CC BY
80
новых полипептидов, начинающимся с первых часов набухания зерна.
Характер качественных и количественных изменений в полипептидном составе прорастающих семян тритикале, ржи и пшеницы свидетельствует, что на начальных стадиях прорастания в перву ю очередь происходит катаболизм белков зародышей, как это было установлено ранее для семян бобовых: вигны (Vigna unguiculataL.) [6], маша (Phaseolus aureusL.) [7] и гороха (Pisum sativum L.) [8, 9]. Мобилизация запасных белков эндосперма семян тритикале, как и бобовых растений, происходила значительно позже.
ВЫВОДЫ
1. Оптимальная температура прорастания зерна тритикале - 28°С, а зерна ржи и пшеницы - 20° С. Скорость прорастания тритикале при оптимальной температуре совпадает со скоростью прорастания пшеницы и сильно отличается от скорости прорастания ржи.
2. Начальный рост зародышей пшеницы, ржи и тритикале происходит на фоне снижения многих белковых компонентов, поэтому белки зародышей можно отнести к белкам, выполняющим функцию запасных отложений для использования клетками в период набухания и лаг-фазы прорастания до начала потребления запасных белков эндосперма.
3. При набухании зерна тритикале при 37°С изменений в составе белков зародыша не наблюдалось. Это может быть связано с блокировкой ферментативных систем и являться причиной низкого прорастания семян при повышенной температуре.
4. В компонентном составе белков эндосперма тритикале количественные и качественные изменения при прорастании обнаруживаются позже, чем в белках зародышей, что, вероятно, обусловлено тем, что распад
запасных белков эндосперма компенсируется синтезом новых полипептидов в первые часы набухания.
5. Полученные данные о механизме мобилизации белков при прорастании создают возможности управления функциональными свойствами белков при разработке технологических процессов производства пищевых белковых продуктов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bewley J.D. Seed germination and dormancy // The Plant Cell. - 1997. - 9. - P. 1056-1057.
2. Bewley J.D., Black M. Seeds: Physiology of Development and Germination. - N.Y., London: Plenum Press, 1994. - P. 262-264.
3. Matsuo T., Kumazawa K., Ishii R., Ishihara K., Hirata
H. (Ed.). Science of the rice plant. Volume Two. Physiology, Food and Agriculture Policy Research Center. - Tokyo, 1995. - P. 40-45.
4. Скаженник М.А., Куваева Е.Б., Гумилевская Н.А., Кретович В.Л. Электрофоретический анализ компонентного состава суммарного белка семядолей семян гороха // Прикл. биохим. и микробиол. - 1981. - 17. - С. 918-926.
5. Bramhall S., Noack N., Wu M., Loewenberg, J.R. A simple colorimetric method for determination of protein // Analyt. Biochem. - 1969. - 31. - P. 146-148.
6. Minamicava T. Metabolic changes in axes of germinating Vigna unguiculata seeds as related to effects of removal of cotyledons // Plant and Cell Physiol. - 1983. - 24. - P. 1361.
7. Manickam A., Carlier A.R. Isolation and function of low molecular weight protein of mung bean embryonic axis // Planta. - 1980. - 149. - P. 234-240.
8. Гумилевская Н.А., Чумикина Л .В., Арабова Л.И., Зимин М .В. Действие теплового шока на мобилизацию белковых отложений в осевых органах набухающих зародышей гороха Pisum sativum L. // Физиол. растений. - 1993. - 40. - С. 110-115.
9. Murray D.R. Axis-Cotyledon relationships during reserve mobilization // Seed Physiology, Ed. Murrey D.R., Sydney, Acad. Press. -1984. - 2. - P. 247.
Кафедра органической химии
Поступила 30.04.04 г.
664.641.2.66.093.8
КИНЕТИКА ГИДРОЛИЗА СОЕВОЙ ОБЕЗЖИРЕННОЙ МУКИ ФЕРМЕНТНЫМ ПРЕПАРА ТОМ БИРЗИМ П7
С.Е. ТРАУБЕНБЕРГ, И.В. ВЯЛЬЦЕВА, Е.В. МИЛОРАДОВА, А.А. КОЗЛОВА
Московский государственный университет пищевых производств
Создание технологий производства белковосодер-жащих продуктов из растительного сырья, в частности сои, - одно из основных направлений увеличения ресурсов продовольственного сырья [1]. В промышленно развитых странах, таких как США, Япония, Бельгия, Дания, накоплен значительный опыт по переработке сои с получением соевых белков и различных продуктов на их основе [2].
Для российской пищевой промышленности большой интерес представляют продукты из соевого шрота: изоляты, концентраты, текстурированные белки и гидролизаты. Известно, что продукты, полученные из сои, имеют много областей применения, так как обла-
дают необходимыми в комбинированных продуктах функциональными свойствами при меньшей стоимости по сравнению с альтернативными добавками животного происхождения, такими как сухое молоко, казеин, яичные желтки и др. [3].
В МГУПП на протяжении нескольких лет ведется работа по получению гидролизатов из соевой муки путем использования ферментных препаратов комплексного действия [4]. В настоящее время появилось большое количество протеолитических ферментных препаратов микробного происхождения, которые различаются по субстратной специфичности, избирательности действия на пептидные связи, а также по оптимальным условиям, влияющим на скорость ферментативной реакции [5].
Цель настоящей работы - получение гидролизатов из соевой обезжиренной муки с использованием ферментного препарата нового поколения немецкой фирмы Erbsloh Бирзим П7, который получают из специально отобранного штамма Bacillus Subtilis. Основная активность препарата обусловлена действием протеиназ (ЕС 3.4.24.4) и составляет 20 ед. ПС/мл. Он также обладает незначительными a-амилазной и b-глюканазной активностями. Бирзим П7 допущен к применению в соответствии с ныне действующими законодательными нормами.
Ферментный препарат Бирзим П7 является нейтральной бактериальной протеиназой и широко используется для гидролиза белковых веществ в процессе получения пивного сусла с использованием несоло-женного зерна. Известно, что он разрушает белковые вещества зернового сырья и переводит их в растворимое состояние, а также обогащает сусло аминокислотами, необходимыми для питания дрожжей.
При проведении исследований в качестве субстрата использовали обезжиренную лецитированную термически обработанную соевую муку (СОПРОЛЕЦ -8-ТБ-325) со степенью измельчения 0,045 мм, полученную из отборных экологически чистых и генетически не модифицированных очищенных соевых бобов, выращенных в Югославии (подтверждено Научным институтом Земледелия и овощеводства, Нови Сад, Югославия, 2002 г.). СОПРОЛЕЦ-8-ТБ-325 характеризуется повышенной эмульгирующей, структурирующей, стабилизирующей, влаго- и жиросвязывающими способностями и антиокислительным действием из-за высокого содержания токоферола (витамина Е).
Для изучения возможности применения данного ферментного препарата для гидролиза соевой обезжиренной муки выбрали как метод исследований кинетику ферментативных реакций, подходы и принципы которого позволяют работать и косвенно оценивать неочищенные ферментные препараты [6].
Ферментативная кинетика включает в себя изучение зависимостей скорости ферментативных реакций от природы реагирующих веществ (субстрат и фермент) и от условий их взаимодействия (температура, рН, концентрация компонентов, присутствие активаторов, ингибиторов и др.). Известно, что одним из основных факторов, влияющих на активность ферментов, является температура и реакция среды. С повышением температуры до определенного предела скорость ферментативной реакции возрастает, а при дальнейшем повышении температуры, хотя и происходит нарастание скорости, однако температурный коэффициент уменьшается, что свидетельствует о начинающемся процессе разрушения фермента. Наконец, при достижении определенной температуры наблюдается быстрое уменьшение скорости реакции, так как наступает инактивация фермента. Поэтому оптимальной температурой считают ту, при которой повышение скорости ферментативной реакции совпадает с началом разрушения фермента [7].
При выборе экспериментальных условий протео-литическую активность ферментного препарата Бирзим П7 определяли стандартным методом [8].
Исследование зависимости протеолитической активности препарата от температуры показало, что он достаточно активен в интервале 40-50°С, а при повышении температуры до 60°С происходит полная инактивация протеазы, что может быть связано с денатурацией белковой молекулы.
Известно, что каждый ферментный белок в определенном интервале рН имеет нативную конформацию молекулы и стабилен. При других значениях рН среды возможна денатурация нативного белка, которая ведет к потере ферментативной активности. Следовательно, реакция среды также является важным фактором, влияющим на активность фермента. Исследования показали, что максимальное проявление ферментативной активности препарата Бирзим П7 происходит в диапазоне рН от 6 до 8.
С целью характеристики исследуемого препарата и обоснования его применения для гидролиза соевой муки была изучена кинетика его действия на белок соевой муки.
При выборе экспериментальных условий необходимо было определить такую область концентраций фермента, при которых сохраняется прямо пропорциональная зависимость между количеством фермента и наблюдаемой скоростью реакции. Для этого была изучена скорость реакции гидролиза белка соевой муки в зависимости от дозировки ферментного препарата Бирзим П7. Гидролиз соевой муки в концентрации 100 мг/мл при рН 6,3, температуре 45°С проводили в присутствии ферментного препарата Бирзим П7 в течение 2 ч. Препарат вносили в количествах от 0,1 до 2,0 ед. ПС/г муки. Через определенные промежутки времени методом формольного титрования определяли содержание аминного азота в полученных гидролизатах [9]. Скорости гидролиза рассчитывали по тангенсу угла наклона касательных, проведенных к кинетическим кривым в начальный период реакции, когда сохраняется линейная зависимость между количеством продуктов реакции и ее продолжительностью.
Для определения концентрации ферментного препарата, при которой имеет место прямо пропорциональная зависимость между количеством добавляемого препарата и начальной скоростью реакции, был построен график Vo = f (£). Результаты показали, что линейная зависимость между начальной скоростью реакции и дозировкой ферментного препарата Бирзим П7 сохраняется при концентрациях меньших Е = 0,5 ед ПС/г муки. При повышении концентрации ферментного препарата прямая зависимость нарушается и скорость реакции возрастает нелинейно. Наиболее вероятной причиной является нехватка субстрата при возросших концентрациях фермента. Некоторые авторы указывают и другие возможные причины торможения скорости реакции по мере возрастания концентрации фермента: агрегация молекулы белка, приводящей к маскированию активных центров, недостаток активатора в системе и др. [6].
Рис. 1
Рис. 2
Рис. 3
Не менее важным условием проведения процесса гидролиза является выбор оптимальной концентрации суспензии соевой обезжиренной муки. Для этого определяли начальные скорости реакций гидролиза субстрата при различных его концентрациях: от 15 до 150 мг/мл. Ферментный препарат вносили в оптималь -ной дозировке - 0,5 ед. ПС/г муки. Г идролиз проводили при оптимальных рН и температуре в течение 2 ч. Через заданные промежутки времени отбирали пробы для определения аминного азота. По полученным данным были построены кинетические кривые (рис. 1: концентрация субстрата, мг/мл: 1 - 15, 2 - 50, 3 - 100, 4 - 150).
Анализ кинетических кривых показал, что увеличение концентрации субстрата до 100 мг/мл приводит к увеличению начальной скорости реакции. При концен-
трациях 100 и 150 мг/мл скорости практически равны (рис. 2). Можно предположить, что концентрации субстрата до 100 мг/мл являются насыщающими, а начальная скорость приближается к максимальной скорости ферментативной реакции, полученной при насыщающих концентрациях субстрата [6].
После определения условий получения максималь -ной скорости реакции гидролиза для дальнейшего использования гидролизатов целесообразно было изучить условия максимального накопления аминного азота. Для этого исследовали динамику накопления аминного азота в условиях максимальной скорости гидролиза соевой муки: концентрация ферментного препарата Бирзим П7 0,5 ед. ПС/г муки; концентрация субстрата 100 мг/мл; рН 6,3; температура 45°С, длительность 12 ч. Установлено, что при выбранных условиях наибольшее накопление аминного азота наблюдается в первые 8 ч гидролиза и составляет 1200 мг% (рис. 3). Дальнейшее продолжение гидролиза нецелесообразно.
Таким образом, кинетика ферментативных реакций как метод исследования показал возможность использования нового ферментного препарата Бирзим П7 для гидролиза белковой части соевой обезжиренной муки. Подобраны оптимальные условия действия ферментного препарата, при которых достигается максимальная скорость накопления наибольшего количества аминного азота в гидролизатах. Качественный и количественный анализы аминокислотного состава полученных гидролизатов позволяют прогнозировать успешное их применение как добавки, обладающей определенными функциональными свойствами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Растительный белок: новые перспективы (Производство и использование пищевых растительных белков).- М.: Пи -щепромиздат, 2000. - 179 с.
2. Soy protein products, Soy Protein Council, Washington, DC, 1987.
3. Доморощенкова М.Л., Струпакова Л.Ф., Стойкова В.Я., Ключкин В.В. Использование ферментативной обработки для повышения биологической ценности растительных белков // 2-я Всерос. науч.-техн конф. «Прогресс. Экология. Безопасность. Тех -нология. Хранение и комплексная переработка сельхозпродукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологи -ческой ценности», Углич, 1-4 октября, 1996: Тез. докл. Ч. 1. - Углич, 1996. - С. 151-152.
4. Траубенберг С.Е., Пивцаева М.М., Милорадова Е.В., Фуголь О.А. Получение и применение ферментативных соевых гид -ролизатов // Тез. докл. Междунар. конф. «Научно -технический про -гресс в перерабатывающих отраслях АПК». - М., 1995. - С. 151.
5. Римарева Л.В. Эффективный ферментный препарат для протеолиза растительного сырья // Хранение и переработка сельхозсырья. - 1995. - № 6. - С. 40.
6. Петушкова Е.В. Введение в кинетику ферментативных реакций. - М.: МГУ, 1972. - С. 200.
7. Биологическая химия ферментативного катализа / М. Бендер, Р. Бергерон и др. - М.: Мир, 1987. - С. 352.
8. Полыгина Г .В., Чередниченко В.С., Римарева Л. В. Определение активности ферментов. - М., 2003. - С. 225-229.
9. Практикум по биохимии пищевого растительного сырья. - М.: Пищевая пром-сть, 1965. - С. 330.
Кафедра аналитической химии
Поступила 30.12.04 г.
