CC BY
38
УДК 547.943.7/541.127/128.24/577.161.6
Ключевые слова: каталитическое окисление липидов, экспресс-тестирование антиоксидантной активности, мицеллы, водно-эмульсионная среда
Key words: catalytic oxidation of lipids, rapid testing antioxidant activity, micelles, water-emulsion environment
Перевозкина М. Г.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ БИОМЕМБРАН В ПРИСУТСТВИИ АНТИОКСИДАНТОВ
modeling of processes of oxidation of lipids inbiomembranes in the presence of antioxidants
ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья» Адрес: 625003, Россия, г. Тюмень, ул. Республики, 7
State Agrarian university of North Zauralye. Address: 625003, Russia, Tyumen, Republic str., 7
Перевозкина Маргарита Геннадьевна, канд. хим. наук, старший преподаватель кафедры агрохимии
Ferevozkina Margarita G., ph.D. in chemical Science, Senior Lecturer of Agricultural chemistry Department
Аннотация. Разработана кинетическая модель экспресс-тестирования антиоксидантной активности (АОА) различных классов органических соединений в условиях, приближенных к биологическим средам. Показано, что скорость окисления модельных липидов в водно-эмульсионной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. Подобраны оптимальные условия каталитического окисления эфиров высших ненасыщенных жирных кислот в водно-эмульсионной среде в зависимости от природы и концентрации солей металлов переменной валентности и поверхностно-активного вещества. Исследована АОА важнейших органических ингибиторов в сравнении со стандартными антиоксидантами дибунолом и а-токоферолом в водно-липидных катализируемых субстратах. Summary. Developed kinetic model of rapid testing antioxidant activity (AoA) of various classes of organic compounds in conditions close to biological environments. The rate of oxidation of lipids in model water-emulsion medium is 1000 times higher than in non-aqueous medium. optimal conditions of catalytic oxidation of unsaturated esters of higher fatty acids in aqueous emulsion medium, depending on the nature and concentration of salts of transition metals valence and surfactant. Investigated AOA important organic inhibitors compared with standard antioxidants dibunol and a-tocopherol the water-catalyzed lipid substrates.
Введение
В настоящее время развитие многих патологий связывают с активацией перекисного окисления липидов биомембран. При этом в организме нарушается баланс процессов образования и распада пероксидов, свойственный нормальным тканям. Увеличение концентрации пероксидов меняет физические и биологические свойства мембран. Поэтому терапию многих патологий связывают с применением антиоксидантов. Актуальной остается проблема предварительного тестирования их антиоксидантной активности. Поскольку большинство известных моделей для тестирования антиоксидантов являются гидрофобными, представлялось актуальным подобрать гидрофильную липидную систему и проверить ее эффективность на примере известных химических соединений, предположительно имеющих антиоксидантную активность, сравнить их действие со стандартными ингибиторами окисления. Известны
многочисленные работы по тестированию активности катионов металлов, которые относятся в основном к катализу гомогенных липидных систем [1, 2, 9, 10]. Эти результаты имеют ограниченное значение для описания процессов окисления, протекающих в мицеллах и живой клетке.
Целью данного исследования являлась разработка кинетического способа тестирования антиоксидантной активности различных классов органических соединений (фенолов, аминов, серосодержащих соединений) в условиях, приближенных к биологическим средам, изучение антиоксидантной активности ряда полифункциональных соединений в сравнении с реперными антиок-сидантами дибунолом и а-токоферолом.
Материалы и методы
Антиоксидантную активность (АОА) изучали манометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке
типа Варбурга при окислении модельного субстрата (метиллинолеата (МЛ), метилоле-ата (МО) и этилолеата (ЭО)) в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) (10"4-10"2 М), с добавками растворов солей металлов в количестве (10-6-10-1 М) при t = (60±0,2) °С. Соотношение воды и эфира составляло 3 : 1, а общий объем пробы 4 мл [7]. Кинетику поглощения кислорода в безводной среде изучали в среде инертного растворителя хлорбензола, процесс инициировали за счет термического разложения азо-бис-изо-бутиронитрилом (АИБН). Использовали термостатируемую окислительную ячейку объемом 2-5 см3, окисление проводили кислородом воздуха, температура опытов составляла (60±0,2) °С. Графическим методом определяли величину периода индукции (1), представляющей собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром, опущенным из точки пересечения касательных, проведенных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяется совокупностью реакций ингибитора и обозначает его антиоксидантную активность, количественно определяемой по формуле АОА = 1 - 1. / где ^ и 1 - периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно, сравнивали с действием ингибитора, принятого за стандарт. Скорость инициирования определяли уравнением Wi = f [1пН] / 1, где f - стехиометрический коэффициент ингиби-рования, [1пН] - концентрация ингибитора, 1 - период индукции. Из наклона кинетических кривых определяли начальную ^нач) и максимальную ^ ) скорости окисления липидного субстрата.
Антирадикальную активность (АРА) тестировали в системе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным (ХЛ) методом совместно с к. х. н. И. Ф. Руси-ной [6]. Для измерения интенсивности свечения была использована фотометрическая установка, созданная в ИХФ им. Семенова РАН. Окисление этилбензола проводили в стеклянной ячейке, расположенной в светонепроницаемой камере фотометрической
установки, снабженной фотоумножителем ФЭУ-29. Ячейка имеет термостатируемую рубашку. Через ячейку пропускали очищенный от пыли и паров воды воздух. Исследуемое вещество вводили в окислительную ячейку по ходу реакции с помощью шприцевого устройства. Излучаемый свет фокусировался на фотоумножитель с помощью системы сферических зеркал. Окисление инициировалось АИБН в концентрации 3 х 10-3 М при температуре 1 = (60±0,2) °С. Скорость зарождения свободных радикалов определялась экспериментально с помощью реперного ингибитора - хромана С - и составила 2,3 х 10-8 М х с-1. Для усиления свечения использовался люминофор 9,10-диброман-трацен в концентрации 5 х 10-4 М, не оказывающий влияния на кинетику окисления. Концентрация ингибитора составляла (1-5) х 10-4 М. В ходе эксперимента были получены типичные S-образные кинетические кривые. Основной кинетической характеристикой ХЛ кривых является величина тангенса угла наклона касательной, проведенной в точке перегиба, пропорциональная максимальной скорости расходования антиоксиданта [ё (10 / I) / ё1] . Указанную величину использовали для расчетов значения к7 с учетом уравнения
[ё (10 / I) / ё1]тах = (0,22±0,02) х к7 х /
где к6 - константа скорости рекомбинации перекисных радикалов (для этилбензола к6 = 4,1 х 108 е-2100ЖТ).
Кинетику накопления гидропероксидов изучали при аутоокислении модельных субстратов (МО и линолевой кислоты (ЛК)) методом обратного йодометрического титрования в среде хлорбензола, 1 = (60±0,2) °С. В качестве стандартных ингибиторов использовали а-токоферол и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми. Критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) ЦТМАБ изучали методом Ребиндера и рефрактометрическим методом.
Результаты исследований и обсуждение полученных данных
Разработка кинетического метода базировалась на исследовании активности солей переходных металлов: FeSO4, FeCl3, МС12,
СоС12, СиС12 в водно-липидных субстратах. С целью выбора наиболее эффективного катализатора изучали в сравнительном аспекте влияние упомянутых выше солей на процесс окисления МЛ.
На рисунке 1 представлены кинетические кривые (КК) поглощения кислорода в присутствии равных добавок (1 х 10-3 М) солей железа (ПДП), никеля (II), кобальта (II) и меди (II). Из рисунка 1 видно, что в сравнимых концентрациях наиболее эффективным катализатором является хлорид меди (II). Для него отмечается наибольшая скорость процесса, оцениваемая из наклона кинетических кривых. При сопоставлении абсолютных значений максимальной скорости окисления ^ ) исследуемые катализаторы располагаются в следующем порядке: №С12 < FeCl3 < Fe2SO4 < СоС12 < СиС12.
Действие упомянутых выше солей было изучено в широком диапазоне концентраций для отбора среди них наиболее эффективных катализаторов. В результате исследований установлено, что аутоускоренный характер имеет кинетика окисления водно-липидных субстратов в присутствии катионов Fe2+, Со2+ и Си2+. Характер кинетических кривых окисления липидных субстратов в зависимости от концентрации катионов позволил предполагать преобладающее участие Fe3+, №2+ в обрыве цепей, участие Fe2+, Со2+, Си2+ в зарождении и разветвлении цепей. Зависимости скорости окисления метиллиноле-ата от концентрации солей металлов носят экстремальный характер, экстремумы проявляются в разных диапазонах. Скорости окисления липидных субстратов в присутствии солей №С12 и FeCl3 выходят на максимум при концентрациях 1,0 х 10-3 М, далее с ростом концентрации их значение не меняется и составляет (4,0±0,2) х 10-5 М х с-1 и (5,0±0,3) х 10-5 М х с-1 соответственно. Максимальная скорость при окислении с добавками сульфата железа отмечается в диапазоне (0,1-1,0) М и составляет (9,4±0,4) х 10-5 М х с-1, при дальнейшем росте концентрации -остается постоянной и составляет (6,0±0,2) х
10-5 М х с-1. Зависимость W систем с дотах.
бавками хлорида кобальта имеет «пик» при концентрации (9-11) х 10-3 М, при которой ее
величина составляет (24,4±0,4) х 10-5 М х с-1. Хлорид меди по своим каталитическим свойствам выделяется среди всех исследуемых веществ. Скорость окисления в присутствии хлорида меди выше в 5 раз, чем в присутствии других солей металлов переменной валентности и при концентрации 2 х 10-3 М составляет (26,3±0,3) х 10-5 М х с-1 (рис. 2).
Рис. 1. Кинетика окисления МЛ в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок солей металлов в концентрации 1х10-3 М : 1 - СиС12, 2 - Ре804, 3 - СоС12, 4 - FeQ3, 5 - ЫЮ2, 1х10-3 М СЦТМАБ, t = 60 °С.
В нашем эксперименте каталитическая активность солей металлов уменьшается в ряду: Си2+ > Fe2+ > Fe3+ > Со2+ > Ni2+. Ранее каталитическое действие металлов переменной валентности изучалось при окислении растительных масел и модельных липидных субстратов [1, 3, 4, 6]. Был получен ряд каталитической активности: Си2+ > Мп2+ > Fe2+ > Сг2+ > Ni2+ >> Zn2+. Как видно из приведенных выше данных изученные соли вписываются в указанный ряд активности металлов, а хлорид меди обладает наибольшей каталитической активностью при наименьшей концентрации 2 х 10-3 М.
Следующим этапом создания модели для тестирования антиоксидантов был выбор концентрации ЦТМАБ. Известно [4], что скорость окисления в гомогенных системах ниже, чем в эмульсиях и зависит от степени ее дисперсности. В работе [2] установлено, что соотношение констант скорости роста и обрыва цепи при инициированном окисление кумола в эмульсиях и гомогенной системе соотносится как 5,5 : 1 и равно 110 и 20 соответственно.
Нами также было установлено, что скорость окисления МЛ в водно-эмульсионной среде ~ в 1000 раз выше, чем в безводной среде.
Рис. 2. Зависимость стационарных скоростей окисления МЛ в присутствии солей катализаторов от их концентрации, М : 1 - №С12, 2 - Feaз, 3 - Fe2SO4, 4 - СоС12, 5 - СиС12, 1х10-3 М СцТМАБ, t = 60 °С.
При выборе оптимальной концентрации ЦТМАБ исследовали диапазон (10-4-10-2) М. Установлено, что с ростом концентраций ПАВ скорость процесса проходит через максимум, соответствующий концентрации 1 х 10-3 М. Дальнейшее повышение концентрации ЦТМАБ приводит к снижению скорости окисления. Указанную концентрацию детергента, обеспечивающую наибольшую скорость реакции, можно рекомендовать для использования в гетерогенных моделях окисления. Методом Ребиндера и рефрактометрически была определена ККМ ЦТМАБ, равная (1,0±0,2) х 10-3 М, что соответствовало кинетическим данным.
Механизм каталитического окисления ли-пидов в водно-эмульсионной среде сводится к следующему: в присутствии ЦТМАБ формируются мицеллы. Добавки катионного ПАВ усиливают мицеллообразование, при этом катионы внедряются в промежутки между углеводородными «хвостами» и образуют двойной электрический слой. При образовании свободных радикалов высших жирных кислот катионы катализатора должны иметь доступ к гидрофобным хвостам субстрата. При низких концентрациях катионы катализатора имеют большую вероят-
ность донорно-акцепторного взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов по реакции: Ме(п+1)+ + ЯН + 02 ^ Меп+ + + Н+ В соответствии с приведенной гипотезой, добавки 1 х 10-3 М ЦТМАБ являются оптимальными, обеспечивающими максимальный контакт катионов меди и кислорода с жирно-кислотными радикалами. Увеличение концентрации ПАВ снижает количество таких контактов и скорость процесса соответственно.
При низких концентрациях катионы катализатора имеют большую вероятность до-норно-акцепторного взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов по реакции: Ме(п+1)+ + ЯН + 02 ^ Меп+ + + Н+ Механизм действия металлов связывают с каталитическим разрушением гидроперок-
сидов в соответствии с реакциями [2]:
,2+
Я00Н + Бе3+ ^ Я02° + Н+ + Бе Я00Н + Си2+ ^ Я02° + Н+ + Си
3+
1+
Я00Н + Бе2+^ Я02° + Н+ + Бе
Образующиеся при этом алкоксильные и пероксильные радикалы участвуют в дальнейшем в реакциях продолжения цепей окисления. Катионы металлов могут конкурентно участвовать в обрыве цепей, что должно приводить к замедлению процесса на глубоких стадиях окисления. Замедление процесса возможно также за счет перехода катиона металла в менее активную форму.
На основе проведенных исследований была предложена новая кинетическая модель для тестирования биоантиоксидантов. Модельный субстрат содержит 2 х 10-3 М хлорида меди (II), 1 х 10-3 М ЦТМАБ, липи-ды (ЭО, МО, МЛ) и воду, соотношение липи-ды - вода - 1 : 3.
В настоящей работе приведены результаты исследования кинетики каталитического окисления липидного субстрата в водно-эмульсионной среде в присутствии ряда полифункциональных соединений. Ряд производных фенола составили: парацетамол, осалмид. Ряд двухатомных фенолов представляли: адреналин, метилдофа.
В качестве гетероциклических производных использовались: фентоламин, алло-пуринол, эмоксипин. В качестве аминов исследовали: новокаин, коринфар. В качестве серосодержащего соединения изучали капотен. Реперными АО послужили а-токоферол и дибунол, а также фенол, са-
лициловая кислота, пирокатехин. Химические формулы изучаемых соединений приведены в таблице 1.
Для доказательства свободно-радикального механизма каталитического окисления липидного субстрата использован метод ингибиторов. Проведено исследование законо-
Химические формулы изучаемых антиоксидантов
Таблица 1.
№ п/п
Название АО
Формула
Фенол (гидроксибензол)
Салициловая кислота (ортогидроксибензойная кислота)
Парацетамол (пара-ацетаминофенол)
Осалмид (амид 1-^-4'-гидроксифенил) салициловой кислоты)
Пирокатехин (1,2-дигидроксибензол)
Адреналин (1-(3',4'-дигидроксифенил)-2^-метил)-аминоэтанол)
Метилдофа (2-амино-2-метил-3-(3',4'-дигидрокси)-фенилпропановая кислота)
1
2
3
4
5
6
7
Фентоламин (2-[Ы-пара-толил-М-(мета-оксифенил)-аминометил]-имидазолина гидрохлорид)
Аллопуринол (1,5-дигидро-4Н-пиразоло[3,4^]пиримидин-4-он)
10
Эмоксипин (3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридин)
11
Новокаин (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоат)
12
Коринфар (2,6-диметил-4-(2'-нитро-фенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоновой кислоты диметиловый эфир)
13
Капотен 1-[^)]-3-меркапто-2-метилпропионил]-L-пролин
14
Дибунол (2,6-дитрет.бутил-4-метил-фенол)
15
а-токоферол (2,5,7,8-тетраметил-2-(4,8,12-триметил-тридецил)-6-оксихроман)
8
9
мерностей окисления модельного субстрата (МЛ, ЭО) в присутствии добавок стационарных ингибиторов окисления дибунола и а-токоферола. По результатам эксперимента рассчитаны кинетические параметры окисления субстратов.
В нашем исследовании установлен идентичный характер кинетических кривых при окислении липидных субстратов в растворе хлорбензола в присутствии 6 х 10-3 М инициатора АИБН и водно-эмульсионной системе в присутствии 2 х 10-3 М хлорида меди при разных концентрациях дибунола (рис 3. а, б). На рисунке 3б показано, что в водно-эмульсионной среде дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола. Наличие торможения в присутствии добавок дибунола является признаком радикально-цепного механизма процесса. По наклону прямой в координатах т, [МН] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 6,2 х 10-8 и 6,7 х 10-5 М х с-1 в безводной и водно-эмульсионной системе соответственно. Сравнение максимальных скоростей окисления ЭО при t = (60±0,2) °С в безводной и водно-эмульсионной средах, равных 1,3 х 10-7 и 1,4 х 10-4 М х с-1 , соответствует различию скоростей инициирования ~ в 1000 раз.
Показано, что реперный биоантиок-сидант а-токоферол в ВЭС проявлял слабые антиоксидантные свойства, в концентрациях свыше 1 х 10-3 М промотировал процесс окисление липидных субстратов (рис. 4, табл. 2). Полученные результаты указывают на более сложный механизм действия а-токоферола в катализируемом субстрате. Причиной ускорения процесса может быть комплексообразование 0Н-группы а-токоферола с катализатором. В процессе окисления а-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы, способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (ЯН):
!п* + ЯН ^ Я* + InH
1, мин
Рис. 3 а. Кинетика окисления этилолеата в безводной среде в присутствии добавок дибунола, М: 1 - контроль, 6х10-3 М АИБН; 2 - 5х10-6, 3 - 1х10-5, 4 - 5х10-5, 5 - 1х10-4, 6 - 5х10-4, 7 - 7,5х10-4, 8 - 1х10-3, I = 60 °С.
Рис. 3б. Кинетика окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок дибу-нола, моль/дм3: 1 - контроль, 2х10-3 моль/дм3 СиС12;
2 - 1х10-6, 3 - 2х10-5, 4 - 5х10-5, 5 - 1х10-4, 6 - 5х10-4, I = 60 °С.
Рис. 4. Кинетика окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок АО в концентрации 1х10-3 М: 1 - контроль; 2 - а-токоферол; 3 - салициловая кислота; 4 - фенол; 5 - парацетамол; 6 - осалмид; 2х10-3 М СиС12, I = 60 °С.
Таблица 2.
Кинетические параметры окисления липидных субстратов в водно-эмульсионной среде в присутствии 2 х 10-3 М СиС12 в зависимости от концентрации АО, t = 60 °С
№ п/п СаО, М т., мин. W х 10-5, М х с-1 нач. ' W х 10-5, М х с-1 тах. '
I Фенол
1 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
2 1 х 10-4 30 3,9 4,6
3 1 х 10-3 50 2,5 4,0
4 1 х 10-2 130 1,3 3,2
II Салициловая кислота
5 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
6 1 х 10-4 22 3,6 7,7
7 1 х 10-3 35 5,1 11,9
8 1 х 10-2 40 3,6 6,5
III Парацетамол
9 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
10 1 х 10-4 20 6,2 10,0
11 1 х 10-3 40 2,5 3,1
12 1 х 10-2 45 2,0 2,4
IV Осалмид
13 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
14 1 х 10-4 45 2,9 4,4
15 1 х 10-3 350 0,6 2,7
16 1 х 10-2 500 0,4 2,5
V Пирокатехин
17 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
18 1 х 10-4 9 12,0 17,3
19 1 х 10-3 70 5,1 14,2
20 1 х 10-2 120 1,9 16,8
V Адреналин
21 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
22 1 х 10-4 30 3,4 4,6
23 1 х 10-3 40 2,1 4,5
24 1 х 10-2 60 0,9 3,8
VI Метилдофа
25 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
26 1 х 10-4 30 6,8 8,8
27 1 х 10-3 35 3,4 5,1
28 1 х 10-2 60 0,9 2,4
VII Фентоламин
29 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
30 1 х 10-4 15 7,4 13,7
31 1 х 10-3 20 6,8 13,8
32 1 х 10-2 55 6,1 13,4
VIII Аллопуринол
34 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
35 1 х 10-4 50 3,7 5,3
36 1 х 10-3 70 3,5 5,5
37 1 х 10-2 80 2,6 5,6
IX Эмоксипин
38 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
39 1 х 10-4 40 2,1 4,3
40 1 х 10-3 55 1,0 3,5
41 1 х 10-2 90 0,7 2,6
X Новокаин
42 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
43 1 х 10-4 45 6,7 9,2
45 1 х 10-3 50 6,5 7,6
46 1 х 10-2 70 5,7 6,8
XI Коринфар
47 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
48 1 х 10-4 26 4,9 7,0
49 1 х 10-3 50 3,9 5,0
50 1 х 10-2 100 1,4 2,5
XII Капотен
51 Контроль МЛ 5 14,4 26,3
52 1 х 10-4 26 6,2 16,9
53 1 х 10-3 45 3,6 17,6
54 1 х 10-2 95 2,1 17,5
55 1 х 10-1 395 0,6 17,4
XIII Дибунол
56 Контроль ЭО 15 7,5 14,0
57 1 х 10-6 40 7,3 13,6
58 1 х 10-5 65 7,0 12,3
59 1 х 10-4 140 2,1 8,7
60 2 х 10-4 210 1,6 8,6
61 1 х 10-3 600 1,0 8,0
XIV а-токоферол
62 Контроль МЛ 5 14,4 26,3
63 1 х 10-8 10 14,0 21,3
64 1 х 10-7 15 11,0 21,1
65 1 х 10-6 20 9,7 19,4
66 1 х 10-5 25 6,8 18,3
67 1 х 10-4 35 5,2 14,3
68 1 х 10-3 15 14,6 32,2
69 1 х 10-2 6 15,7 34,4
70 1 х 10-1 5 16,8 57,3
Примечание: р < 0,05.
Поскольку известно [3, 5, 8], что в углеводородной среде увеличение АРА фенолов происходит под влиянием электронодонор-ных заместителей, рассмотрим полученные ряды соединений в зависимости от структуры. В соответствии с теорией, ингибиторы условно делятся на сильные и слабые [3]. Сильные ингибиторы эффективно тормозят окисление, участвуя только в реакциях обрыва цепей. Кинетика такого процесса характеризуется периодом полного торможения, аутоускорением и достижением максимальной скорости. Слабые ингибиторы способны не только обрывать цепи, но из-за высокой активности своих радикалов участвовать в реакциях продолжения цепей. Кинетика такого процесса характеризуется отсутствием периода полного торможения, достаточно высокими начальными скоростями, аутоускорением на определенном уровне окисления, достижением максимальной скорости. Алкилированные в пара-и орто-положения фенолы, двухатомные фенолы считаются сильными ингибиторами. Каждая алкильная или гидроксильная группа увеличивает АРА на определенную величину. Ингибитор тем эффективнее, чем меньше полярность и больше размер заместителя в пара-положении.
Методом хемилюминесценции для некоторых исследуемых соединений была оценена величина константы скорости реакции к7 АО с пероксильными радикалами [6]: RO2• + 1пН ^ ROOH + 1п*, где 1пН - ингибитор окисления, 1п* - радикал ингибитора, RO2•- пероксильный радикал.
Стехиометрический фактор ингибирова-ния показывающий количество свободных радикалов, реагирующих с молекулой ингибитора, приведен в таблице 3. При исследовании кинетики изменения интенсивности ХЛ в присутствии исследуемых соединений было установлено, что все АО оказывают ингибирующее действие на процесс окисления модельного субстрата. Показано, что наибольшую активность в реакции с перок-сильными радикалами проявляет осалмид (табл. 3), константа скорости реакции к7 которого обусловлена акцепторным характером заместителя в пара-положении, наличием п-р-сопряжения между амино-группой и фенолом. АРА осалмида может складываться из активности двух гидроксильных групп. В эмоксипине в положении 2 и 4 по отношению к гидроксилу расположены донорные алкильные заместители, в парацетамоле до-норный заместитель содержится в пара-положении. В салициловой кислоте антирадикальная активность может снижаться за счет акцепторного характера карбоксильной группы. Сравнение констант скорости реакции к7 исследуемых соединений и а-токоферола показывает, что основной природный АО более активен в реакции с пероксильными радикалами в 360 раз.
На рисунке 4 представлены КК окисления ЭО с равными добавками производных фенола. АОА салициловой кислоты всегда ниже, чем у фенола и уменьшается с увеличением ее концентрации (рис. 4, табл. 2). Такой характер влияния салициловой кислоты может быть обусловлен образованием салицилата
Таблица 3.
Значения константы скорости реакции АО с пероксильными радикалами RO2• = 2,3 х 10-8 М х с-1; САП = 1 х 10-3 М; t = 60 °С
1 ' ' АО '
№ п/п Название фенола к7 х 104, М-1 х с-1 f
1 Фенол 0,24 2,7
2 Салициловая кислота 0,23 2,0
3 Парацетамол 4,00 2,4
4 Осалмид 6,86 2,4
5 Эмоксипин 0,61 2,0
6 а-токоферол 360 2,0
7 Дибунол 1,40 2,0
Примечание: р < 0,05.
меди. Показано, что все исследуемые концентрации осалмида и парацетамола уменьшали начальную и максимальную скорости окисления в 2-5 раз по сравнению с контролем (табл. 2). Исходя из концентрационных зависимостей, получаем ряд уменьшения АОА активности: дибунол > осалмид > парацетамол > фенол > салициловая кислота.
Установлено, что эффективность торможения при всех концентрациях пирокатехина существенно ниже, чем для подобных концентраций фенола (рис. 5, табл.4). Очевидно, что причину такого различия нельзя объяснить структурой фенолов и следует связывать с влиянием активности катализатора. Пирокатехин существенно тормозит окисление ЭО только при концентрациях 1 х 10-2 М и выше. При концентрации пирокатехина 1 х 10-4 М происходит ускорение, а при его концентрации 1 х 10-3 М - очень слабое замедление процесса (рис. 6). Вероятно, ускорение процесса обусловлено активацией катализатора за счет комплексообразования с солями меди. При концентрации пирокатехина 1 х 10-2 М его соотношение с катализатором составляет 5 : 1. В этих условиях большая часть пирокатехина не задействована в комплексообразовании и проявляет антиок-сидантную активность.
Взаимосвязь между периодами индукции и концентрацией адреналина и метилдофы во всем изученном диапазоне положительная (рис. 5, табл. 2). Очевидно, что в производных пирокатехина орто-гидроксильные группы связаны комплексообразованием с солями меди. Поэтому высокая антиокси-дантная активность адреналина и метилдо-фы, снижение максимальной скорости окисления может свидетельствовать об участии аминов в реакциях с гидропероксидами с образованием молекулярных продуктов.
Рассмотрим ряд гетероциклических производных: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. Фентоламин относится к ами-но-фенолам первой группы, в присутствии которых при различных концентрациях происходит окисление мицеллярного субстрата без периода индукции и периода аутоускоре-ния. Низкая АОА фентоламина может быть обусловлена нарушением сопряжения из-за
Рис. 5. Кинетика окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии добавок АО в концентрации 1х10-3 М: 1 - контроль, 2 - фентоламин; 3 - пирокатехин; 4 - новокаин; 5 - коринфар; 6 - аллопуринол; 7 - эмоксипин, 2х10-3 М СиС12, t = 60 °С.
Рис. 6. Кинетика окисления метиллинолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии капотена: 1 - контроль; 2 - 1х10-6 М; 3 - 1х10-4 М; 4 - 1х10-3 М; 5 - 1х10-2 М; 6 - 1х10-1 М, 2х10-3 М СиС12, t = 60 °С.
объемного заместителя в положении 3. Показано, что при всех концентрациях эмоксипин тормозит начальные и максимальные скорости окисления. В присутствии аллопуринола и эмоксипина наблюдаются периоды индукции и периоды аутоускорения. Соединения относятся к амино-фенолам второй группы. Вероятно, в этих условиях лимитирующей является реакция разрушения амином гидро-пероксидов по молекулярному механизму. Зависимости периодов индукции от концентрации эмоксипина, аллопуринола и фенто-ламина приведены в таблице 2.
В качестве серосодержащего соединения в настоящей работе был изучен капотен.
50 100 150 200 250 300 350 400
МИН
Рис. 7а. Кинетика накопления гидропероксидов при аутоокислении МО в присутствии равных концентраций АО: 1 - контроль, 2 - эмоксипин, 3 - капотен.
0.02
200 300 400 500 600 700 300
t , МИГ1
Рис. 7б. Кинетика накопления гидропероксидов при аутоокислении ЛК в присутствии равных концентраций АО: 1 - контроль, 2 - осалмид, 3 - парацетамол. Стрелкой показан вброс АО. С(АО) = 2 х 10-4M, t = 60 °C.
Показано, что все добавки капотена тормозят процесс окисления, снижая начальную и максимальную скорости (рис. 6, табл. 2). Вероятно, капотен (Rj-SH) участвует в реакциях обрыва цепей, обеспечивая ингибирова-ния процесса окисления, снижение скорости окисления обусловлено его конкурентным участием с катализатором в распаде гидропе-роксидов по молекулярному механизму, что влияет на снижение скорости разветвления цепей и скорости процесса в целом: RO2° + R^SH- ROOH +R-S° ROOH + R-S-R2 — R-SO-R2 + ROH ROOH + Cu2+ — RO2° + H+ + Cu1+ Общим в эффекте всех аминов и серосодержащего препарата капотена является снижение максимальной скорости процесса пропорционально увеличению концентрации. Эффект уменьшения начальной и максимальной скорости окисления отмечается
для всех АО, кроме пирокатехина и фенто-ламина, в наибольшей степени это влияние проявляется в действии эмоксипина, осалми-да и парацетамола.
Для подтверждения гипотезы о возможном разрушении гидропероксидов под действием гибридных АО были проведены эксперименты по тестированию кинетики накопления гидропероксидов (ROOH) с добавками в частично окисленный субстрат каждого из исследуемых АО (рис. 7 а, б). После внесения ингибитора в течение первого часа наблюдалось снижение концентрации гидропероксидов, в контрольном опыте ROOH продолжали накапливаться. Установлено, что все исследуемые соединения способствуют разрушению гидропероксидов на 50-75 %.
Выводы
1. Разработана кинетическая модель тестирования биоантиоксидантов в водно-эмульсионной каталитической среде, выбраны оптимальные концентрации катализатора и поверхностно-активного вещества.
2. Получен ряд каталитической активности солей металлов переменной валентности: Cu2+ > Fe2+ > Fe3+ > Co2+ > Ni2+.
3. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибуно-ла при окислении безводных и водно-эмульсионных липидных субстратов.
4. Получен ряд увеличения антиоксидант-ной активности полифункциональных соединений: фентоламин < салициловая кислота < новокаин < аллопуринол < пирокатехин < фенол < парацетамол < коринфар < адреналин < метилдофа < эмоксипин < капотен < осалмид < дибунол.
5. Константа скорости реакции анти-оксидантов с пероксильными радикалами k7 уменьшается в ряду: 3,60 х 106 М-1 х с-1 (а-токоферол) > 6,86 х 104 М-1 х с-1 (осалмид) > 4,00 х 104 М-1 х с-1 (парацетамол) > 1,40 х 104 М-1 х с-1 (дибунол) > 6,10 х 103 М-1 х с-1 (эмоксипин) > 2,40 х 103 М-1 х с-1 (фенол) > 2,30 х 103 М-1 х с-1 (салициловая кислота).
6. Установлено, что исследуемые соединения в процессе окисления способны как эффективно уничтожать пероксильные ра-
дикалы, так и разрушать гидропероксиды молекулярным путем. Вероятно, что антирадикальная активность ингибиторов обусловлена присутствием в их химической структуре фенольного гидроксила, а способность разрушения гидропероксидов связана с наличием амино-, амидной или сульфидной группы.
По результатам антиоксидантной активности ряда лекарственных препаратов различного фармакологического действия было выявлено наиболее эффективное соединение - осалмид. В Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им. Н. Н. Во-рожцова СО РАН на базе структуры осалми-да была синтезирована группа замещенных амидов и сульфидов салициловой кислоты, имеющих в орто- и пара-положении экранирующие трет-бутильные заместители. Сравнительному тестированию ингибирую-щих свойств новых перспективных соединений с целью выявления среди них активных антиоксидантов будет посвящена отдельная работа.
Список литературы
1. Арутюнян, Р. С. Инициированное окисление кумола в водных эмульсиях / Р. С. Арутюнян, Дж. М. Налбандян, Н. М. Бейлерян // Кинетика и катализ. - 1985. - Т. 26. - Вып. 4. - № 6. - С. 1475-1477.
2. Владимиров, Ю. А. Митохондрии. Транспорт электронов и преобразование энергии / Ю. А. Вла-
димиров, Т. Б. Суслова, В. И. Оленев. - М. : Наука, 1976. - 109 с.
3. Денисов, Е. Т. Элементарные реакции ингибиторов окисления / Е. Т. Денисов // Успехи химии. -
1973. - Т. 42. - Вып. 3. - С. 361-390.
4. Паничева, Л. П. Мицелярно-каталитическое окисление углеводородов. 1. Окисление кумола кислородом в водных растворах додецилсульфата натрия в присутствии сульфата меди / Л. П. Паничева, Н. Ю. Третьяков, С. А. Яковлева, А. Я. Юффа // Кинетика и катализ. - 1990. - Т. 31. - Вып. 1. -С. 96-101.
5. Рогинский, В. А. Фенольные антиоксиданты /
B. А. Рогинский. - М. : Наука, 1988. - 247 с.
6. Русина, И. Ф. Хемилюминесцентные методы в исследовании ингибиторов окисления / И. Ф. Русина, канд. хим. наук. - М. : Институт химической физики им. Н. Н. Семенова РАН, 2011. - 22 с.
7. Ушкалова, В. Н. Разработка способа тестирования средств антиоксидантотерапии / В. Н. Ушкалова, М. Г. Перевозкина, Э. В. Барышников // В сб.: Свободно-радикальное окисление липидов в эксперименте и клинике. - Тюмень : Тюм. ГУ, 1997. -
C. 77-82.
8. Эммануэль, Н. М. Механизм действия антиокси-дантов. Современные представления / Н. М. Эмануэль // Нефтехимия. - 1982. - Т. 22. - № 4. - С. 435-447.
9. Allen, Y. C. A comparison between the metal-catalysed autoxidation of agueous emulsions of linoleic acid, trilinolein and phospholipids 3 Symp. int. oxide lipides catalyses metaux / Y. C. Allen, P. Farag. - Paris,
1974. - P. 44-56.
10. Burton, G. W. Autoxidation of biological molecules. 1. The antioxidant activity of vitamin E and related chainbreaning phenolic antioxidant in vitro / G. W. Burton, K. U. Ingold // J. Amer. Chem. Soc. -1987. - V 103. - N 21. - P. 6472-6477.
