CC BY
69
2001
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра
Том 129
Г.Ю.Клычкова, Т.Н.Пивненко
ИНГИБИТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ АКУЛ И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА
Хрящевая ткань акул представляет интерес как потенциальный источник, содержащий антиангиогенные факторы, так как эндоскелет этих животных образован целиком из хряща, содержание которого составляет 6 % массы тела (0,6 % - у телят). Антиангиогенное действие компонентов хрящевой ткани акул связывают с низкомолекулярными белками, которые, возможно, являются тканевыми ингибиторами металлопроте-иназ (ТИМП). В последние годы интенсивно исследовалась роль ТИМП в регуляции матриксных металлопротеиназ (ММР) в процессах ангио-генеза in vitro (Moses, Langer, 1991), деструкции хряща in vivo (Alverez, 1990), инвазии опухоли (De Clerk et al., 1991). В настоящее время известны аминокислотная последовательность и ингибиторные свойства двух ТИМП (Stetler-Stevenson et al., 1989; Boone et al., 1990). Наиболее распространенным ингибитором является ТИМП-1 - гликопротеин с Мм 30 кДа, в меньших количествах встречается ТИМП-2 - негликозилиро-ванный белок с Мм 23 кДа, они вырабатываются некоторыми клетками и легко экстрагируются из хряща. Оба ингибитора связаны с ММР не-ковалентно, при освобождении из комплекса ТИМП-ММР они активируются и, вероятно, не изменяются (Murpfy et al., 1989). ТИМП не обнаруживают какой-либо гомологии с другими известными белками.
Получение нового и эффективного антиколлагенолитического фактора поможет предотвратить такие болезни, как артрит, псориаз, атеросклероз, рак, преждевременное старение. А так как ангиогенез, воспалительные процессы и изменения активности протеаз (подобных коллаге-назам) могут быть вовлечены по отдельности или в сочетании в широкий круг патологий, то наибольшую ценность будут представлять препараты, способные ингибировать подобные процессы, не нарушая нормальных функций организма.
Впервые хрящевую ткань акул начали использовать как источник лекарственных соединений с 50-х гг. прошлого века (Prudden, 1957). В настоящее время среди исследователей ведется спор о том, обладает ли хрящевая ткань акулы выраженным лечебным действием. Известно несколько способов получения экстрактов акульего хряща и его фракций (Oikawa, 1990; пат. WO 96/23512 РСТ/СА 95/00617; пат. 2157695). Новый, отличающийся от предыдущих способ разработан в лаборатории
74
прикладной биохимии ТИНРО-центра (Пат. 2161002). Он предлагает получение препарата, представляющего собой ферментативный гидроли-зат. В опытах на мышах этот препарат показал способность к профилактике и лечению экспериментальных опухолей, индуцированных бензопи-реном, однако его действующее начало не выяснено.
Цель работы заключалась в определении ингибиторной активности в препаратах из хрящевой ткани акул как вероятного действующего фактора, ее изменения до и после ферментативного гидролиза и в исследовании ингибиторной специфичности.
Материалом исследования служила хрящевая ткань полярной акулы Somniosus antarcticus. Использовали измельченную сублимированную ткань целиком и препарат, полученный методом ферментативного гидролиза. Для анализа ингибиторной специфичности использовали пи-лорин из пилорических придатков тихоокеанских лососей, гепатопанк-реатин из гепатопанкреаса камчатского краба, полученные в ТИНРО (Пивненко и др., 1990), а также химопсин из поджелудочной железы крупного рогатого скота производства завода медпрепаратов г. Санкт-Петербург. В качестве субстратов применяли: казеин по Гаммерстену (НПО «Биолар», Латвия), коллаген из гольевого порошка (НПО «Био-лар», Л атвия), этиловый эфир N-бензоил-Ь-тирозина (БТЭЭ), метиловый эфир N-тозил-Ь-аргинина (ТАМЭ) («Sigma», США). Эстеразную активность определяли по методу Шверта и Такенака (Schwert, Takenaka, 1955).
Коллагено- и казеинолитическую активность определяли путем установления количества низкомолекулярных растворимых белковых компонентов, образующихся при ферментативном гидролизе субстрата и определяемых спектрофотометрически при длине волны 280 нм. При этом для казеина количество пептидов определяли во фракции, не осаждаемой 5 % ТХУ (рН 8,0, время 10 мин, температура 30 ° С), а для коллагена - после фильтрации суспензии гидролизованного субстрата (рН 8,0, время 240 мин, температура 37 °С).
Влияние препаратов на активность протеолитических ферментов устанавливали по изменению эстеразной, коллагено- и казеинолитичес-кой активности в указанных выше ферментных препаратах при инкубации в присутствии различных концентраций хрящевых препаратов через определенные промежутки времени.
Для получения ферментативного гидролизата из хрящевой ткани акул был взят комплексный препарат из гепатопанкреаса краба (гепато-панкреатин), так как именно этот препарат имел наибольшую протеоли-тическую и коллагенолитическую активность и обеспечивал наиболее глубокий гидролиз коллагена, преобладающего белка хрящевой ткани. В дальнейшем изучали ингибиторную активность полученного таким способом ферментативного гидролизата (ФГ) и сравнивали ее с активностью исходной ткани - сублимированного хряща (СХ). Сравнение проводили на трех видах ферментных препаратов: гепатопанкреатине, пилори-не и химопсине. Первые два препарата содержат сходные по субстратной специфичности ферменты и могут быть использованы для получения гидролизатов. Химопсин, полученный из поджелудочной железы крупного рогатого скота, содержит трипсин и химотрипсин, которые наиболее изучены и способны служить модельными образцами ферментов млекопитающих.
Для определения специфичности ингибиторного действия компонентов хрящевой ткани исследовали их влияние на активность ферментов по различным видам белковых и специфических низкомолекулярных субстратов.
Результаты исследования показали, что ФГ и СХ ингибируют кол-лагенолитическую активность пилорина даже при очень низких концентрациях. На коллагенолитическую активность гепатопанкреатина препараты из хрящевой ткани акул также оказали ингибирующее действие, но в данном случае более эффективным оказался СХ.
Общая протеолитическая активность, определенная по распаду растворенного казеина, снижалась незначительно под действием обоих ингибиторов, при этом ФГ оказался более эффективным. Следует отметить скачкообразный характер изменения казеинолитической активности под действием возрастающих концентраций ингибитора. Для гепатопанкре-атина тормозящий эффект ФГ почти в 20 раз превосходит наблюдаемый для СХ. В таблице представлены величины I - равновесной ингиби-торной константы, величина которой обозначает концентрацию ингибитора, вызывающую 50 %-ное торможение активности фермента. Значения I были рассчитаны по графикам зависимости степени ингибирова-ния от концентрации ингибитора при использовании линейного способа приближения и установке доверительного интервала 0,95 в системе STATISTICA (Stat Soft Inc. USA).
Равновесная ингибиторная константа (I50 ) для препаратов из хрящевой ткани, мг I/мг E Inhibited constant for préparations from cartilage tissue, mg I/mg E
Ферментный препарат Субстрат Для СХ Для ФГ
Пилорин Казеин 0,32 0,20
Коллаген 0,014 0,014
Гепатопанкреатин Казеин 17,2 0,93
Коллаген 0,19 0,41
Примечание. Исходные величины активностей: пилорина - коллагенолитическая 0,082 Е/г мин, казеинолитичес-кая 140 Е/г; гепатопанкреатина - коллагенолитическая 0,096 Е/г мин, казеинолитическая 375 Е/г.
Таким образом, препараты из хрящевой ткани акул проявляют различное ингибирующее действие на протеиназы лосося и краба, ранее определенные как близкие по субстратной специфичности (Пивненко, 1997). При этом значительное снижение антиколлагенолитической активности для гепатопанкреатина может быть следствием разрушения факторов хрящевой ткани, ингибирующих именно эти ферменты, а повышение антиказеинолитической активности - действием на другие протеиназы из этого комплексного препарата. Взаимодействие препаратов из хрящевой ткани с пилорином может указывать на различия как в субстратной специфичности отдельных ферментов, так и в количественном составе отдельных ферментов в суммарных препаратах.
Так как используемые нами препараты ферментов являются комплексными (в состав входят протеиназы трипсинового и химотрипсино-вого типа), то нами было исследовано влияние ФГ и СХ на активность ферментных препаратов по трипсин- и химотрипсин-специфичным синтетическим низкомолекулярным субстратам. В качестве субстратов ис-
76
пользовали эфиры, содержащие в своем составе только одну аминокислоту (соответственно аргинин и тирозин), что позволило определить класс протеиназ, специфичный к действию активных компонентов хрящевой ткани акул.
На рис. 1 показана зависимость эстеразной активности химотрип-синов различного происхождения от концентрации препаратов из хрящевой ткани акул. Для бычьего химотрипсина (рис. 1, С), наиболее близкого по свойствам к аналогичным ферментам человека, отмечено противоположное влияние ФГ и СХ. Первый проявляет себя как ингибитор, второй - как активатор. Кривые, определяющие зависимость активности химотрипсина из пилорина (рис. 1, А) и гепатопанкреатина (рис. 1, Б) от концентрации ингибиторов, располагаются в одном диапазоне, и их отклонения от нулевых точек (величин активности в отсутствии эффекторов) достаточно малы, находятся в пределах ошибки измерения и не позволяют говорить о присутствии какого-либо значительного эффекта.
Рис. 2 отображает влияние препаратов на эстеразную активность трипсиновых протеиназ пилорина (рис. 2, А), гепатопанкреатина (рис. 2, Б) и химопсина (рис. 2, С). Результаты исследования показывают отсутствие выраженного тормозящего действия препаратов из хрящевой ткани акул на трипсин-специфичные ферменты. Во всех случаях наблюдается ингибиторное действие ФГ, наиболее выраженное для химопсина. При этом даже дальнейшее 20-кратное увеличение концентрации ингибитора не приводит к каким-либо изменениям.
На рис. 3 приведены кинетические кривые инактивации эстераз-ной активности химопсина по химотрипсин-специфичному субстрату во времени. Для СХ характер ингибирования соответствует кинетике реакций первого порядка, для высоких концентраций ФГ наблюдается аналогичная зависимость, при более низких концентрациях ФГ полученные зависимости приобретают иной порядок, соответствующий двум стадиям ферментативной реакции: более быстрой и медленной. Последнее обстоятельство может свидетельствовать об образовании обратимого комплекса.
Таким образом, установлено присутствие ингибиторов протеиназ в хрящевой ткани акул. При этом наиболее высока эффективность торможения коллагенолитической активности, проявляющаяся даже при очень низких концентрациях. Значительный антиколлагенолитический эффект наблюдается как в исходной, так и в подвергнутой ферментативному гидролизу ткани. Для общей протеолитической активности (субстрат -казеин) наблюдается увеличение эффективности тормозящего действия продуктов ферментативного гидролиза. Установлена ингибиторная специфичность этих компонентов, воздействующих на химотрипсинподоб-ные ферменты, а среди них наиболее сильно на химотрипсин млекопитающих.
Полученные на настоящий момент результаты позволяют поставить под сомнение выводы о снижении и даже исчезновении эффективности активных компонентов хрящевой ткани акул после обработки эндогенными ферментами (Пат. 2157695). Дальнейшие исследования требуют выделения ингибиторов из гидролизованной хрящевой ткани и уточнения ингибиторной специфичности с привлечением более широкого спектра протеиназ, в том числе матричных металлопротеиназ.
77
Oikawa J. A novel angiogenic in hibitor derived from Japanese shark cartilage // Cancer letters. - 1990. - Vol. 51. - P. 181-186.
Prudden J. The acelerration of wound healing with cartilage // Surg. Gynecol. Obstet. - 1957. - P. 105-283.
Schwert G.W., Takenaka J. A spectrophotometry determination of tripsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. - 1955. - Vol. 16, № 47. - P. 570575.
Stetler-Stevenson W.G., Krutzsch H.C., Liotta L.A. Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-2). A new member of metalloproteinase inhibitor family // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol. 264, № 29. - P. 17374-17378.
Поступила в редакцию 18.05.2001 г.
