE Trans. Magn. 1981. V. 17. P. 1247-1248.
17 Chu B. Laser Light Scattering. Academic Press, N.Y., 1974.
18 Yudin I. K., Anisimov M. A., Agayan V. A. et al. // Simple photon-correlation spectrometer for research and education/ Int. J. Thermophys. 1997. V. 18. P. 1237-1248.
19 Soloviev A. V., Tufue R., Sanchez C., Kanaev A. V. // Nucleation Stage in the Ti(O-iPr) 4 Sol-Gel Process / J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 4175-4181.
20 Зимина Т. М., Соловьев А. В., Лучинин В. В. // Лазерный доплеровский анализатор. МПК7 G01P3/00./ № 008127023/28, заявл. 02.07.2008. опубл. 10.01.2010. Бюл. № 32, Патент № 2416803.
