CC BY
46УДК 582.282.23: 528.088.3:615.282 DOI: 10.24412/1999-6780-2021-3-72-77
ИЗОЛЯТЫ CANDIDA AU RIS ОТ ПАЦИЕНТОВ С COVID-19: ИДЕНТИФИКАЦИЯ, РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ПРОТИВОГРИБКОВЫМ ПРЕПАРАТАМ
1Оганесян Э.Г. (ассистент кафедры)*, 2Выборнова И.В. (н.с.), 1Ковыршин C.B. (студент), 2Тараскина А.Е. (зав. лаб.), 1Мошкевич И.Р. (доцент), 1'2Вогомолова Т.С. (зав. лаб., доцент), 2Чилина Г.А. (зав. лаб.), 4Гордеева С.А. (зав. лаб.), 2Ворзова Ю.В. (зав. клиникой), 3Козлова О.П. (ассистент кафедры), 1'2Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1кафедра медицинской микробиологии, 2НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Зкафедра клинической миклогии, аллергологии и иммунологии; Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина, Санкт-Петербург, Россия
Candida auris - возбудитель жизнеугрожающих но-зокомиальных инфекций обнаружен у пациентов с коро-навирусной инфекций, обусловленной SARS-CoV-2, в ряде отделений интенсивной терапии и реанимации Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Первично идентифицированные изоляты С. auris были повторно идентифицированы в референс-центре по верификации микологических исследований. При определении чувствительности 80 штаммов С. auris к противогрибковым препаратам выявлена устойчивость к двум классам антимико-тиков (к флуконазолу - 100% и амфотерицину В - 12%).
Ключевые слова: Candida auris, резистентность к противогрибковым препаратам, идентификация, COVID-19
CANDIDA AURIS ISOLATES FROM PATIENTS WITH COVID-19: IDENTIFICATION, RESISTANCE TO ANTIFUNGAL DRUGS
1Oganesyan E.G. (assistant of the department), 2Vybornova I.V. (scientific researcher), 1Kovyrshin S.V. (student), 2Taraskina A.E. (head of the laboratory), 1Moshkevich I.R. (associate professor), 12Bogomolova T.S. (head of the laboratory, associate professor), 2Chilina G.A. (head of the laboratory), 4Gordeeva S.A. (head of the laboratory), 2Borzova Yu V. (head of the
* Контактное лицо: Оганесян Эллина Григорьевна, e-mail: Ellina.Oganesyan@szgmu.ru
clinic), 3Kozlova О.P. (assistant of the department), 12Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)
North-Western State Medical University named after I.I. Mech-nikov: department of Medical Microbiology, 2Kashkin Research Institute of Medical Mycology, department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology; 4Clinical Infectious Hospital named after S.P. Botkin, St. Petersburg, Russia
Candida auris, the causative agent of life-threatening nosocomial infections, was detected in patients with coronavirus infections caused by SARS-CoV-2 in intensive care units. The originally identified, identified isolates of C. auris were re-identified in the reference center to verify mycological studies. When detei-mining the susceptibility у of 80 strains of C. auris to antifungal drugs, resistance to two classes of antifungals (to fluconazole — 100% and amphotericin В — 12%) was established.
Key words: Candida auris, antifungal resistance, identification, COVID-19
ВВЕДЕНИЕ
Candida auris - грибковый патоген, обладающий множественной устойчивостью к противогрибковым лекарственным средствам, представляет угрозу общественному здоровью во всем мире. С момента первого случая выделения С. auris в 2009 г. из наружного слухового прохода пациента в Японии грибковый патоген обнаружили на 5 континентах и более чем в 47 странах, в том числе и в России [1, 2]. Ретроспективная идентификация более 15000 изоля-тов Candida из международной коллекции (4 континента), собранной в рамках программы SENTRY (2004-2015 гг.), показала отсутствие С. auris до 2009 гг. Это свидетельствует о том, что глобальное распространение этого микромицета началось только в последнее десятилетие [3].
Согласно последним исследованиям инвазивных дрожжевых инфекций среди пациентов с COVID-19 в отделениях интенсивной терапии и реанимации (ОРИТ), С. auris становится значимым этиологическим агентом инвазивного кандидоза наряду с С. albicans, С. tropicalis, С. parapsilosis, С. glabrata. Реальная распространенность С. auris как в мире, так и в России неизвестна. Одной из основных причин является проблема ошибочной идентификации С. auris на основе морфологических и биохимических свойств, как правило, применяемой в рутинной микробиологической практике. Известно, что по биохимическим свойствам (ассимиляции и ферментации Сахаров) этот вид сходен с группой ряда видов Candida (С. haemulonii, С. duobushaemulonii, С. pseu-dohaemulonii, С. sake, C.famata, С. catenulata, С. lusi-taniae, С. tropicalis, С. parapsilosis, С. guilliermondii), что в значительной степени затрудняет идентификацию С. auris на основе традиционных (биохимических) тест-систем. Использование хромогенных сред также может приводить либо к ошибочной
идентификации, либо к ложноположительным результатам. Тестирование С. auris в отношении CHROMagar Candida Plus (CHROMagar), селективного агара HiCrome С. auris MDR (HiMedia), а также трех стандартных хромогенных сред, предназначенных для внутривидовой идентификации дрожжей CandiSelect (Bio-Rad), CHROMagar Candida (CHROMagar) и Chromatic Candida (Liofilchem), продемонстрировало возможность ошибочной идентификации с близкородственными видами и ложно-положительных результатов [4]. Есть сведения о том, что VITEX 2 (bioMerieux версия 8.01) может выявлять С. auris со значительной точностью. В случае С. duobushaemulonii требуется идентификация другими методами. Между тем исследования показали, что данное программное обеспечение точно определяет изоляты из южноамериканской клады, но имеет ограниченные возможности для корректной идентификации С. auris из африканской и восточно-азиатской клад [5]. В настоящее время надежными методами идентификации являются матрично-активированная лазерная десорбционно-
ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS - matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry) и секвенирование генетических локусов рДНК, а именно ITS и области D1/D2 [6]. Однако секвенирование как метод идентификации не используют в повседневной лабораторной практике, и ограниченное количество микробиологических лабораторий в РФ оснащено масс-спектрометрами для идентификации микроорганизмов. В этой связи роль референс-центра по верификации результатов микологических исследований, организованного Минздравом России, и централизованных лабораторий II и III уровней, оснащенных современным оборудованием, резко возрастает.
В разных странах зарегистрированы вспышки внутрибольничных инфекций, вызванных С. auris [7,8], что обусловлено способностью данного микроорганизма длительно сохраняться в жизнеспособном состоянии на объектах среды больницы и высокой контагиозностью. С. auris — единственный представитель грибов рода Candida, который легко передается от человека к человеку. При выделении С. auris из биосубстратов пациента рекомендована изоляция больного для предотвращения дальнейшего распространения в стационаре. Однако это проблематично в отделениях, где находятся пациенты с COVID-19. Среди пациентов с кандидемией, обусловленной С. auris, наблюдают высокую летальность (до 60%) [9]. Несмотря на имеющиеся сведения о резистентности С. auris к трем классам анти-микотиков (к флуконазолу устойчивы около 90% штаммов, к амфотерицину — 30%, к эхинокандинам — менее 5%), документами CLSI (Институт клинических и лабораторных стандартов), EUCAST (Европейский комитет по тестированию на чувствитель-
ность к противомикробным препаратам) и Российскими клиническими рекомендациями еще не определены пограничные значения для категорий чувствительности С. auris к антимикотикам. Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC, США) предложил предварительные пороговые значения на основе имеющихся данных о чувствительности in vitro клинических изолятов С. auris [10].
В связи с этим, основной целью данного многоцентрового исследования была оценка надежности видовой идентификации и in vitro чувствительности клинических изолятов С. auris, выделенных от пациентов с COVID-19 в ОРИТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В рамках многоцентрового исследования (6 стационаров г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области) в период с декабря 2020 г. по сентябрь 2021 г. были выделены 80 изолятов С. auris от пациентов с COVID-19, госпитализированных в отделения интенсивной терапии. Возраст больных варьировался от 37 до 89 лет (среднее значение — 62,1) Соотношение мужчин и женщин среди пациентов составляло — 60: 40.
Выделение и первичную идентификацию штаммов С. auris (п=79) выполняли в 4 локальных микробиологических лабораториях центров-участников при исследовании биосубстратов (крови, мочи, бронхоальвеолярного лаважа, мокроты) до вида с помощью MALDI-TOF-MS (Microflex, Bruker Dalton-ics, VITEK MS, Biomerieux) и в пятой лаборатории -до уровня рода Candida (п=60). Экспертную видовую идентификацию изолятов и определение чувствительности к противогрибковым препаратам осуществляли в референс-центре по верификации результатов микологических исследований (НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина) [11].
Для идентификации полученных изолятов Candida spp. до вида использовали культуры микро-мицетов, полученные на агаризованных средах Са-буро с хлорамфениколом при температуре 37 °С в течение 18-24 ч.
Идентификацию изолятов Candida spp. (n=60) проводили методом MALDI-TOF-масс спектрометрии, ре-идентификацию С. auris осуществляли двумя методами: MALDI-TOF-масс спектрометрией и се-квенированием внутренней транскрибируемой спей-серной области (ITS).
Матрично-ассоциированную лазерную десорбцию/ионизацию — времяпролетную масс-спектрометрию (MALDI-TOF-MS) выполняли на анализаторе (Autoflex, Bruker Daltonics) в автоматическом режиме с применением программного обеспечения MALDI Biotyper v. 3.1. Изолированные колонии в двух повторностях наносили на ячейки мишени, экстрагировали муравьиной кислотой, после чего добавляли 2 мкл матрицы [12].
Секвенирование C.auris по ITS-региону осуществляли с использованием следующих праймеров: ITS4 [TCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC] и ITS5 LGGA-AGT-AAA-AGT-CGT-AAC-AAG-GJ. ДНК экстрагировали с помощью набора QIAquick PCR Purification Kit по инструкции производителя.
Чувствительность С. auris к противогрибковым препаратам определяли с использованием колориметрических планшетов Sensititre YeastOnelO AST (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) в соответствии с инструкцией производителя. Минимальной подавляющей концентрацией (МПК) считали концентрацию препарата, при которой наблюдали значимое подавление роста изолята на основании изменения цвета индикатора в сравнении с контрольной лункой, не содержащей препарат, при визуальной оценке. Оценку результатов проводили в соответствии с рекомендациями CDC (США) по тестированию и интерпретации противогрибковой чувствительности для С. auris (амфотерицин В > 2 мкг/мл, флуконазол > 32 мкг/мл, анидулафунгин > 4 мкг/мл, каспофунгин > 2 мкг/мл и микафунгин > 4 мкг/мл). Для остальных препаратов в настоящее время пограничные значения МПК не определены
[9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Штаммы С. auris (79) из 5 локальных микробиологических лабораторий в референс-центре были ре-идентифицированы методом MALDI TOF MS, идентификация подтверждена в 100% случаев. При идентификации 60 штаммов Candida spp., которые поступили из лаборатории одного центра-участника, были обнаружены: С. auris (п=1), С. albicans (п=56), С. glabrata (п=2), С. tropicalis (п=1) (табл.1). Таким образом, точная идентификация С. auris в микробиологической лаборатории может быть проблематичной, особенно если основываться на фенотипиче-ских характеристиках. Видовая идентификация C.auris была проведена также с помощью ITS секве-нирования. Все штаммы были идентифицированы как С. auris.
Таблица 1
Результаты ре-идентификации Candida spp.
Первичная Ре-идентификация
идентифи-
кация
п=139 MALDI TOF MS
(диапазон Score Val- ITS-идентификация,
ue 1.754-2,114), n=80
n=139.
С. auris C. auris (n=79) C. auris (n=79)
(п=79)
Candida C. auris (n=1) C. auris (n=1)
spp.( n=60) C. tropicalis (n=1) H 0*
C. glabrata (n=2) H 0
C. albicans (n=56) H 0
*н о - не определяли
Структура биологического материала, из которого были выделены изоляты С. аит, представлена на рисунке 1. Основной вид материала - моча (п=53), на втором месте по частоте — кровь (п=22).
моча
Рис. 1. Виды клинического материала, из которых был выделен C.auris
В мировой литературе в основном опубликованы данные о кандидемии, вызванной С. auris. Однако в ряде публикаций сообщается о выделении С. auris из мочи. Так, в ретроспективном исследовании авторы из Пакистана сообщают об обнаружении инфекций мочевыводящих путей (ИМП), вызванных С. auris, у 19 пациентов без кандидемии. Противогрибковую терапию не проводили у 5 из 19 больных, 2 из них умерли в течение 24 часов после высева культуры С. auris из мочи. Устойчивость изолятов к флу-коназолу составляла 100% [13]. Другие авторы рекомендуют при выявлении С. auris из нестерильных локусов делать повторные высевы [14].
Учитывая высокую летальность (до 60%) при инвазивном кандидозе, решающее значение в предотвращении тяжелых грибковых инфекций у больных COVID-19 имеет ограничение распространения C.auris — патогена с множественной устойчивостью к антимикотикам. Следовательно, для предотвращения распространения C.auris в стационарах необходимо идентифицировать изоляты Candida spp. до вида из всех биосубстратов от пациентов с COVID-19 в отделениях ОРИТ.
При определении чувствительности к флукона-золу клинических изолятов, выделенных от пациентов с коронавирусной инфекцией, вне зависимости от локуса, все изоляты были отнесены к категории «резистентные» с МПК > 32-256 мкг/мл. К двум противогрибковым препаратам (амфотерицин В и флуконазол) были резистентны 12% штаммов (табл. 2). В соответствии с рекомендованными ориентировочными пограничными значениями МПК, все протестированные штаммы С. auris были чувствительны к эхинокандинам, что позволяет на данный момент использовать этот класс противогрибковых препаратов в качестве первой линии терапии. Распределение
значений МПК для анидулафунгина, каспофунгина и микафунгина представлены на рисунках 2,3,4. Пунктирные линии указывают на ориентировочные пограничные значения МПК.
Таблица 2
Чувствительность С. а иг/в к противогрибковым препаратам.
Противогрибковые препараты Диапо-зон МПК (мкг/мл) Пограничные значения МПК* (мкг/мл) Резистентность штаммы,%
Пол иены
Амфотерицин В 0,12-2 >2 12% (МПК=2мкг/мл)
Азолы
Вориконазол 0,06 -8 н 0
Итраконазол 0,12-16 н 0 -
Позаконазол 0,06-8 н 0 -
Флуконазол 32-256 >32 100% МПК=32 (2,5%) МПК=256 (97,5%)
Эхинокандины
Анидулафунгин 0,015-2 >4 0
Каспофунгин 0,06-1 >2 0
Микафунгин 0,06-1 >4 0
Флуоропиримидины
5-флуцитозин <0,06-0,12 н 0 -
* Ориентировочные пограничные значения МПК, предложенные CDC (США), н о - не определяли
Количество А , Анидулафунгин штаммов 50 39 I лп
30 20 Ю 2 3 7 0 - - в 1
15 1
В 5 5 „ '
Ü 11
ЛПК (мкг/мл)
Рис. 2. Распределение значений МПК анидулафунгина для изученных изолятов С. auris (п=80).
Количество штаммов
50 40 30 20 10 0
Каспофунгин
0 0
\? Ф ^ О & \ ^ N <ъ МПК (мкг/мл)
Рис. 3. Распределение значений МПК каспофунгина для изученных изолятов С. auris (п=80).
Количество штаммов
50 40 30 20 10 0
Мик'афунгин
39
|
20 1 А !
14 I В з
0 0 _ 1 0 0 0
^
МПК (мкг/мл)
\ t* <ъ
Рис. 4. Распределение значений МПК микафунгина для изученных изолятов С. auris (п=80).
Ahmad S. с соавторами описывали профиль чувствительности С. auris от пациентов (п=126) в различных больницах (п=8) Кувейта в течение 2014-2018 гг. Определение чувствительности проводили с помощью Е-теста. Устойчивость была выявлена к амфотерицину В - 27,1%, флуконазолу - 100%, во-риконазолу — 41,1% и микафунгину — 1,7% Изоляты, устойчивые к флуконазолу, содержали мутацию Y132F или K143R в ERG11. Изоляты с мутацией K143R были дополнительно устойчивы к ворикона-золу. Изоляты, устойчивые к микафунгину, содержали мутацию S639F в FKS1 [15]. На основе моле-кулярно-генетических исследований показано, что у С. auris, как и в случае с С. albicans, устойчивость к флуконазолу и другим азолам опосредуется мутациями в гене ERG11 и потенциально усиливается сверхэкспрессией CDR1 [16, 17].
В систематическом обзоре с помощью метаана-лиза Sekyere J. и соавт. показали, что среди 742 изолятов С. auris 111 были устойчивы к амфотерину В
(15,46%) [18]. Эти данные коррелируют с полученными в настоящем исследовании.
В ряде публикаций отмечено, что примерно 40% изолятов С. auris могут быть устойчивы к двум классам противогрибковых препаратов, при этом имеется несколько сообщений о панрезистентных штаммах С. auris [19].
ВЫВОДЫ
1. Для предотвращения распространения С. auris в отделениях интенсивной терапии и реанимации необходимо идентифицировать изоляты Candida spp. надежными методами до вида из биосубстратов от
пациентов с СОУШ-19 и объектов окружающей среды.
2. Клинические изоляты С. аит, выделенные от пациентов с коронавирусной инфекцией в Санкт-Петербурге, в 100% устойчивы к флуконазолу, 12% штаммов резистентны к двум противогрибковым препаратам (флуконазолу и амфотерицину В).
3. Все исследованные изоляты С. аит чувствительны к эхинокандинам, что позволяет использовать этот класс противогрибковых препаратов в качестве первой линии терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Satoh К., Makimura К., Hasumi Y., el al. Candida auris sp. nov., a novel ascomycetous yeast isolated from the external ear canal of an inpatient in a Japanese hospital. Microbiol. Immunol. 2009; 53: 41-44. doi.org/10.1111/j. 1348-0421.2008.00083.x
2. CDC Tracking Candida auris. Centers for Disease Control and Prevention; Atlanta, GA, USA. https://www.cdc.gov/fimgal/candida-auris/tracking-c-auris.html [accessed 15 Sep 2021]; 2021.
3. Lockhart S.R., Etienne K.A., Vallabhaneni S., et al. Simultaneous emergence of multidrug-resistant Candida auris on 3 continents confirmed by whole-genome sequencing and epidemiological analyses. Clin. Infect. Dis. 2017; 15;64(2):134-140. doi: 10.1093/cid/ciw691.
4. De Jong A. W., Dieleman C., Carbia M , el al. Performance of two novel chromogenic media for the identification of multidrug-resistant Candida auris compared with other commercially available formulations. J. Clin. Microbiol. 2021; 59. doi.org/10.1128/JCM.03220-20
5. Ambaraghassi G., Dufresne P.J., Dufresne S.F., et al. Identification of Candida auris by use of the Updated Vitek 2 Yeast Identification System, Version 8.01: A multilaboratory evaluation study. J. Clin. Microbiol. 2019; 57: 00884-19. doi.org/10.1128/JCM.00884-19
6. https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/identification.html
7. Villanueva-Lozano H., et al. Outbreak of Candida auris infection in a COVID-19 hospital in Mexico. Clinical Microbiology and Infection. 2021; 27 (5): 813-816. doi.org/10.1016/j.cmi.2020.12.030
8. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases (NCE-ZID), Division of Foodborne, Waterborne, and Environmental Diseases (DFWED) https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-antifimgal.html
9. Chowdhary A., et al. Multidrug-resistant Candida auris infections in critically ill coronavirus disease patients, India, April-July 2020. Emerging Infectious Diseases. 2020; 26 (11):2694-2696. doi: 10.3201/eid2611.203504
10. Antifungal Susceptibility Testing and Interpretation https://www.cdc.gov/fimgal/candida-auris/c-auris-antifiingal.html
11. Приказ Минздрава России от 24.12.2020 N 1366 «Об утверждении перечня референс-центров по отдельным видам медицинской деятельности в целях обеспечения системного мониторинга распространения антимикробной резистентности» [Order of the Ministry of Health of the Russian Federation dated 12/24/2020 No. 1366 "On approval of the list of reference centers for specific types of medical activities in order to ensure systematic monitoring of the spread of antimicrobial resistance" (In Russ)].
12.Payui E.P. Особенности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб.: СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2015. - 22 с. [Rausch E.R. Features of nosocomial invasive candidiasis causative agents: Abstract of the MD dissertation. St. Petersburg: SZGMU n.a. I.I. Mechnikov, 2015. - 22 p. (In Russ.)].
13. Sayeed M.A., Farooqi, J., Jabeen, K., et al. Clinical spectrum and factors impacting outcome of Candida auris: A single center study from Pakistan. BMC Infect. Dis. 2019;19:384. doi.org/10.1186/s 12879-019-3999-y
14. Bradley S.F. What is known about Candida auris. JAMA. 2019; 322: 1510. doi.org/10.1001/jama.2019.13843
15. Ahmad S., Khan Z, Al-Sweih N., et al. Candida auris in various hospitals across Kuwait and their susceptibility and molecular basis of resistance to antifungal drugs. Mycoses. 2020; 63: 104-112. doi.org/10.1111/myc.13022
16. Healey K.R., Kordalewska M, Jimenez Ortigosa ('., et al. Limited ERG11 mutations identified in isolates of Candida auris directly contribute to reduced azole susceptibility. Antimicrob. Agents Chemother. 2018; 62:e01427-18. doi.org/10.1128/AAC.01427-18
17. Rybak J.M., et al. Abrogation of triazole resistance upon deletion of CDR1 in a clinical isolate of Candida auris. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2019; 63 (4): e00057-19. doi.org/10.1 128/AAC.00057-19
18. Osei Sekyere J. Candida auris: A systematic review and meta-analysis of current updates on an emerging multidrug-resistant pathogen. Miocrobiologyopen. 2018; 7: e00578. doi.org/10.1002/mbo3.578
19. Shawn R. Lockhart, Kizee., et al. Simultaneous emergence of multidrug-resistant Candida auris on 3 continents confirmed by whole-genome sequencing and epidemiological analyses. Clinical Infectious Diseases. 2017; 64 (2): 134-140. doi.org/10.1093/cid/ciw691
Поступила в редакцию журнала 26.11.2021 Рецензент: Н.Н. Климко
