CC BY
16
УДК 577.152.3
КИНЕТИЧЕСКАЯ ДЕМОНСТРАЦИЯ ЛОКАЛЬНЫХ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ВБЛИЗИ АКТИВНОГО ЦЕНТРА a-ХИМОТРИПСИНА В СМЕСЯХ ВОДА - ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИД
Е. А. Беляева, Н. Л. Еремеев*
(кафедра энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Воробьевы горы, Москва 119899, Россия; факс: (095)-939-27-42; e-mail: eremeev@enzyme.chem.msu.ru)
Изучено влияние структуры и скорость-лимитирующей стадии реакции гидролиза субстратов, различающихся между собой N-ацильными заместителями и уходящими группами, на кинетическое поведение a-химотрипсина в системе вода-диметилсульфоксид (ДМСО) при неденатурирующих концентрациях органического растворителя (менее 30 об.%). Показано, что фактором, определяющим наблюдаемые кинетические закономерности, является структура N-заместителя аминогруппы субстрата. Выдвинуто предположение о том, что ДМСО специфическим образом взаимодействует с белковой глобулой a-химотрипсина, по всей вероятности, в районе сорбционного участка Rj-группы субстрата. Ковалентная иммобилизация a-химотрипсина в полиакриламидный гель протектирует белок по отношению как к неспецифическому (денатурирующему), так и к специфическому действию ДМСО. Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что специфическое взаимодействие ДМСО с a-химотрипсином (предположительно в кармане связывания Rj-группы N-замещенных аминокислотных субстратов) индуцирует локальные конформационные изменения «нативной» структуры активного центра фермента.
Зависимость спектральных свойств растворенных белков от концентрации полярного органического растворителя имеет обычно пороговый характер [1], что, как считается, связано с обратимой денатурацией белковой глобулы при достижении «критической» концентрации органического растворителя (обычно от 10 до 40 об.% в зависимости от конкретной пары белок - растворитель [2]). В то же время литературные данные, описывающие кинетическое поведение ферментов (в частности, сериновых протеиназ) в «докритических» концентрациях органического растворителя, довольно противоречивы. Так, например, для а-химотрипсина в смесях вода - ДМСО (критическая концентрация 30 об.% [1]) отмечалось как пороговое падение ферментативной активности при увеличении концентрации органического растворителя в системе [1, 2], так и классическая картина неконкурентного ингиби-рования [3, 4]. При смене растворителя на этанол и диметилформамид были отмечены весьма значительные активационные эффекты [5, 6]. Анализ литературных данных показал, что в каждом случае использовались субстраты, различающиеся соотношением констант скоростей индивидуальных стадий ферментативного гидролиза. Как известно, кинетика гидролиза а-химотрипсином различных субстратов описывается трехстадийной схемой [7]
E + S :
Ks
: ES
k2
-EA •
кз
E +P2
где E - фермент, S - субстрат (в общем виде R1NHCH(R2)C(O)R3), ES - фермент-субстратный комплекс, EA - ацил-фермент, P1 и P2 - продукты ферментативной реакции на стадии образования ацил-фермента и его гидролиза соответственно. В зависимости от уходящей группы (R3) скорость-лимитирующей стадией может являться либо образование ацил-фермента (k2, амидные и нитро-анилидные субстраты), либо его распад (k3, эфирные субстраты).
Резкое падение активности в относительно небольших концентрациях органического растворителя отмечалось в работах с использованием эфирных субстратов a-химо-трипсина [3, 4], в то время как при использовании нитро-анилидных субстратов наблюдалась пороговая зависимость [1, 2] или активационные эффекты [5, 6].
Целью настоящей работы явилось выявление влияния структуры и скорость-лимитирующей стадии реакции гидролиза субстрата (использованные субстраты приведены в таблице) на кинетическое поведение a-химотрипсина в системе вода - ДМСО при неденатурирующих концентрациях ДМСО в смеси (менее 30 об.%).
Материалы и методы
В экспериментах использовали кристаллический a-хи-мотрипсин марки А (ОАО «Самсон», Россия); акрила-мид (АА), ^№-метилен-бисакриламид (МБА), N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), персульфат аммония (Reanal, Венгрия); диметилсульфоксид (ОАО «Химреак-тивкомплект», Россия), акрилоилхлорид (Merk, Германия). Субстраты: этиловый эфир N-ацетил-Е-тирозина
P
*Адресат для переписки.
(АТЭЭ), этиловый эфир N-бензоил-Ь-тирозина (БТЭЭ), р-нитроанилид N-ацетил-Ь-тирозина (АТНА), р-нитроани-лид N-бензоил-Ь-тирозина (БТНА) синтезированы группой органической химии кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (чистота не менее 99%). Соли и компоненты буферных растворов марки не ниже «ч.д.а.» (Реахим, Россия).
Получение препаратов иммобилизованного a-химот-рипсина. Препараты иммобилизованного a-химотрипсина получали по методике, описанной в [9]. К 5 мл раствора a-химотрипсина (концентрация от 0,2 до 0,8 мМ) в 0,1 М аммиачно-ацетатном буфере (0,05 М CaC^, рН 8,0) при 0° и перемешивании добавляли три порции акрилоилхлорида по 10 мкл с интервалом в 15 мин и инкубировали при комнатной температуре еще 30 мин. К полученному раствору акрилоилхимотрипсина добавляли мономер (АА, 1 г), сшивающий агент (МБ А, 100 мкл водного раствора концентрации 18 мг/мл), вводили инициаторы (100 мкл водного 0,78 М раствора персульфата аммония и 50 мкл ТЕМЕД) и проводили сополимеризацию в блоке. Полученный блок-сополимер измельчали в гомогенизаторе до частиц размером 20-150 мкм и промывали солевым раствором (0,2 М NaCl, 0,02 MCaCl2) или фосфатным буфером (0,05 М, рН 9,0) до исчезновения ферментативной активности в промывных водах (обычно 3-4 раза).
Определение ферментативной активности нативного и иммобилизованного a-химотрипсина. Активность нативного и иммобилизованного a-химотрипсина определяли по начальным скоростям гидролиза субстратов в рН-оптимуме их действия (рН 8,0 и 9,0 для нативного и иммобилизованного соответственно) при температуре 20°. В реакции гидролиза АТНА и БТНА активность определяли спектрофотометрически, в реакции гидролиза АТЭЭ и БТЭЭ - потенциометрически.
Спектрофотометрический метод. Активность определяли на спектрофотометре EPS-124 (Hitachi, Япония) при длине волны 390 нм (0,05 М Na-фосфатный буфер). Концентрации субстратов варьировали от 0,025 до 0,32 мМ. Коэффициент экстинкции продукта (р-нитроанилида) определяли независимо для каждой использованной концентрации ДМСО в водно-органической смеси.
3,0 -
Константы индивидуальных стадий гидролиза a-химотрипсином субстратов, использованных в работе
ч о
е 2,0 J
1,0 ф
® □
® □
АТЭЭ БТЭЭ АТНА БТНА
® □
10
20 30
[ДМСО], об.%
Субстрат k2, c-1 кз, c-1 к c-1 ^кат? ^
Этиловый эфир N-ацетил-Ь-тирозина [8] 5000 200 192
Этиловый эфир N-бензоил-Ь-тирозина [8] 249 131 85,9
р-Нитроанилид N-ацетил-Ь-тирозина k2 << кз 0,041
р-Нитроанилид N-бензоил-Ь-тирозина [5] к2 << кз 0,100
Рис. 1. Зависимость относительных максимальных скоростей реакции гидролиза АТЭЭ, БТЭЭ, АТНА и БТНА нативным a-химотрипсином от концентрации ДМСО в смеси (20°, рН 8,0)
Потенциометрический метод. Активность определяли на рН-стате RTS-822 (Radiometer, Дания). Объем ячейки 5 мл, ионная сила создавалась 0,2 М NaCl и 0,02 M CaCl2. Концентрации субстратов варьировали от 2,5 до 10 мМ.
Максимальные скорости реакций и константы Михаэ-лиса для реакций гидролиза различных субстратов нативным и иммобилизованным a-химотрипсином определяли из зависимостей начальных скоростей гидролиза от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка.
Результаты и их обсуждение
Данные по изменению относительных максимальных скоростей реакции гидролиза различных субстратов нативным a-химотрипсином в зависимости от концентрации ДМСО в смеси приведены на рис. 1, где показано, что кинетическое поведение a-химотрипсина в смесях вода -ДМСО сильно зависит от используемого субстрата. Определяющим фактором здесь являются вовсе не природа гидролизуемой связи (рис. 1) и не скорость-лимитирую-щая стадия гидролиза субстрата (таблица), а структура N-заместителя аминогруппы L-тирозина. Если кинетические данные по гидролизу эфирного и нитроанилидного N-бензоил-замещенных субстратов практически идентичны, то смена N-заместителя на ацетильную группу приводит к появлению существенных различий в наблюдаемой кинетической картине (резкое падение активности уже в низких концентрациях ДМСО для эфирного субстрата и значительная активация в тех же концентрациях ДМСО для нитроанилидного субстрата).
Очевидно, что подобное различие в поведении натив-ного a-химотрипсина при гидролизе разных субстратов является следствием того, что ДМСО специфическим образом взаимодействует с белковой глобулой, по всей вероятности, в районе сорбционного участка Rj-группы субстрата. Известно, что связывание Rj-остатка расщепляемого субстрата в активном центре a-химотрипсина происходит за счет гидрофобных взаимодействий с остатками Ile99 и (или) Trp215 [10]. При этом субстраты, имеющие более гидрофобный N-бензоильный заместитель, связываются a-химотрипсином значительно более эффективно (уменьшение уровня стандартной свободной энергии фермент-субстратного комплекса при переходе от N-аце-тильных к N-бензоильным производным аминокислот составляет 2,7-2,9 ккал/моль [11]). Таким образом, если молекула ДМСО способна занимать карман сорбции Rj-группы субстрата, то можно предположить, что на стадии
>
i
s >
1,5
1,0 $
0,5
@
О 0 в ni
О АТЭЭ
® ЕТЭЭ
б АТНА
□ ЕТНА
10
30
[ДМЭО], об.%
50
Рис. 2. Зависимость относительных максимальных скоростей реакции гидролиза АТЭЭ, БТЭЭ, АТНА и БТНА а-химотрипсином, иммобилизованным в поли-АА гель, от концентрации ДМСО в смеси (20°, рН 9,0)
образования фермент-субстратного комплекса К-бензо-ильный заместитель способен к вытеснению этой молекулы (структуры образованных в воде и смесях вода -ДМСО фермент-субстратных комплексов идентичны), в то время как для существенно менее гидрофобной ацетильной группы такое вытеснение энергетически невыгодно.
Косвенным подтверждением данного вывода является характер изменения значения констант Михаэлиса использованных субстратов. Если для К-бензоил-замещенных субстратов величины Кт в пределах ошибки эксперимента не зависят от концентрации ДМСО в смеси, то для К-ацетил-замещенных производных уже в минимальных концентрациях ДМСО происходит примерно двукратное увеличение величины Кт, после чего значение константы вновь становится постоянным. Это говорит о том, что ДМСО не влияет на связывание К-бензоил-замещенных субстратов, но ухудшает взаимодействие их К-ацетил-со-держащих аналогов с активным центром а-химотрипсина.
Таким образом, в смесях вода - ДМСО а-химотрип-син, предположительно, катализирует гидролиз К-бензоил-замещенных субстратов из «нативной» структуры фермент-субстратного комплекса, в то время как при использовании К-ацетил-замещенных субстратов гидролиз осуществляется из некоей его структурной модификации, образовавшейся в результате взаимодействия белковой глобулы с молекулами ДМСО. Как видно из зависимостей максимальных скоростей реакций гидролиза К-ацетил-за-
мещенных субстратов от концентрации ДМСО в реакционной смеси (рис. 1), такое изменение структуры активного центра фермента (или фермент-субстратного комплекса) вызывает возникновение двух параллельных процессов -уменьшение величины k3 (АТЭЭ, рис. 1) и увеличение величины Ц (АТНА, рис. 1). Результатом является смена ско-рость-лимитирующей стадии гидролиза АТНА a-химотрип-сином.
Для проверки предположения о возникновении конфор-мационных изменений в районе активного центра фермента в смесях вода - ДМСО было исследовано кинетическое поведение a-химотрипсина, ковалентно иммобилизованного в поли-акриламидный (поли-АА) гель (многоточечная ковалентная иммобилизация белков - один из наиболее широко применяемых методов протектирования ферментов против конформационных изменений). Как видно из рис. 2, ужесточение нативной конформации a-химотрип-сина в результате многоточечного связывания с носителем действительно стабилизирует белковую глобулу от разворачивания (напомним, что нативный a-химотрипсин денатурирует уже при 30 об.% ДМСО в смеси, в то время как иммобилизованный препарат демонстрирует достаточно большой процент сохранения активности вплоть до 40 об.% ДМСО). Самое интересное, однако, заключается в том, что для иммобилизованного фермента зависимости максимальных скоростей гидролиза от концентрации ДМСО абсолютно идентичны для всех использованных субстратов. Более того, ход этих зависимостей повторяет ход аналогичных зависимостей для гидролиза N-бензоил-за-мещенных субстратов нативным a-химотрипсином. Отсюда можно сделать вывод о том, что, во-первых, взаимодействие молекул ДМСО с белковой глобулой действительно вызывает конформационные изменения в активном центре a-химотрипсина и, во-вторых, высокая энергия сорбции N-бензоильного заместителя субстрата, как и ужесточение конформации белка в результате многоточечной ковалент-ной иммобилизации, протектирует «нативную» конформа-цию активного центра фермента (фермент-субстратного комплекса) от специфического влияния ДМСО. Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что специфическое взаимодействие ДМСО с a-химотрипсином (предположительно в кармане связывания R^-группы N-за-мещенных аминокислотных субстратов) индуцирует локальные конформационные изменения «нативной» структуры активного центра фермента.
Авторы выражают благодарность В.В. Рыжовой и Н.А. Усковой за синтез субстратов, использованных в данной работе.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (грант № 98-03-32204а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Белова А.Б., Можаев В.В., Левашов A.B., Сергеева
М.В. и др. // Биохимия. 1991. 56. С. 1923.
2. Mojaev V.V., Khmelnitsky Yu.L., Sergeeva M.V., Belova A.B.
// Eur. J. Biochem. 1989. 184. P. 597.
3. Moresoli Ch., Zaza Ph., Flaschel E., Renkel A. // Biocatalysis. 1992. 5. P. 203.
4. Еремеев Н.Л., Беляева E.A., Казанская Н.Ф. // Биоорг. хи-
мия. 1999. 25. С. 444.
5. Gladilin A.K., Kudryashova E.V., Vakurov A.V. // Biotechnol. Lett. 1995. 17. P. 1329.
6. Kudryashova E.V., Gladilin A.K., Vakurov A.V. // Biotechnol. Bioeng. 1997. 55. P. 267.
7. Клесов A.A., Березин И.В. Ферментативный катализ. М., 1980. С. 107.
8. Клесов A.A., Березин И.В. Ферментативный катализ. М.,
1980. С. 115.
9. Еремеев Н.Л., Сиголаева Л.В., Казанская Н.Ф. // Вестн.
Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1992. 33. С. 511.
10. Segal D., Powers J.C., Cohen G.H. // Biochemistry. 1971. 10. P. 3728.
11. Клесов A.A., Цетилин В.И. // Биоорг. химия. 1977. 3. С. 1523.
Поступила в редакцию 20.06.00
