CC BY
70
КИНЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ
Перевозкина Маргарита Геннадьевна
канд. хим. наук, старший преподаватель Государственного аграрного
университета Северного Зауралья, г. Тюмень E-mail: m gp ere vozkin a @m a il. ru
KINETIC MODELS FOR TESTING OF ANTIOXIDANTS
Margarita G. Perevozkina
candidate of Science, Senior Lecturer, Department of State Agrarian University of
North Zauralye, Tyumen
АННОТАЦИЯ
Разработана кинетическая модель экспресс-тестирования антиоксидантной активности (АОА) различных классов органических соединений в условиях, приближенных к условиям биологической среды. Показано, что скорость окисления модельных липидов в водно -эмульсионной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. Исследована АОА важнейших органических ингибиторов в сравнении со стандартными антиоксидантами дибунолом и а-токоферолом в водно-липидных катализируемых субстратах. Установлены константы скорости реакции k7 с пероксильными радикалами для наиболее активных АО.
ABSTRACT
Developed kinetic model lipid rapid testing antioxidant activity (AOA) of various classes of organic compounds. The rate of oxidation of lipids in model wateremulsion medium is 1000 times higher than in non-aqueous medium. Investigated AOA important organic inhibitors compared with standard antioxidants dibunol and a-tocopherol the water-catalyzed lipid substrates. Set the rate constant of k7 with peroxyl radicals for the most active AO. The participation of effective inhibitors of oxidation in the process of destruction by molecular hydroperoxides.
Ключевые слова: каталитическое окисление липидов, экспресс -тестирование антиоксидантной активности, пероксидное окисление, соли металлов переменной валентности, мицеллы, водно -эмульсионная среда.
Keywords: catalytic oxidation of lipids, rapid testing antioxidant activity, lipid oxidation, salts of metals of variable valency, micelles, water-emulsion environment.
В связи с широким внедрением ингибиторов окисления, актуальной остается проблема предварительного тестирования их антиоксидантной активности. Поскольку большинство известных моделей для тестирования антиоксидантов являются гидрофобными, представлялось актуальным подобрать гидрофильную липидную систему и проверить её эффективность на примере известных химических соединений, предположительно имеющих антиоксидантную активность, сравнить их действие с реперными ингибиторами окисления.
Известно, что катионы металлов входят в структуру биокластеров, активных центров многочисленных белков-ферментов. Так, железо входит в состав гемоглобина, цитохромов, каталазы, содержится в ферритине, трансферрине. Кобальт входит в состав цианокобаламина (витамина В12), его аналоги являются кофакторами различных ферментов, участвующих в эритропоэзе. Медь содержится в цитохроме-С-оксидазе, в голубых белках, супероксиддисмутазе [2].
Особенности окисления липидов в клетке обусловлены, прежде всего, каталитической активностью катионов металлов и возможностью участия ферментов в регулировании этих процессов. Известны многочисленные работы по тестированию активности катионов металлов, которые относятся, в основном, к катализу гомогенных липидных систем [1, 13—19]. Эти результаты имеют ограниченное значение для описания процессов окисления, протекающих в мицеллах и живой клетке. Мало работ, в которых сравниваются антиоксидантные свойства соединений различных классов в безводной и водно-эмульсионной (ВЭС) средах в условиях инициирования и катализа.
Целью данного исследования являлась разработка кинетического способа тестирования антиоксидантной активности различных классов органических соединений (фенолов, аминов, серосодержащих соединений), в условиях,
приближенных к биологическим средам, изучение антиоксидантной активности ряда полифункциональных соединений в сравнении с реперными антиоксидантами дибунолом и а-токоферолом.
Экспериментальная часть
Антиоксидантную активность (АОА) изучали манометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга при окислении модельного субстрата (метиллинолеата (МЛ), метилолеата (МО) и этилолеата (ЭО)) в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в
4 2
качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) (10- —10" М), с добавками растворов солей металлов в количестве (10-6—10-1 М) при 1=(60±0,2)0С. Соотношение воды и эфира составляло 3:1, а общий объем пробы 4 мл [10]. Кинетику поглощения кислорода в безводной среде изучали в среде инертного растворителя хлорбензола, процесс инициировали за счет термического разложения АИБН. Использовали термостатируемую окислительную ячейку объёмом 2—5 см3, окисление проводили кислородом воздуха, температура опытов составляла (60±0,2)0С. Графическим методом определяли величину периода индукции (ц), представляющей собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром, опущенным из точки пересечения касательных, проведенных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяется совокупностью реакций ингибитора и обозначает его антиоксидантную активность, количественно определяемой по формуле АОА= /т^ где т^ и т, — периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно, сравнивали с действием ингибитора, принятого за стандарт, используя отношение / трси где треп. — период индукции реперного ингибитора. Скорость инициирования определяли уравнением \¥1= f [1пН] / т„ где f — стехиометрический коэффициент ингибирования, [1пН] — концентрация ингибитора, т, — период индукции.
Антирадикальную активность (АРА) тестировали в системе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным (ХЛ) методом
совместно с к.х.н. И.Ф. Русиной [9]. Кинетику накопления гидропероксидов изучали при аутоокислении модельных субстратов (МО и линолевой кислоты (ЛК)) методом обратного йодометрического титрования в среде хлорбензола, 1=60°С [6]. В качестве реперных ингибиторов использовали а-токоферол (а-ТФ) и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми. Критическую концентрацию мицеллообразования ЦТМАБ изучали методом Ребиндера и рефрактометрическим методом.
Результаты и их обсуждение
Разработка кинетического метода базировалась на исследовании активности солей металлов переменной валентности: сульфата железа (II), хлорида железа (III), хлорида никеля (II), хлорида кобальта (II), хлорида меди (II) в водно-липидных субстратах. Для эмульгирования модельного субстрата использовали поверхностно -активное соединение ЦТМАБ, в качестве липидов исследованы: метилолеат, этилолеат, метиллинолеат, линолевая кислота. С целью выбора наиболее эффективного катализатора изучали в сравнительном аспекте влияние упомянутых выше солей на процесс окисления МЛ. Более детальное изучение кинетики окисления липидных субстратов в присутствии металлов переменной валентности было показано раннее в работе [10].
На рисунке 1 представлены кинетические кривые (КК) поглощения
_о
кислорода в присутствии равных добавок (1x10 М) солей железа (ПДП), никеля (II), кобальта (II) и меди (II). Из рис. 1 видно, что в сравнимых концентрациях наиболее эффективным катализатором является хлорид меди (II). Для него отмечается наибольшая скорость процесса, оцениваемая из наклона кинетических кривых (КК). При сопоставлении абсолютных значений максимальной скорости окисления ^^ исследуемые катализаторы располагаются в следующем порядке: МС12 < FeClз < Fe2SO4 < СоС12 < СиС12.
t, мин
Рисунок 1. Кинетика окисления МЛ в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок солей металлов в концентрации IxlO'3 M : 1 — CuCl2, 2 — FeS04, 3 — CoCl2, 4 — FeCl3, 5 — NiCl2, 1 xlO'3 M СЦТМАБ, t=60 ° С
В результате исследований установлено, что аутоускоренный характер имеет кинетика окисления водно-липидных субстратов только в присутствии катионов Fe2+, Со2+ и Си2+. Характер кинетических кривых окисления липидных субстратов в зависимости от концентрации катионов позволил предполагать преобладающее участие Fe3+ , Ni2+ в обрыве цепей, участие Fe2+, Со2+, Си2+ в зарождении и разветвлении цепей.
о
х
ю ■
о
X
го
25
20
™ ист
о 15
10
10
12
с(Ме),ю-3 м
Рисунок 2. Зависимость стационарных скоростей окисления МЛ в присутствии солей катализаторов от их концентрации, М:1 — МС12, 2
ГеС1з, 3 — Ее28О4, 4 — СоС12, 5 — СиС12, 1*10'3 М СЦТМАБ, 1=60 ° С
Действие упомянутых выше солей было изучено в широком диапазоне концентраций для отбора среди них наиболее эффективных катализаторов. На рисунке 2 приведены закономерности изменения максимальной скорости процесса окисления от концентрации катализатора. Можно видеть, что концентрационные зависимости для всех веществ носят экстремальный характер, экстремумы проявляются в разных диапазонах.
Скорости окисления липидных субстратов в присутствии солей N1012 и БеСГз выходят на максимум при концентрациях 1,0*10" М, далее с ростом концентрации их значение не меняется и составляет (4,0±0,2)*10 М*с и (5,0±0,3)*10 М*с соответственно. Максимальная скорость при окислении с добавками сульфата железа отмечается в диапазоне (0,1—1,0) М и составляет (9,4±0,4)*10"5 М*спри дальнейшем росте концентрации — остается
5
0
0
2
4
6
8
постоянной и составляет (6,0±0,2)х10 Мхс . Зависимость Wmax систем с
-3
добавками хлорида кобальта имеет "пик" при концентрации (9—11)х10 М, при которой ее величина составляет (24,4±0,4)х10 5 Мхс \ Хлорид меди по своим каталитическим свойствам выделяется среди всех исследуемых веществ. Скорость окисления в присутствии хлорида меди выше в 5 раз, чем в присутствии других солей металлов переменной валентности и при
3 5 1
концентрации 2x10 М составляет (26,3±0,3)х10 Мхс (табл.1).
Таблица 1.
Кинетические параметры окисления метиллинолеата в присутствии солей железа (II,Ш), никеля (II), кобальта (II) и меди (П) в ВЭС, 1= 60°С, С щмаб
= 1x10 3 М, вода:липиды - 3:1
Катализатор №2+ Со2+ Си2+ Ре3+ №2+ Со2+ Си2+
[Кат.],М 2x10~3 1х10~3
[Кат.]/[МЛ] 1 : 50 1 : 100
\¥начх10"э, Мхс"1 6,8 1,7 2,4 14,2 14,4 6,8 2,3 3,5 11,4 8,6
\¥тах.х10°, Мхс"1 6,1 3,5 3,2 7,3 26,3 5,9 3,2 4,1 6,8 14,5
В нашем эксперименте каталитическая активность солей металлов уменьшается в ряду: Си2+ > Бе2+ > Бе 3+ > Со2+> №2+. Ранее каталитическое действие металлов переменной валентности изучалось при окислении растительных масел и модельных липидных субстратов [13, 14, 2, 16, 17—19]. Был получен ряд каталитической активности катионов : Си2+ > Мп2+ > Ре2+ > Сг2+ > №2+ » 7лл~+. Как видно из приведенных выше данных изученные соли вписываются в указанный ряд активности металлов, а хлорид меди обладает наибольшей каталитической активностью при наименьшей концентрации 2x10" 3 М.
Следующим этапом создания модели для тестирования антиоксидантов был выбор концентрации ЦТМАБ. Известно [4, 5], что скорость окисления в гомогенных системах ниже, чем в эмульсиях и зависит от степени ее дисперсности. В работе [2] установлено, что соотношение констант скорости
роста и обрыва цепи при инициированном окисление кумола в эмульсиях и гомогенной системе соотносится как 5,5:1 и равно 110 и 20 соответственно.
Нами также было установлено, что скорость окисления МЛ в водно -эмульсионной среде ~ в 1000 раз выше, чем в безводной среде.
При выборе оптимальной концентрации ЦТМАБ исследовали диапазон (10~4—10~2) М. Установлено, что с ростом концентраций ПАВ скорость процесса проходит через максимум, соответствующий концентрации 1 х 10 М. Дальнейшее повышение концентрации ЦТМАБ приводит к снижению скорости окисления. Указанную концентрацию детергента, обеспечивающую наибольшую скорость реакции, можно рекомендовать для использования в гетерогенных моделях окисления. Методом Ребиндера и рефрактометрическим методом была определена критическая концентрация мицеллообразования ЦТМАБ (1,0±0,2) х 10 М, что соответствовало кинетическим данным.
Механизм каталитического окисления липидов в водно -эмульсионной среде сводится к следующему: в присутствии ЦТМАБ формируются мицеллы. Добавки катионного ПАВ усиливают мицеллообразование, при этом катионы внедряются в промежутки между углеводородными «хвостами» и образуют двойной электрический слой. При образовании свободных радикалов высших жирных кислот катионы катализатора должны иметь доступ к гидрофобным хвостам субстрата. При низких концентрациях катионы катализатора имеют большую вероятность донорно -акцепторного взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов по реакции:
Ме(п+1)+ + р>н + о2-> Меп+ + Я0 + Н+
Вероятно, существуют оптимальные концентрации ЦТМАБ, при которых количество контактов катиона катализатора, липидов и кислорода максимально. При увеличении концентрации ЦТМАБ количество катионов на поверхности мицеллы возрастает, происходит более интенсивное отталкивание
катионов катализатора, снижение скорости зарождения цепей и скорости процесса окисления.
_о
В соответствии с приведенной гипотезой, добавки 1* 10"д М ЦГМАБ являются оптимальными, обеспечивающими максимальный контакт катионов меди и кислорода с жирно -кислотными радикалами. Увеличение концентрации ПАВ снижает количество таких контактов, и скорость процесса соответственно.
Механизм действия металлов связывают с каталитическим разрушением гидропероксидов в соответствии с реакциями [4]:
ЯООН + Ге3+-> БЮ2° + РГ + Бе2+
ЯООН + Си +-> БЮ/ + РГ + Си1+
ЯООН + Бе2+-> БЮ2° + Н^ + Ге3+
Образующиеся при этом алкоксильные и пероксильные радикалы участвуют в дальнейшем в реакциях продолжения цепей окисления. Катионы металлов могут конкурентно участвовать в обрыве цепей, что должно приводить к замедлению процесса на глубоких стадиях окисления. Замедление процесса возможно также за счет перехода катиона металла в менее активную форму.
Таким образом, результаты настоящего исследования демонстрируют возможности новой кинетической модели, которая может быть предложена для изучения процессов свободно-радикального окисления липидных субстратов различного происхождения.
Подобные закономерности наблюдаются и при окислении этилолеата и метилолеата.
На основе проведенных исследований была предложена новая кинетическая модель для тестирования биоантиоксидантов. Модельный субстрат содержит 2* хлорида меди (II), 1 * 10~3 М ЦГМАБ, липиды (МО,
ЭО, МЛ) и воду, соотношение липиды -вода 1 : 3.
В настоящем работе приведены результаты исследования кинетики каталитического окисления липидного субстрата в водно -эмульсионной среде в присутствии ряда полифункциональных соединения в зависимости от концентрации и структуры, без учета спектра их фармакологического действия. Ряд производных фенола составили: салициловая кислота, парацетамол, осалмид. Ряд двухатомных фенолов представляли: пирокатехин, адреналин, метилдофа. В качестве гетероциклических производных использовались: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. В качестве аминов исследовали: новокаин, коринфар. В качестве серосодержащего соединения изучали капотен. Реперными АО послужили а-токоферол и дибунол. Химические формулы изучаемых соединений представлены в табл. 2.
Для доказательства свободно -радикального механизма каталитического окисления липидного субстрата использован метод ингибиторов. Проведено исследование закономерностей окисления модельного субстрата (МЛ, ЭО) в присутствии добавок стационарных ингибиторов окисления дибунола и а-токоферола. По результатам эксперимента рассчитаны кинетические параметры окисления субстратов.
В нашем исследовании показан идентичный характер КК окисления ЭО в
_о
растворе хлорбензола в присутствии 6* КГ'М инициатора и водно -эмульсионной системе в присутствии 2x10 М хлорида меди при разных концентрациях дибунола (Рис. 3 а. б). Показано, что в водно -эмульсионной среде дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола. Наличие торможения в присутствии добавок дибунола является признаком радикально-цепного механизма процесса. По наклону прямой в координатах х,[1пН] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах (Рис.4), получены значения 6,2х10~8 и 6,7*
10"э Мх с- в безводной и водно -эмульсионной системе соответственно. Сравнение максимальных скоростей окисления ЭО при 1=(60 ± 0,2)°С в
—7 —4 1
безводной и водно-эмульсионной средах равных 1,3x10 и 1,4x10 Мхе" соответствует различию скоростей инициирования ~ в 1000 раз.
1, мин
Рисунок 3 а. Кинетика окисления этилолеата в безводной среде в присутствии добавок дибунола, М: 1 — контроль, 6х10'3 М АИБН; 2 — 5x7О'6,3 — 1x10"5, 4— 5х10'5, 5 — 1 х7О'4, 6 — 5x7О'4, 7— 7,5x7(Г4, 8—1x10'3,
(=60° С
Было показано, что реперный биоантиоксидант а-токоферол в ВЭС проявлял слабые антиоксидантные свойства, в концентрациях свыше 1х 10 М промотировал процесс окисление липидных субстратов (рис. 5, табл. 4). Полученные результаты указывают на более сложный механизм действия а-токоферола в катализируемом субстрате. Причиной ускорения процесса может быть комплексообразование ОН-группы а-токоферола с катализатором. В процессе окисления а-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы, способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (КИ):
+ ЯИ
+ 1пИ
1, мин
Рисунок 3 б. Кинетика окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде в
3 3 3
присутствии добавок дибунола, моль/дм : 1 — контроль, 2x10' моль/дм СиС12; 2 — 1x10'6, 3 — 2x10'5, 4 — 5x10'5, 5 —1x10^, 6 — 5x10^ 1=60 ° С
Поскольку известно [3, 8, 11, 12], что в углеводородной среде увеличение АРА фенолов происходит под влиянием электронодонорных заместителей, рассмотрим полученные ряды соединений в зависимости от структуры.
В соответствии с теорией, ингибиторы условно делятся на сильные и слабые. Сильные ингибиторы эффективно тормозят окисление, участвуя только в реакциях обрыва цепей. Кинетика такого процесса характеризуется периодом полного торможения, аутоускорением и достижением максимальной скорости. Слабые ингибиторы способны не только обрывать цепи, но из -за высокой активности своих радикалов, участвовать в реакциях продолжение цепей. Кинетика такого процесса характеризуется отсутствием периодом полного торможения, достаточно высокими начальными скоростями, аутоускорением на определенном уровне окисления, достижением максимальной скорости.
Алкилированные в пара- и орто-положения фенолы, двухатомные фенолы считаются сильными нигибиторами. Каждая алкильная или гидроксильная группа увеличивает АРА на определенную величину. Ингибитор тем эффективнее, чем меньше полярность и больше размер заместителя в пара-положении. В аминах заместители электронодоноры повышают их антирадикальную активность. В фенолах и аминах антирадикальная активность тем выше, чем ниже окислительно -восстановительный потенциал. Иногда амины оказывают ускоряющее действие, сто связано с увеличением скорости зарождения цепей за счет взаимодействия с гидропероксидами по радикальному механизму.
я к
700-,
600-
500-
400-
300-
200-
100-
2
10
САОхюЛм
Рисунок 4. Зависимости периода индукции от концентрации дибунола в
3 3
безводной среде в присутствии 6x10' моль/дм АИБН (1) и в водно-
3 3
эмульсионной среде в присутствии 2x10' моль/дм СиС12(2 ), 1=60 ° С
0
0
2
4
6
8
Методом хемилюминесценции в группе исследуемых соединений была оценена величина константы скорости реакции к7 АО с пероксильными радикалами [9]:
RO2• + 1пН-> ROOH + In• (7),
где: InH — ингибитор окисления, — радикал ингибитора, RO2•- пероксильный радикал.
Таблица 2.
Химические формулы изучаемых антиоксидантов
№ п/п
2
4
5
6
7
Название АО
Фенол
Салициловая кислота
Парацетамол (Пара-ацетамино-фенол)
Осалмид (Амид 1-(№4'-
гидрокси-фенил) салициловой кислоты)
Пирокатехин (1,2-ди-гидрокси-бензол)
Адреналин (1-(3' ,4'-дигидроксифенил)-2(N-метил)-аминоэтанол)
Метилдофа (2-амино-2-метил-3-(3' ,4'
-дигидрокси)-фенилпропановая кислота)
Формула
СИ — CO — ш Н^^си
OH
он
ын-,
НО-/(^)\—СН—С—СНз
соон
1
3
8
Фентоламин (2-[№пара-толил-Ы-(мета-оксифенил)-аминометил]-имидазолина гидрохлорид)
9
Аллопуринол (1,5-Дигидро-4Н-пиразоло [3,4-d]пиримидин-4-он)
10
Эмоксипин (3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридин)
11
Новокаин (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоат)
Ы{СН
12
13
Коринфар (2,6-диметил-4-(2Л-нитро-фенил)-1,4-дигидро-пиридин-3,5-дикарбоновой кислоты диметиловый эфир)
Капотен 1-[(2Б)]-3-меркапто-2-метилпропионил]-Ь-пролин
14
Дибунол (2,6-дитрет.бутил-4-метил-фенол)
он
СНз
15
а-Токоферол (2,5,7,8-тетраметил-2-(4,8,12-триметил-тридецил)-6-оксихроман)
СН3
но.
СН3
Н3С 1 С16Н33
_СН_
Стехиометрический фактор ингибирования f, показывающий количество свободных радикалов, реагирующих с молекулой ингибитора, приведен в табл. 3. При исследовании кинетики изменения интенсивности ХЛ в присутствии исследуемых соединений было установлено, что все АО оказывают ингибирующее действие на процесс окисления модельного субстрата. Показано, что наибольшую активность в реакции с пероксильными
радикалами проявляет осалмид (табл. 3), константа скорости реакции к7 которого обусловлена акцепторным характером заместителя в пара-положении, наличием тг-р-сопряжения между амино-группой и фенолом. АРА осалмида может складываться из активности двух гидроксильных групп, в парацетамоле донорный заместитель содержится в пара-положении. В салициловой кислоте антирадикальная активность может снижаться за счет акцепторного характера карбоксильной группы. Сравнение констант скорости реакции к7 исследуемых соединений и а-ТФ показывает, что основной природный АО более активен в реакции с пероксильными радикалами (практически в 360 раз). Однако, описанные выше закономерности изменения антирадикальной активности в соответствии с донорным или акцепторным характером заместителей далеко не однозначны.
Исследована кинетика окисления модельного субстрата в ВЭС с добавками фенола. Показано, что все концентрации фенола замедляют процесс окисления, снижая начальную и максимальную скорости пропорционально концентрации (рис. 5 табл. 4). Представленные результаты свидетельствуют о том, что в данной системе фенол является слабым ингибитором, но продукты его превращения участвуют в обрыве цепей.
Из литературы известно [12], что в этилбензоле при 1=60оС к7 для фенола и
3 5
пирокатехина равны 3/10 и 6/10 М/с соответственно. По результатам нашего исследования (табл.4) эффективность торможения при всех концентрациях пирокатехина существенно ниже, чем для подобных концентраций фенола. Очевидно, что причину такого различия нельзя объяснить структурой фенолов и следует связывать с влиянием активности катализатора. Пирокатехин существенно тормозит окисление ЭО только при концентрациях 1^10 Ми выше. При концентрации пирокатехина 1хЮ~4М происходит ускорение, а при его концентрации 1*10 М очень слабое замедление процесса (рис. 6). Вероятно, ускорение процесса обусловлено активацией катализатора за счет комплексообразования с солями меди. При концентрации пирокатехина 1x10 М его соотношение с катализатором составляет 5:1. В этих условиях
большая часть пирокатехина не задействована в комплексообразовании и проявляет антиоксидантную активность.
Таблица 3.
Значения константы скорости реакции АО с пероксильными радикалами К02° \¥г2,ЗхЮ 8 Мхе"1; САО= 1x10 3 М; 1=60°
№ Название к7х104, f
п/п Фенола М^хс1 I
1 Фенол 0,24 2,7
2 Салициловая кислота 0,23 2,0
3 Парацетамол 4,00 2,4
4 Осалмид 6,86 2,4
5 а-токоферол 360 2,0
6 Дибунол 1,40 2,0
АОА салициловой кислоты всегда ниже, чем у фенола и уменьшается с увеличением её концентрации. Такой характер влияния салициловой кислоты может быть обусловлен образованием салицилата меди.
Впервые АОА осалмида была показана в нашей работе [7]. Осалмид проявлял более высокую антиоксидантную активность, чем фенол. Установлено, что все исследуемые концентрации осалмида уменьшали начальную и максимальную скорости окисления в 5 раз по сравнению с контролем. Высокая эффективность торможения осалмида связана с участием в реакциях обрыва цепей. Во всем диапазоне изученных концентраций парацетамол снижал начальную и максимальную скорости окисления, по сравнению с контролем в 2—5 раз, проявляя высокую АОА, уступая только осалмиду (рис. 5, табл. 4).
го
о
сч
о >
<
1, мин
Рисунок 5. Кинетика окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок АО в концентрации 1x10' М: 1 — контроль; 2 — ос-токоферол; 3 — салициловая кислота; 4 — фенол; 5 — парацетамол; 6 —
осалмид; 2x10 3 М СиС/^бО ° С
Таблица 4.
Кинетические параметры окисления липидных субстратов в водно-
_ о
эмульсионной среде в присутствии 2x10 М СиС12 в зависимости от
концентрации АО, 1=60°С
№ с(ао )> Wнач.х10"5, ^^ах.хЮ"5,
п/п М мин. Мхс"1 Мхс-1
I Фенол
1 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
2 1x10-* 18 7,0 12,0
3 1хЮ"э 20 6,8 8,4
4 1хЮ"4 30 3,9 4,6
5 5х Ю"4 40 3,3 4,2
6 1x10"' 50 2,5 4,0
7 5x10"' 85 2,5 3,8
8 1хЮ"2 130 1,3 3,2
II Салициловая кислота
9 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
20
15
10
100
200
300
400
500
600
700
5
0
0
10 5х 10"э 18 6,4 13,0
11 1хЮ"4 22 3,6 7,7
12 5х Ю"4 30 4,0 7,2
13 1x10"' 35 5,1 11,9
14 5x10"' 40 3,8 6,7
15 1хЮ"2 40 3,6 6,5
III Парацетамол
16 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
17 5х Ю"э 15 7,3 13,7
18 1x10- 20 6,2 10,0
19 2х Ю"4 25 5,9 6,0
20 1x10"' 40 2,5 3,1
21 5x10"' 40 2,2 2,6
22 1хЮ"2 45 2,0 2,4
IV Осалмид
23 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
24 5х Ю"э 25 5,1 10
25 1хЮ"4 45 2,9 4,4
26 5хЮ"4 215 1,4 4,2
27 2x10"' 390 0,5 2,5
28 5x10"' 425 0,5 2,5
29 1хЮ"2 500 0,4 2,5
V Пирокатехин
30 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
31 5х Ю"э 10 10,1 14,0
32 1хЮ"4 9 12,0 17,3
33 5хЮ"4 50 8,3 15,1
34 1x10"' 70 5,1 14,2
35 5x10"' 90 2,2 15,2
36 1хЮ"2 120 1,9 16,8
V Адреналин
37 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
38 5х Ю"э 25 4,5 4,9
39 1хЮ"4 30 3,4 4,6
40 5хЮ"4 35 2,8 6,1
41 1x10"' 40 2,1 4,5
42 2x10"' 45 1,7 4,2
43 5x10"' 45 1,6 4,0
44 1хЮ"2 60 0,9 3,8
VI Метилдофа
45 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
46 5х 10"э 20 7,1 9,4
47 1хЮ"4 30 6,8 8,8
48 5х Ю"4 35 3,6 6,6
49 1x10"' 35 3,4 5,1
50 5x10"' 45 1,8 2,9
51 1хЮ"2 60 0,9 2,4
VII Фентоламин
52 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
53 5х 10"э 15 7,4 13,8
54 1x10- 15 7,4 13,7
55 1x10"' 20 6,8 13,8
56 5x10"' 20 6,8 13,2
57 1хЮ"2 55 6,1 13,4
58 5х Ю"2 65 5,7 13,3
59 1хЮ-1 70 5,2 13,1
VIII Аллопуринол
60 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
61 5х 10"э 30 3,8 11,5
62 1хЮ"4 50 3,7 5,3
63 5х Ю"4 60 3,6 5,0
64 1x10"' 70 3,5 5,5
65 2x10"' 70 3,0 5,5
66 5x10"' 75 2,9 5,5
67 1хЮ"2 80 2,6 5,6
IX Эмоксипин
68 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
69 5х Ю"э 30 3,4 5,1
70 1хЮ"4 40 2,1 4,3
71 5хЮ"4 45 1,5 3,7
72 1x10"' 55 1,0 3,5
73 2x10"' 60 0,9 3,4
74 5x10"' 70 0,8 3,2
75 1хЮ"2 90 0,7 2,6
X Новокаин
76 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
77 5х Ю"э 20 6,8 9,8
78 1хЮ"4 45 6,7 9,2
79 5хЮ"4 50 6,6 8,5
80 1x10"' 50 6,5 7,6
81 5x10"' 60 6,2 7,1
82 1хЮ"2 70 5,7 6,8
XI Коринфар
83 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
84 5х 10"э 21 6,8 10
85 1х10"4 26 4,9 7,0
86 5хЮ"4 37 4,3 5,0
87 1x10"' 50 3,9 5,0
88 5x10"' 90 2,5 4,3
89 1хЮ"2 100 1,4 2,5
XII Капотен
90 Контроль МЛ 5 14,4 26,3
91 1хЮ"ь 8 7,6 17,9
92 1хЮ"э 15 6,9 11,7
93 1хЮ"4 26 6,2 16,9
94 1x10"' 45 3,6 17,6
95 1хЮ"2 95 2,1 17,5
96 1х10-1 395 0,6 17,4
XIII Дибунол
97 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
98 1хЮ"° 40 7,3 13,6
99 1хЮ"э 65 7,0 12,3
100 5х Ю"э 110 2,6 9,3
101 1хЮ"4 140 2,1 8,7
102 2х Ю"4 210 1,6 8,6
103 5хЮ"4 360 1,3 8,4
104 1x10"' 600 1,0 8,0
XIV а-Токоферол
105 Контроль МЛ 5 14,4 26,3
106 1хЮ"8 10 14,0 21,3
107 1хЮ_/ 15 11,0 21,1
108 1хЮ"6 20 9,7 19,4
109 1хЮ"э 25 6,8 18,3
110 1хЮ"4 35 5,2 14,3
111 1x10"' 15 14,6 32,2
112 1хЮ"2 6 15,7 34,4
113 1х10-1 5 16,8 57,3
Исходя из концентрационных зависимостей, получаем ряд уменьшения АОА активности: дибунол > осалмид > парацетамол > фенол > салициловая кислота.
Особый интерес представляет поведение аминофенолов при каталитическом окислении липидных субстратов. Известно, что многие наиболее активные компоненты клетки являются аминами, около 80 % лекарственных препаратов также представляют собой амины. В настоящей работе исследованы аминофенолы и амины.
1, мин
Рисунок 6. Кинетика окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок АО в концентрации 1x10-3 М: 1 — контроль, 2 — фентоламин; 3 — пирокатехин; 4 — новокаин; 5 — корни фар; 6 — аллопуринол; 7 — эмоксипин, 2хЮ~3 М СиС12,1=60 ° С
Представляет интерес сравнение антиоксидантного эффекта пирокатехина и его производных: адреналина, метилдофы. Взаимосвязь между периодами индукции и концентрацией исследуемых соединений во всем изученном диапазоне положительная (рис. 6. Табл. 4). При всех концентрациях соединения более активны, чем пирокатехин. Очевидно, что в производных пирокатехина орто-гидроксильные группы связаны комплексообразованием с солями меди. Поэтому, высокая антиоксидантная активность адреналина и метилдофы
свидетельствует об эффекте за счет аминогруппы. Снижение максимальной скорости окисления может свидетельствовать об участии аминов в реакциях с гидропероксидами с образованием молекулярных продуктов.
1, мин
Рисунок 7. Кинетика окисления метиллинолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии капотена: 1 — контроль; 2 — 1 х10'6 М; 3 — 1 у-10'4 М;
4 — 1 хЮ'3 М; 5 — 1 МО'2 М; 6 — 1 МО1 М, 2М0~3 М СиС12,1=60 ° С
Рассмотрим ряд гетероциклических производных: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. Фентоламин относится к амино-фенолам первой группы, в присутствии которых при различных концентрациях происходит окисление мицеллярного субстрата без периода индукции и периода аутоускорения. Низкая АОА фентоламина может быть обусловлена нарушением сопряжения из-за объемного заместителя в положении 3. В эмоксипине в положении 2 и 4 по отношению к гидроксилу расположены донорные алкильные заместители. Показано, что при всех концентрациях эмоксипин тормозит начальные и максимальные скорости окисления. В присутствии аллопуринола и эмоксипина наблюдаются периоды индукции и
периоды аутоускорения (рис. 6). Соединения относятся к амино-фенолам второй группы. Вероятно, в этих условиях лимитирующей является реакция разрушения амином гидропероксидов по молекулярному механизму. Зависимости периодов индукции от концентрации эмоксипина, аллопуринола и фентоламина приведены в табл. 4.
В качестве серосодержащего соединения в настоящей работе был изучен капотен. Химическая структура препарата позволяет прогнозировать его ингибирующую активность за счет разрушения гидропероксидов меркаптогруппой или хелатирования катализатора.
На рис. 7. Приведены кинетические кривые каталитического окисления МЛ в водно-эмульсионной среде в присутствии (1х10~6—Iх 10"1) М капотена. Показано, что все добавки тормозят процесс окисления, снижая начальную и максимальную скорости (табл. 4). Характер влияния капотена на кинетику каталитического окисления МЛ может быть объяснен следующим образом: капотен может участвовать в реакциях обрыва цепей, обеспечивая ингибирования процесса окисления, снижение скорости окисления может быть обусловлено его конкурентным участием с катализатором в распаде гидропероксидов по молекулярному механизму, что влияет на снижение скорости разветвления цепей и скорости процесса в целом.
R02° + R,-SH-> ROOH +RrS°
ROOH + RrS-R2-> RrSO-R2 + ROH
ROOH + Си +-> R02° + Yf + Cu1+
Общим в эффекте всех аминов и серосодержащего препарата капотена является снижение максимальной скорости процесса, пропорционально увеличению концентрации. Эффект уменьшения начальной и максимальной скорости окисления отмечается для всех АО, кроме пирокатехина и фентоламина, в наибольшей степени это влияние проявляется в действии эмоксипина, осалмида и парацетамола.
1, мин
1 , мин
Рисунок 8. а). Кинетика накопления гидропероксидов при аутоокислении
МО в присутствии равных концентраций АО: 1 — контроль, 2 — эмоксипин, 3 — капотен. б). Кинетика накопления гидропероксидов при
аутоокислении ЛК в присутствии равных концентраций АО: 1 — контроль, 2 — осалмид, 3 — парацетамол. Стрелкой показан еброс АО. С
(АО)=2х10-4М, 1=60° С
Для подтверждения гипотезы о возможном разрушении гидропероксидов под действием АО были проведены эксперименты по тестированию кинетики накопления гидропероксидов (ROOH) с добавками в частично окисленный субстрат каждого из исследуемых АО (рис. 8 а. б.). После внесения ингибитора в течение первого часа наблюдалось снижение концентрации гидропероксидов, в контрольном опыте ROOH продолжали накапливаться. Установлено, что все исследуемые соединения способствуют разрушению гидропероксидов на 50— 75 %.
Выводы:
1. Разработана кинетическая модель тестирования биоантиоксидантов в водно-эмульсионной каталитической среде, выбраны оптимальные концентрации катализатора и поверхностно -активного вещества.
2. Получен ряд каталитической активности солей металлов переменной валентности: Си2+ > Бе2+ > Бе3+ > Со2+>
3. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибунола при окислении безводных и водно-эмульсионных липидных субстратов.
4. Получен ряд увеличения антиоксидантной активности полифункциональных соединений: фентоламин < салициловая кислота < новокаин < аллопуринол < пирокатехин < фенол < парацетамол < коринфар < адреналин < метилдофа < эмоксипин < капотен < осалмид < дибунол.
5. Установлено, что исследуемые соединения в процессе окисления способны как эффективно уничтожать пероксильные радикалы, так и разрушать гидропероксиды молекулярным путем. Вероятно, что антирадикальная активность ингибиторов обусловлена присутствием в их химической структуре фенольного гидроксила, а способность разрушения гидропероксидов связана с наличием амино-, амидной или сульфидной группы.
Разработанный способ тестирования биоантиоксидантов волюмометрическим методом с использованием каталитического окисления
водно-эмульсионных липидных субстратов был внедрен в НИИ клинической и профилактической кардиологии СО РАМН, отдел артериальной гипертонии (Авторы внедрения: В.Н. Ушкалова, Н.В. Иоанидис, Г.Д. Кадочникова, В.В. Тихонова, М.Г. Перевозкина).
По результатам антиоксидантной активности ряда лекарственных препаратов различного фармакологического действия было выявлено наиболее эффективное соединение — осалмид. В Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН на базе структуры осалмида была синтезирована группа замещенных амидов и сульфидов салициловой кислоты, имеющих в орто- и пара-положении экранирующие трет-бутильные заместители. Сравнительному тестированию ингибирующих свойств новых перспективных соединений с целью выявления среди них активных антиоксидантов будет посвящена отдельная работа.
Список литературы:
1. Арутюнян Р.С., Налбандян Дж.М., Бейлерян Н.М. // Кинетика и катализ. — 1985. — Т. 26. — вып. 4. — № 6. — С. 1475—1477.
2. Владимиров Ю.А., Суслова Т.Б., Оленев В.И. Митохондрии. Транспорт электронов и преобразование энергии. М.: Наука, 1976. — 109 с.
3. Денисов Е.Т. Элементарные реакции ингибиторов окисления // Успехи химии. — 1973. — Т. 42. — вып. 3. — С. 361—390.
4. Паничева Л.П., Третьяков Н.Ю., Яковлева С.А., Юффа А.Я. Мицелярно-каталитическое окисление углеводородов. 1. Окисление кумола кислородом в водных растворах додецилсульфата натрия в присутствии сульфата меди // Кинетика и катализ. — 1990. — Т. 31. — вып. 1. — С. 96—101.
5. Паничева Л.П., Третьяков Н.Ю., Эйхман С.А., Юффа А.Я. Мицеллярно-каталическическое окисление углеводоров. 2. Влияние медных и натриевых солей лауриновой и пальмитиновой кислот на кинетику
окисления кумола кислородом в присутствии водной фазы // Кинетика и катализ. — 1991. — Т. 32. — вып. 1. — С. 45—49.
6. Перевозкина М.Г. Кинетика и механизм ингибирующего действия производных фенозана, салициловой кислоты и их синергических смесей с а- токоферолом и фосфолипидами. Автор. ...канд. хим. наук. Тюмень. — 2003. — 28 с.
7. Перевозкина М.Г., Тихонова В.В., Ушкалова В.Н. Каталитическое окисление липидных субстратов в присутствии фенолов и аминов // В сб.: Свободно-радикальное окисление липидов в эксперименте и клинике. Тюмень, Из-во Тюм.ГУ. — 1997. — С. 90—104.
8. Рогинский В. А. Фенольные антиоксиданты. М.: Наука. — 1988. — 247 с.
9. Русина И.Ф. Хемилюминесцентные методы в исследовании ингибиторов окисления. Автор. .канд. хим. наук. М.: Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН. — 2011. — 22 с.
10. Ушкалова В.Н., Перевозкина М.Г., Барышников Э.В. Разработка способа тестирования средств антиоксидантотерапии // В сб.: Свободно -радикальное окисление липидов в эксперименте и клинике. Тюмень, Из -во Тюм.ГУ. — 1997. — С. 77—82.
11. Эмануэль Н.М. Механизм действия антиоксидантов. Современные представления // Нефтехимия. — 1982. — Т. 22. — № 4. — С. 435—447.
12. Эмануэль Н.М., Майзус З.К., Карпухина Г.В., Мескина М.Я. Механизм синергетического действия смесей ингибиторов в процессах окисления // Тез. междун. симп. по методам оценки и практическому применению стабилизаторов и синергических смесей. М. — 1973. — С. 1—18.
13. Allen Y.C., Farag P.A comparison between the metal-catalysed autoxidation of agueous emulsions of linoleic acid, trilinolein and phospholipids 3 Symp. int. oxide lipides catalyses metaux. Paris. — 1974. — P. 44—56.
14. Burton G.W., Ingold K.U. Autoxidation of biological molecules. 1. The antioxidant activity of vitamin E and related chainbreaning phenolic antioxidant in vitro // J. Amer. Chem. Soc. — 1987. — V. 103. — № 21. — P. 6472—6477.
15. El-Zeany B.A., Pokorny Y., Yanicek G. Effect of metallic compounds on the autoxidation of fatty acids and their derivatives. 4. Autoxidation of fish oil fatty acid esters in mixture with protein in presence of copper and iron salts // Sb. VSCHT V Praze. — 1974. — E. 42. — P. 5—18.
16. Ohlson R. Fats and oils demetalization : its intlulnce on their oxidative stability // 3. Symp. int. oxide lipides catalises metaux. Paris. — 1973. — P. 184—192.
17. Pokorny J. Effect of metallic compounds on the autoxidation of fatty acids and their derivatives. 3. Effect of metallic chlorides on the autoxidation of stabilized isopropyl oleate // Sb. VSCHT V Praze. — 1969. — E. 27. — P. 67—81.
18. Pokorny J., Kondratenko S.S., Janicek G. Autoxidation of some vegetable oils at elevated temperatures. 14. Effect of heavymetals and inhibitors on the meximum oxidati on rate of sunflower seed oil // Sb. Vysoke skoly chem. technol. V Praze. — 1967. — E. 18. — P. 61—66.
19. Pokorny J., Luan N.T., Janicek G. Changes of to copherols in vegetable oils under the conditiong of deep fat frying // Sb. Vysoke skoly chemicko — technologicke V Praze. — 1973. — E. 39. — P. 24—41.
