DOI: 10.24412/1999-6780-2022-4-4-9 УДК 582.282.23:615.015.8:615.282
КЛАССИФИКАЦИЯ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ГРИБОВ РОДА CANDIDA ПО ОТНОШЕНИЮ К ФЛУКОНАЗОЛУ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Еноктаева О.В. (ассистент кафедры)*, Нико-ленко М.В. (профессор кафедры), Казакова А.В. (доцент кафедры), Показаньева Л.Е. (студент), Давыдкина Н.С. (ординатор кафедры)
Тюменский государственный медицинский университет, Тюмень, Россия
Обзор литературы посвящен изучению механизмов лекарственной устойчивости, которые позволяют условно-патогенным представителям рода Candida справляться со стрессом, индуцированным флуконазолом, и адаптироваться к нему. Приспосабливаясь к изменениям окружающей среды путем регулирования экспрессии генов и клеточного метаболизма, микромицеты в относительно короткие промежутки времени вырабатывают стратегии по снижению эффективности применения различных лекарственных препаратов, что является причиной терапевтических неудач. Несмотря на широкое применение флуконазола в медицинской практике, данный фунгистатический препарат не способен полностью подавлять жизнедеятельность клеток грибов, что является основополагающим фактором при развитии механизмов резистентности у патогенных видов.
Ключевые слова: Candida, флуконазол, механизмы резистентности
CLASSIFICATION OF FLUCONAZOLE RESISTANCE MECHANISMS OF THE GENUS CANDIDA (LITERATURE REVIEW)
Enoktaeva O.V. (assistant of the department), Nikolenko M.V. (professor of the department), Kazakova A.V. (associate professor of the department), Pokazanieva L.E. (student), Davyd-kina N.S. (resident of the department)
Tyumen State Medical University, Tyumen Russia
Контактное лицо: Еноктаева Ольга Викторовна, e-mail: pechkanova@mail.ru
The literature review is devoted to the study of drug resistance mechanisms, which admit opportunistic species of Candida to inhibit and regulate the stress induced by fluconazole. Responding to environmental changes due to gene expression and cellular metabolism regulating, micromycetes in a short time can develop different drug efficiency impairing strategy that can be the cause of treatment failures. Despite the widespread use of fluconazole in medical practice, this fungi-static drug is not able to completely suppress the vital activity of fungal cells, which is the main factor in the development of resistance mechanisms in pathogenic species.
Key words: Candida, fluconazole, resistance mechanisms
В эпидемиологии кандидозных инфекций важное значение имеет первичная (врожденная) или вторичная (приобретенная) лекарственная резистентность микромицетов рода Candida. Условно-патогенные представители данного рода обладают потенциалом к успешному распространению в популяциях людей за счет реализации генетической информации, хранящейся в их клетках. Наблюдается тенденция снижения эффективности применения различных классов лекарственных препаратов, широко используемых в медицинской практике. Одной из причин данного явления стало бессистемное назначение антимикотиков в целях профилактики, повлекшее за собой увеличение рецидивов протекания инфекции и случаев с летальным исходом среди лиц с компрометированной иммунной системой. Чтобы в дальнейшем избежать терапевтических неудач при лечении кандидоза флуконазолом, необходимо изучить механизмы резистентности, демонстрируемые патогенными видами. Классификация механизмов резистентности позволит выработать новые подходы к антифунгальной терапии.
Цель исследования: систематизировать сведения о механизмах резистентности грибов рода Candida по отношению к флуконазолу.
Характеристика флуконазола.
Часто назначаемый и обычно хорошо переносимый триазольный противогрибковый препарат флу-коназол используется при лечении кандидозных инфекций. Его история началась в 1989 г., когда он пополнил арсенал доступных антимикотиков для системного лечения микозов, вызванных Candida sp. Данный препарат ингибирует фермент цитохрома Р450 в пути биосинтеза эргостерола - ланостеролде-метилазу (14а-деметилазу), кодируемую геном ERG11. Эргостерол поддерживает целостность и текучесть клеточных мембран, влияет на морфологию, вирулентность и характеристики устойчивости
патогенных микромицетов. Токсичное воздействие флуконазола на организм гриба проявляется истощением запасов эргостерола в сочетании с накоплением его предшественников - метилированных сте-ролов, что приводит к задержке роста клеток.
Чувствительность штаммов к флуконазолу среди грибов рода Candida динамично изменяется на протяжении многих лет в зависимости от профиля клинических учреждений и социально-экономического развития региона [1, 2].
Классификация механизмов резистентности грибов рода Candida по отношению к флуконазо-
лу.
В настоящее время очень сложно спрогнозировать развитие резистентных свойств для патогенных микроорганизмов человека, так как устойчивость к лекарственным препаратам может развиваться и без контакта с организмом хозяина. Интересен тот факт, что не только клинические изоляты C. albicans, но и его природные штаммы приобретают резистентность к антимикотикам из-за неконтролируемого сброса сточных вод из лечебных учреждений, содержащих неопределенное количество антифунгальных препаратов [3]. Данный факт может объяснить феномен появления и эффективного распространения новых патогенных видов с лекарственной устойчивостью. Более подробно механизмы резистентности к флу-коназолу у грибов рода Candida будут разобраны ниже (Рис.).
Изменение метаболизма лекарственной мишени.
А) Мутации в гене, кодирующем лекарственную мишень.
Комбинация генов в клетке определяет резистентность патогенных организмов к лекарственным веществам. Для некоторых азол-резистентных изо-лятов C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis и C. auris
характерны миссенс-мутации ERG11, приводящие к однонуклеотидному полиморфизму. Участок гена, в котором происходят частые мутации, называется «горячей точкой». При возникновении молчащих мутаций замены аминокислоты в белке не происходит. Примером противоположного процесса является клинический изолят из онкогематологического отделения - C. kefyr. У него благодаря нуклеотидно-му секвенированию в аллеле ERG11 были идентифицированы две аминокислотные замены: E123Q и K151E. Данные мутации защищают биосинтез эрго-стерола от фунгистатического воздействия флукона-зола, так как наблюдается снижение аффинности между измененной структурой белка и лекарственным препаратом [4-6].
Амплификация и анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена ERG11 показали наличие обширного списка мутаций, возникающих в его поли-нуклеотидной последовательности. Продуктами трансляции, содержащими нонсенс-мутации или де-лецию, являются аберрантные формы белка с укороченной полипептидной цепью. У C. tropicalis был описан дефектный аллель ERG11 с делецией из 132 нуклеотидов, который также повышал резистентность данного патогена по отношению к флуконазо-
лу [7].
Универсальной моделью для изучения устойчивости к противогрибковым препаратам являются виды с гаплоидным набором хромосом, для которых проще всего идентифицировать точечные мутации, повышающие устойчивость к антимикотикам. К ним относятся C. albicans, C. lusitaniae, C. glabrata [8-10].
Любые изменения в молекулярной конфигурации целевого фермента 14а-деметилазы (Erg11p) вследствие мутаций в кодирующем гене ERG11 могут являться факторами, снижающими сродство между флуконазолом и белком. Возникновение данным путем устойчивости к лекарственному препарату приводит к увеличению минимальной ингибиру-ющей концентрации (MIC) азолов.
Б) Геномные перестройки.
У микромицетов переход генов из гетерозиготного состояния в гомозиготное стал одним из факторов усиления механизмов устойчивости к лекарственным препаратам. В присутствии флуконазола у особи из первоначально клональной, чувствительной к лекарственным препаратам популяции, в одном из аллелей может возникнуть спорадическая мутация резистентности. Выступая в роли стрессового фактора, флуконазол запускает рекомбинационный процесс у видов с парасексуальным циклом размножения, а селективное давление окружающей среды способствует естественному отбору индуцированных геномных перестроек в новом поколении клеток. Формирующиеся субпопуляции будут давать
начало новым штаммам с разной степенью устойчивости. Чем дольше патоген контактирует с лекарственным препаратом, тем более широк его арсенал механизмов лекарственной устойчивости. Так вкратце можно описать гипотетический сценарий микроэволюции штаммов с высокой лекарственной резистентностью путем рекомбинации генетического материала [11].
Увеличение генетического разнообразия популяций C. albicans и C. tropicalis напрямую зависит от возможности вступать в парасексуальный цикл размножения. Переход из стерильного белого состояния в компетентное к спариванию непрозрачное состояние является основным механизмом смены пло-идности. Слияние двух непрозрачных диплоидных (или близких по плоидности) клеток, содержащих генетические локусы MTLа и MTLa, приводит к образованию тетраплоидной клетки MTLa/ а. Немейотическая парасексуальная программа согласованной потери гомологичных хромосом способствует возвращению в диплоидное или почти диплоидное состояние с образованием анеуплоидов. При этом количество особей не увеличивается, но происходит генерация большого пула генетически разнообразного потомства. Клетки C. albicans в зависимости от условий среды могут менять свою плоид-ность от гаплоидного до тетраплоидного состояния [10].
Если C. albicans и C. tropicalis могут проходить через бесполый и парасексуальный циклы размножения, то C. lusitaniae - через бесполый и половой. Мейоз у этого вида регулируется биаллельными ло-кусами МАТа и МАТа, необходимыми для спаривания и спорообразования в условиях стресса [9].
Результатом вышеописанных рекомбинацион-ных процессов является наличие широкого спектра внутривидовых геномных вариаций. В их список входят: полиморфизм, изменение числа копий генов, инверсии хромосом, субтеломерная гипервариация, потеря гетерозиготности, а также целые или частичные хромосомные анеуплоидии - состояние карио-типа с несбалансированным числом копий хромосом [12].
Доказано, что трисомия по 4 хромосоме и наличие изохромосомы 5, включающей два левых плеча, придает C. albicans высокий уровень резистентности к азольным препаратам [13].
Кратное изменение уровня экспрессии гена ERG11 зависит от фенотипической пластичности вида, когда один генотип способен генерировать ряд различных фенотипов в ответ на стимулы окружающей среды. Воздействие окислительного стресса, повышенной температуры, антимикотиков, а также прохождение микроорганизма через модель на животных приводят к усилению геномных перестроек у C. albicans, что обеспечивает данному виду способ-
ность быстро генерировать генетическое и феноти-пическое разнообразие особей внутри популяции.
В) Сверхэкспрессия генов, ответственных за синтез лекарственной мишени.
Множественные мутации усиления функции GOF (Gain-of-Function Mutations) в факторах транскрипции, которые приводят к конститутивной активизации генов биосинтеза эргостерола (ERG11) и насосов оттока лекарств (эффлюксные белки), повышают продуцирование целевого стерола.
У C. albicans фактор транскрипции цинкового кластера UPC2 контролирует транскрипционную активацию генов ERG2, ERG7, ERG11 и ERG25. При сверхэкспрессии указанных членов семейства ERG увеличивается концентрация ланостеролдеме-тилазы в клетке. Используемая доза лекарственного препарата не способна инактивировать все синтезированные молекулы белка-мишени в клетке, в результате чего применение флуконазола становится неэффективным. Наличие гена UPC2 позволяет регулировать биогенез плазмолеммы и повышать концентрацию эргостерола при негативном воздействии на клетку.
Мутации типа GOF в Upc2p могут являться причиной повышенной продукции белка Erg11p с последующим формированием фенотипа, устойчивого к флуконазолу. В связи с этим ген UPC2 можно рассматривать в качестве мишени для антифунгаль-ной терапии при лечении кандидоза, вызванного C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis [1, 14].
Г) Развитие компенсаторных путей в метаболизме стеролов.
Инактивация гена ERG3
У штаммов C. albicans и C. tropicalis в результате мутации гена ERG3 можно обнаружить инактивацию фермента А 5,6-стеролдес-сатуразы, ответственного за выработку токсичных метилированных стеролов. Данное явление благотворно влияет на накопление в клетке эргостерола и снижает эффективность применения флуконазола [1].
Поглощение экзогенных стеролов
Способность C. glabrata поглощать экзогенные стерины как при блокировании пути биосинтеза эргостерола, так и при нормальных условиях существования объясняется наличием переносчика стеролов Aus1p, что помогает обойти ингибирование выработки эндогенных стеролов флуконазолом. Аналогичный механизм поглощения экзогенных стеролов был описан и у C. albicans [6].
Изменение стеролового состава клеточной мембраны у устойчивых к флуконазолу штаммов может негативно влиять на процессы жизнедеятельности грибной клетки в отсутствие препарата in vitro и в моделях колонизации при заражении животных. Но
дефекты клеточной мембраны, вызванные инактивацией ERG3 и мутациями в генах, обеспечивающих биосинтез эргостерола, также могут быть преодолены компенсаторными механизмами. Генетические основы этих механизмов еще предстоит уточнить [11].
2) Ограниченное проникновение лекарственного препарата в клетку.
Клеточные детерминанты, препятствующие проникновению лекарственного препарата в клетки грибов, способствуют экструзии антимикотиков или их инактивации.
А) Отток лекарств.
Повышенная экспрессия основных классов эф-флюксных белков обеспечивает экструзию флукона-зола из грибной клетки. Активный отток ксенобиотиков у C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis и C. krusei происходит благодаря работе членов суперсемейства АТФ-связывающих кассет (ABC). Ключевое значение имеют мутации GOF в гене TAC1, которые индуцируют сверхэкспрессию CDR1 и CDR2.
В свою очередь, суперсемейство основных фа-силитаторов (MFS) характерно для C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis и C. tropicalis. Активация транскрипции MDR1 в ответ на введение лекарства в клетку происходит благодаря мутациям GOF в регуляторе множественной лекарственной устойчивости MRR1 [7].
У пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом определяли паттерны экспрессии генов вирулентности 80 штаммов C. albicans, ассоциированных с генами резистентности к азолам. Результаты показали высокую встречаемость у всех исследуемых лиц штаммов генов CDR1 и MDR1, характерных для устойчивого к азолам фенотипа. Данный факт может способствовать хронизации воспалительного процесса в тканях пародонта и неэффективности приема препаратов в схеме лечения таких пациентов [15].
У штамма F13 C. auris была идентифицирована делеция кодона (ttc/|F15) в гене TAC1b. Данная мутация положительно влияет на работу насоса оттока флуконазола из клетки за счет повышенной экспрессии CDR1 [4].
Б) Сокращение импорта лекарств в клетку из окружающей среды.
Способность формировать биопленки на различных биотических и абиотических поверхностях вместе с бактериями является еще одним эффективным механизмом защиты от лекарственных препаратов, так как матрикс, образованный клеточным конгломератом, служит прекрасным барьером, задерживающим молекулы флуконазола [16].
Цитологической особенностью штамма РКПГУ-1821 C. auris является наличие липидного гало вокруг клетки. Возможно, данный слой выполняет функцию барьера для проникновения лекарственных препаратов в клетку [17].
Есть мнение, что секвестрация флуконазола во внутриклеточных вакуолях с последующим их выведением из клетки и изменение вязкости плазмолем-мы у грибов рода Candida могут также вносить свой вклад в резистентность к лекарственным препаратам [18].
Флуконазол проникает в клетки C. albicans путем облегченной диффузии. Сокращение количества поглощенных молекул этого лекарственного препарата грибной клеткой может быть обеспечено гипотетической мутацией переносчика. Действительно, искусственная активация кальциневрина путем де-леции его С-концевого аутоингибирующего домена приводила к повышенной резистентности по отношению к флуконазолу [11].
3) Медиаторы экологического стресса.
Постоянное появление новых профилей устойчивости к лекарственным препаратам у грибов рода Candida подчеркивает их способность адаптироваться к различным изменениям окружающей среды. Схожие механизмы по снижению токсичности лекарств при окислительном стрессе были описаны для видов C. albicans и C. glabrata. Например, у C. albicans транскрипционный фактор Cap1p является активатором экспрессии MDR1 в ответ на окислительный стресс, вызванный H2O2 [18].
Транскрипционный фактор Mrr1 регулирует не только сверхэкспрессию гена MDR1 у видов Candida при развитии резистентности к флуконазолу, но и гены, ответственные за биосинтез метилглиок-сальредуктаз MGD1 и MGD2. Экзогенный метилг-лиоксаль повышает Mn'1-зависимую экспрессию MGD1, MGD2 и MDR1, в результате чего увеличивается экспорт флуконазола из клеток грибов. Можно смело утверждать, что диабет, уремия и сепсис являются факторами риска развития кандидоза, вызванного C. lusitaniae, так как при этих состояниях повышен биосинтез токсичного метаболита метилг-лиоксаля [19].
Еще предстоит оценить влияние на лекарственную резистентность микромицетов теплового и осмотического воздействия, изменения рН и ограничение питательных веществ в окружающей среде.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Пребывание микромицетов в популяциях людей на протяжении определенного времени приводит к появлению штаммов с различными комбинациями механизмов лекарственной устойчивости. Рези-
стентность к антифунгальным препаратам варьирует у представителей рода Candida в зависимости от экспрессии генов ортологов, а у некоторых видов остается по-прежнему неизученной. Так, например, для C. krusei характерна низкая аффинность между видоспецифичным белком Erg11 и флуконазолом. Этот феномен объясняет врожденную резистентность данного вида к изучаемому лекарственному препарату [20].
Особенный интерес представляют клинические изоляты, которые проявляют устойчивость к нескольким классам антимикотиков. Ярким примером данного феномена является выделенный штамм С. albicans от пациента, который проходил курс лечения флуконазолом, а затем — каспофунгином и амфоте-рицином В [21].
Это свидетельствует о том, что эмпирическое назначение антифунгальной терапии без видовой идентификации и определения молекулярной основы резистентности клинических изолятов к лекар-
ственным веществам не дает положительного эффекта в процессе лечения пациентов, особенно, если у них наблюдаются нарушения в работе иммунной системы.
В связи с этим целесообразным шагом в борьбе с микозами будет появление в медицинских учреждениях экономически доступных и простых в исполнении методов определения чувствительности к лекарственным препаратам у клинических изолятов микромицетов, которые позволят сделать антифун-гальную терапию более эффективной.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм. В данной работе не было никаких экспериментальных исследований, в которых были использованы в качестве объектов люди или животные.
ЛИТЕРАТУРА
1. Berkow E.L., Lockhart S.R. Fluconazole resistance in Candida species: a current perspective. Infection and Drug Resistance. 2017; 10: 237. doi.org/10.2147/IDR.S118892
2. Quint T., Wöhrl S., Kinaciyan T. Fixed drug eruption caused by fluconazole - an underdiagnosed but recur-rent problem. Contact. Dermatitis. 2019; 80 (3): 172. doi.org/10.1111/cod.13149
3. Imran Z.K., Al-Karrem Z.A. Evaluation natural cloning of azole-resistant genes CDR1, CDR2, MDR and ERG11 between clinical and soil isolates of Candida albicans based on gene expression. International Journal of PharmTech Research. 2016; 9 (11): 229-236.
4. Carolus H, Pierson S., Muñoz J.F., et al. Genome-wide anal-ysis of experimentally evolved Candida auris reveals multiple novel mechanisms of multidrug resistance. Mbio. 2021; 12 (2): e03333-20. doi.org/10.1128/mBio.03333-20
5. Couzigou C., Gabriel F., Biteau N., et al. Two missense mutations, E123Q and K151E, identified in the ERG11 al-lele of an azole-resistant isolate of Candida kefyr recovered from a stem cell transplant patient for acute myeloid leukemia. Medical Mycology Case Reports. 2014; 5: 12-15. doi.org/10.1016/j.mmcr.2014.04.002
6. Whaley S.G., Berkow E.L., Rybak J.M., et al. Azole antifungal resistance in Candida albicans and emerging non-albicans Candida species. Frontiers in Microbiology. 2017; 7: 2173. doi.org/10.3389/fmicb.2016.02173
7. Eddouzi J., Parker J.E., Vale-Silva L.A., et al. Molecular mechanisms of drug resistance in clinical Candida species isolated from Tunisian hospitals. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2013; 57 (7): 3182-3193. doi.org/10.1128/AAC.00555-13
8. Rodrigues C.F., Silva S., Henriques M. Candidaglabrata: a review of its features and resistance. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 2014; 33 (5): 673-688. doi.org/10.1007/s10096-013-2009-3
9. Mendoza-Reyes D.F., Gómez-Gavina M., Mora-Montes H.M. Candida lusitaniae: Biology, Pathogenicity, Virulence Factors, Diagnosis, and Treatment. Infection and Drug Resistance. 2022: 5121-5135. doi.org/10.2147/IDR.S383785
10. Seervai R.N., Jones Jr S.K., Hirakawa M.P., et al. Parasexuality and ploidy change in Candida tropicalis. Eukaryotic Cell. 2013; 12 (12): 1629-1640. doi.org/10.1128/EC.00128-13
11. Morschhäuser J. The development of fluconazole resistance in Candida albicans - an example of microevo-lution of a fungal pathogen. Journal of Microbiology. 2016; 54 (3): 192-201. doi.org/10.1007/s12275-016-5628-4
12. Hirakawa M. P., Martinez D.A., Sakthikumar S., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 2015; 25 (3): 413-425. doi.org/10.1101/gr.174623.114
13. Anderson M.Z., Saha A., Haseeb A., Bennett R.J. A chromosome 4 trisomy contributes to increased flu-conazole resistance in a clinical isolate of Candida albicans. Microbiology. 2017; 163 (6): 856. doi.org/10.1099/mic.0.000478
14. Vasicek E.M., Berkow E.L., Flowers S.A., et al. UPC2 is universally essential for azole antifungal resistance in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 2014; 13 (7): 933-946. doi.org/10.1128/EC.00221-13
15. Monroy-Pérez E., Rodríguez-Bedolla R.M., Garzón J., et al. Marked virulence and azole resistance in Candida albicans isolated from patients with periodontal disease. Microbial Pathogenesis. 2020; 148: 104436. doi.org/10.1016/j.micpath.2020.104436
16. Еноктаева О.В., Николенко М.В., Трушников Д.Ю. и др. Механизм формирования биопленок грибов рода Candida при кандидозной инфекции (обзор литературы). Проблемы медицинской микологии. 2021; 23 (4): 3-8. [Enoktaeva O.V., Nikolenko M.V., Trushnikov D.Yu., et al. Fungal biofilms formation mechanism of the genus Сandida fungi in Сandida infection (literature review). Problems in Medical Mycology. 2021; 23 (4): 3-8. (In Russ.)]. doi: 10.24412/1999-6780-2021-4-3-8
17. Васильева Н.В., Круглов А.Н., Степанова А.А. и др. Цитологические особенности дрожжевых клеток мульти-резистентного патогена Candida auris. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (3): 3-7. [Vasilyeva N.V., Kruglov A.N., Stepanova A.A., et al. Cytological features of multi-resistance Сandida auris yeast cells. Problems in Medical Mycology. 2018; 20 (3): 3-7. (In Russ.)].
18. Prasad R., Nair R., Banerjee A. Emerging mechanisms of drug resistance in Candida albicans. Yeasts in Biotechnology and Human Health. 2019: 135-153. doi.org/10.1007/978-3-030-13035-0_6
19. Biermann A.R., Demers E.G., Hogan D.A. Mrr1 regulation of methylglyoxal catabolism and methylgly-oxal-induced fluconazole resistance in Candida lusitaniae. Molecular microbiology. 2021; 115 (1): 116-130. doi.org/10.1111/mmi.14604
20. Whaley S.G., Berkow E.L., Rybak J.M., et al. Azole antifungal resistance in Candida albicans and emerging non-albicans Candida species. Frontiers in Microbiology. 2017; 7: 2173. doi.org/10.3389/fmicb.2016.02173
21. Jensen R.H., Astvad K.M.T., Silva L.V., et al. Stepwise emergence of azole, echinocandin and amphotericin B multidrug resistance in vivo in Candida albicans orchestrated by multiple genetic alterations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2015; 70 (9): 2551-2555. doi.org/10.1093/jac/dkv140
Поступила в редакцию журнала 10.11.2022 Рецензент: Т. С. Богомолова