CC BY
104
2006
Известия ТИНРО
Том 146
УДК 664.959
В.В. Давидович, Т.Н. Пивненко
ВЛИЯНИЕ ЛИПОФИЛЬНОСТИ РЕАКЦИОННОЙ СРЕДЫ НА ПРОЦЕСС ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА В ТЕХНОЛОГИИ БАД "МОЛЛЮСКАМ"
Исследовано влияние различных концентраций этанола на активность ферментов. Предложено модифицировать метод ферментативного гидролиза при получении БАД к пище "Моллюскам" путем увеличения липофильности реакционной среды, заменив на стадии ферментирования водный раствор реакционной смеси на водно-спиртовый. Наблюдающиеся различия в ходе процесса и качестве конечного продукта соответствовали изменениям субстратной специфичности, скорости и глубины гидролиза. Низкие концентрации этанола в реакционной смеси позволили увеличить активность ферментных препаратов, сократить время проведения гидролиза до 2,5 ± 0,5 ч (в зависимости от используемого вида сырья и ферментного препарата), увеличить степень гидролиза (на 9,7 ± 8,6 %), повысить выход свободных аминокислот на 4,3 ± 2,6 %, увеличить выход готового продукта, снизить микробную обсемененность в процессе гидролиза.
Davidovich V.V., Pivnenko T.N. Influence of reactionary environment lipo-phility on the process of enzyme hydrolysis in the technology of "Molluskam" preparation // Izv. TINRO. — 2006. — Vol. 146. — P. 300-305.
Technologies of BASF preparation from marine organisms based on the method of enzyme hydrolysis, developed in TINRO-centre, allow to receive products enriched with free amino acids and oligonucleotides useful for stimulation of cardiovascular system, functions of eyesight, physical and intellectual abilities. The process of hydrolysis is enhanced sufficiently by water solution replacement by water-ethanol mixture on the stage of fermentation. Organic solvents, as the low-concentrated ethanol, are able to influence on an active center of enzyme that increases the speed of reaction and changes the substrate specificity.
The enhanced technology was tested on the enzyme hydrolysis of the tissues of bivalves and fish milts (for the BASF "Moluskam" and "Nucleatin" production), on pancreatic tissue (for hepatopancreatin and pilorin), and on bacterial raw material (for megaterin and protomex). Influence of the ethanol concentration on enzymes activity was investigated by modeling substrata using. Enzyme activity increased in condition of low ethanol concentrations in all cases, with exception of protomex preparation. The threshold values of the ethanol concentration influence were determined. In the cases of water-ethanol mixture using, the time of hydrolysis was shortened twice, output of free amino acids increased, in particular for leucine, glutamic acid, and lysine.
The developed technology is introduced in industrial process.
В ТИНРО-центре разработаны промышленные технологии БАД к пище, включающие как основную стадию ферментативный гидролиз ("Моллюскам", "Нук-леатин", "Артротин") (Пат. РФ № 2171066, № 2250047). Стадия ферментативного гидролиза — наиболее длительная и лабильная во всем технологическом цикле. Для того чтобы уменьшить время реакции, увеличить количественный
выход целевого продукта, а также регулировать его состав, предложена новая модифицированная технология.
Известно, что некоторые органические растворители обладают активацион-ными эффектами при взаимодействии с ферментными препаратами (Беляева, Еремеев, 2000). Ряд авторов (Белова и др., 1991; Еремеев и др., 1999) полагает, что замещение воды в гидратной оболочке белковой глобулы на молекулы органического растворителя приводит к ее структурным изменениям, неспецифическое влияние органических растворителей на показатели связывания субстратов с ферментами определяется увеличением растворимости субстратов при увеличении липофильности среды. Специфическое влияние зависит от природы растворителя, который может выступать в роли конкурентного ингибитора. Кроме того, известно, что в случае реакций, в которых одним из продуктов является вода, изменение липофильности среды позволяет сдвинуть равновесие в сторону целевых продуктов (Пяллин, 1979). При этом важно установить, в какой степени в таких растворах сохраняется специфичность и каталитическая активность ферментов.
Целью настоящей работы явилась разработка метода регуляции скорости, глубины и специфичности ферментативного гидролиза при получении БАД к пище "Моллюскам" путем добавления в реакционную смесь низких концентраций этилового спирта.
В качестве объектов исследования использовали ферментативные гидроли-заты двустворчатых моллюсков (приморского гребешка Mizuhopecten yessoensis, мидии Mytilus trossulus), являющиеся основой БАД к пище "Моллюскам"; ферментные препараты — гепатопанкреатин из гепатопанкреаса камчатского краба, пилорин из пилорических придатков лососевых рыб, полученные по собственному методу (Пивненко, 1986), мегатерин, выделенный из клеточных культур микроорганизма Bacillus megaterium, протамекс из Bacillus protease.
В качестве субстрата для определения протеолитической активности использовали казеин по Гаммерстену.
Для определения общей протеолитической активности использовали 2 %-ный раствор казеина (в растворимое состояние переводили нагреванием в течение 15 мин) в 0,05 М фосфатном буфере рН 8,0. К раствору субстрата добавляли 2 мл 0,5-1,0 %-ного раствора ферментного препарата, выдерживали в течение 10 мин при температуре 37 0С, реакцию останавливали добавлением трихлоруксусной кислоты, образовавшийся осадок отфильтровывали и измеряли оптическую плотность при X = 280 нм против контрольного раствора, полученного добавлением к 2 мл раствора субстрата 4 мл 5 %-ной трихлоруксусной кислоты, а затем 2 мл раствора ферментного препарата с последующей фильтрацией.
За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к увеличению поглощения при 280 нм на 1 оптическую единицу за 1 мин (единица измерения удельной активности — Е/г).
Для определения накопления продуктов гидролиза использовали модифицированный метод Ансона (Алексеенко, 1968).
Установление состава аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе "Hitachi-935" (Япония) после гидролиза БАД "Моллюскам" в 6 н. HCl в ампулах, запаянных под вакуумом, при температуре 110 0С в течение 24 ч с последующим упариванием раствора образца под вакуумом.
Микробиологические исследования были проведены в лаборатории биотехнологии и микробиологии ТИНРО-центра к.б.н. Г.И. Загородней.
С целью увеличения выхода целевого продукта и степени гидролиза нами были испытаны различные приемы, в частности добавление некоторых реагентов, влияющих на свойства протеолитических ферментов, а также являющихся консервантами и антисептиками.
Известно, что при достаточно высоких концентрациях органических растворителей для сериновых протеиназ наблюдается изменение субстратной специфичности. Так, для химотрипсина одним из требований к субстратам является наличие определенной протяженности гидрофобных участков. В присутствии же органических растворителей химотрипсин теряет выраженную специфичность к наличию гидрофобности различных субстратов (Пяллин, 1979). Эти установленные ранее факты позволили нам предположить, что проведение реакции ферментативного гидролиза при получении БАД "Моллюскам" в присутствии органических растворителей позволит изменить в определенной степени ход реакции и, возможно, повысить глубину гидролиза за счет изменения субстратной специфичности сериновых протеиназ.
Первоначально нами было исследовано влияние различных концентраций этанола на активность ферментов с использованием модельного субстрата казеина. Концентрация спирта в реакционной смеси составляла 5, 10 и 15 %. Гидролиз проводили при температуре 37 0С, концентрация фермента 0,2 % по отношению к субстрату (рис. 1).
пилорин
гепатопанкреатин
о и
Е
о
150
100
150
100
[этанол], % мегатерии
[этанол], % протамекс
150
100
U
О
5 10 "■'■ 15
[этанол], %
150
100
50
л
S
О
10 15
[этанол], %
20
Рис. 1. Влияние различных концентраций этанола на активность ферментных препаратов: п.т. — пороговая точка; субстрат — казеин; соотношение фермент : субстрат — 2 мг/г; t — 37 ± 2 0С; время — 3,5 ч
Fig. 1. Influence of various concentration ethanol on enzyme's activity of preparations: п.т. — threshold point; substratum — casein; ratio enzym : substratum — 2 mg/g; t — 37 ± 2 0С; time — 3.5 hours
Из полученных данных видно, что добавление низких концентраций этанола увеличивает активность ферментных препаратов, исключение составляет только протамекс, активность которого практически сразу снижается. Повышение концентрации спирта выше 20 % сочли нецелесообразным в связи с частичной или полной инактивацией ферментных препаратов. Наиболее эффективная концентрация этилового спирта в реакционной смеси — 10 %.
Эксперименты были продолжены с использованием мидии и мантии гребешка. Было проведено сравнение содержания свободных аминокислот (САК) в гид-ролизатах, полученных как в присутствии этанола, так и без него (табл. 1).
Таблица 1
Содержание САК в гидролизатах, полученных в присутствии 10 %-ного этилового спирта, ферментный препарат — гепатопанкреатин, % от общей массы
Table 1
Contents of free amino acids in the preparations received by enzyme's hydrolysis, at the presence of 10 % ethanol, used enzyme hepatopankreatin,
% total mass
Гидролизат Гидролизат
Аминокислоты (контроль) (10 %-ная водно-спиртовая смесь)
мидии мантии гребешка мидии мантии гребешка
Таурин 7,06 3,93 7,05 4,00
Гистидин 1,23 0,88 1,49 1,40
Пролин 4,20 3,72 4,78 3,96
Дикарбоновые 9,55 7,27 11,03 11,33
Серусодержащие 2,79 3,16 1,27 1,64
Основные 9,85 9,78 12,62 8,47
Ароматические 7,47 9,03 8,63 11,45
Нейтральные 6,77 6,38 6,76 6,40
Алифатические 19,83 18,35 21,66 19,04
Сумма 68,75 62,50 75,29 67,69
Примечание. p < 0,05.
Использование водно-спиртовой смеси позволило в большинстве случаев увеличить выход практически всех аминокислот, при этом наибольшее увеличение содержания отмечено для лейцина, глутаминовой кислоты и лизина, а содержание таурина, как и следовало ожидать, осталось на прежнем уровне. Присутствие этанола позволило сократить время проведения гидролиза в среднем до 2,5 ч в зависимости от используемого ферментного препарата и вида сырья (рис. 2).
А
Время, ч
^пилорин - - - гепатопанкреатин
" мегатерин ™™ _протамекс
Время, ч
^^^^пилорин ■ " " гепатопанкреатин
™™ " мегатерин ™™ _протамекс
Рис. 2. Динамика скорости гидролиза сырья различными ферментными препаратами: А — контроль, Б — водно-спиртовая смесь. Субстрат — мантия гребешка
Fig. 2. Speed hydrolysis dynamics of raw material by various enzymes preparations: A — control, Б — water-ethanol mix. Substratum — scallop mantle
На экспериментальном участке по производству БАД ТИНРО-центра были получены опытно-промышленные партии препарата при проведении ферментативной реакции в водно-спиртовой смеси. Установлено, что при использовании в процессе гидролиза ферментного препарата "Протамекс" (с пороговой концентрацией этанола 3 %) выход готового продукта увеличился по сравнению с контролем на 20 ± 5 % при 1,5 %-ной концентрации этанола в водно-спиртовой смеси.
Микробиологические исследования проводили на всех технологических стадиях, в том числе исследовали динамику роста микроорганизмов в процессе ферментолиза (рис. 3). В контрольных партиях без добавления спирта происходило увеличение общего микробного числа. Следует отметить, что на стадии инактивации фермента как в контрольных, так и в опытных образцах значение общего микробного числа снижалось и было в пределах нормы. Однако различие было весьма существенным: 1,1 ' 104 в контроле и 2,0 ' 103 в опытных образцах.
14
2 10
ш О
X <
в <
Контроль ■ Опыт
Рис. 3. Влияние этанола на развитие микрофлоры: а — начало гидролиза, б — через 1 ч, в — через 2 ч, г — через 3 ч, д — после инактивации
Fig. 3. Ethanol influence on microflora development: a — beginning hydrolysis, б — 1 h, в — 2 h, г — 3 h, д — after inactivation
Таким образом, метод ферментативного гидролиза при получении БАД к пище "Моллюскам" можно модифицировать путем увеличения липофильности реакционной среды, заменив на стадии ферментирования водный раствор реакционной смеси на водно-спиртовый. Наблюдавшиеся в ходе процесса и качестве конечного продукта различия соответствовали изменениям субстратной специфичности, скорости и глубины гидролиза. Низкие концентрации этанола в реакционной смеси позволили увеличить активность ферментных препаратов, сократить время проведения гидролиза до 2,5 ± 0,5 ч (в зависимости от используемого вида сырья и ферментного препарата), увеличить степень гидролиза (на 9,7 ± 8,6 %), повысить выход свободных аминокислот на 4,3 ± 2,6 %, увеличить выход готового продукта, снизить микробную обсемененность в процессе гидролиза.
Литература
Алексеенко Л.П. Современные методы в биохимии. — М.: Медицина, 1968. — Т. 2. — 112 с.
Белова А.Б., Можаев В.В., Левашов A.B. и др. Взаимосвязь физико-химических характеристик органических растворителей с их денатурирующей способностью по отношению к белкам // Биохимия. — 1991. — Т. 56, вып. 11. — С. 1923-1945.
Беляева Е.А., Еремеев Н.Л. Кинетическая демонстрация локальных конформа-ционных изменений вблизи активного центра а-химотрипсина в смесях вода—диметил-сульфоксид // Вестн. МГУ. Сер. 2, Химия. — 2000. — Т. 41, № 6. — С. 392-394.
Еремеев Н.Л., Беляева Е.А., Казанская Н.Ф. Влияние фазового перехода поли-N-изопропилакриамидного геля в смеси вода/диметилсульфоксид на кинетические закономерности функционирования иммобилизованного а-химотрипсина // Биоорган. химия. — 1999. — Т. 25, № 6. — С. 444-449.
Пат. № 2171066 РФ. Продукт, обогащенный свободными аминокислотами, и способ его получения / Т.Н. Пивненко, Л.М. Эпштейн, В.В. Давидович, Ю.М. Позднякова. Заявлено 22.03.2000; Опубл. 27.07.2001.
Пат. № 2250047 РФ. Пищевой общеукрепляющий профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов и способ его получения / Т.Н. Пивненко, Г.Ю. Клычко-ва, Л.М. Эпштейн и др. Заявлено 18.11.2003; Опубл. 20.04.2005.
Пивненко Т.Н. Трипсиноподобные протеазы дальневосточных лососей: Дис. ... канд. биол. наук. — Киев, 1986. — 176 с.
Пяллин Р.А. Влияние органических растворителей на взаимодействие а-химо-трипсина с фосфорорганическими ингибиторами: Дис. . канд. хим. наук. — Таллин, 1979.
Поступила в редакцию 24.04.06 г.
