CC BY
32
УДК 543.253
Г.К. Яруллина, А.К. Евсеев1, Т.Г. Царькова, Ю.А. Курилкин1
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва, Россия
РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ЭКСПРЕСС-МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД
Разработана электрохимическая методика определения уровня антиоксидантной активности биологических сред. Отмечена высокая корреляция полученных результатов с данными, полученными спектрофотометрическим методом TAS. Исследован уровень антиоксидантной активности плазмы крови практически здоровых людей, выявлен коридор
референсных значений уровня антиоксидантной активности в диапазоне 1,34±0,22 ммоль/л. Обнаружена корреляция уровня антиоксидантной активности и величин редокс потенциала плазмы крови пациентов с трансплантированными органами.
An electrochemical method for determination the antioxidant activity level of biological media was developed. The high correlation of results with those obtained by spectrophotometric method TAS was noted. The antioxidant activity level of blood plasma of practically healthy people has been investigated and found the reference values of the corridor of antioxidant activity level in the range of 1,34 ± 0,22 mmol/l. The correlation between the antioxidant activity level and blood plasma redox potential values of patients with transplanted organs was determined.
В настоящее время расширяется поиск новых методов анализа для использования в медицинской лабораторной практике, которые обладают селективностью, высоким уровнем чувствительности и экспрессностью.
Особый интерес вызывают электрохимические методы анализа биологических сред организма, которые, как правило, отвечают перечисленным выше основным требованиям.
Ценность информации, полученная с помощью указанных выше методов, состоит в том, что уровень детектируемых биологически активных веществ, как правило, отражает работу функциональных систем организма и может свидетельствовать о наличии неблагоприятных процессов, протекающих в организме. Это особенно важно для выявления различных патологических состояний на ранней стадии их развития.
Благодаря развитию представлений о роли свободнорадикальных процессов [1], протекающих в организме, и их связи с работой антиоксидантной системы все больше внимания уделяется оценке эффективности ее работы. В нормально функционирующем организме человека существует баланс между прооксидантами, т.е. активными формами кислорода (АФК) и свободными радикалами, и компонентами системы антиоксидантной защиты. Нарушения этого баланса при заболеваниях различной этиологии могут приводить к окислительным стрессам либо к замедлению свободнорадикальных процессов, т.е. к нарушениям процессов естественного метаболизма.
Известно, что в организме человека существует несколько барьеров антиоксидантной системы, обеспечивающих защитную функцию на различных уровнях [2].
1. Первичные антиоксиданты ферменты (глугатионпероксидаза, супероксиддисмутаза), метало-связывающие белки (ферритин и церулоплазмин), которые предотвращают образование свободных радикалов.
2. Вторичные - витамины ЕиС, бета-каротин, мочевая кислота, билирубин и альбумин - способствующие выведению образовавшихся радикалов.
3. Третичные - энзимы, осуществляющие репарацию поврежденных клеточных структур (например, на уровне репарации ДНК).
Таким образом, в настоящее время является важной задача разработки методов анализа прооксидантов и антиоксидантов (АО) в биологических жидкостях организма. Поскольку существующие оптические методы определения антиоксидантной активности требуют использования дорогостоящих реактивов и зависят от интенсивности цветового показателя биологического материала, а электрохимические методы, как правило, либо не обладают достаточной чувствительностью в биологических средах, либо сложны в изготовлении датчиков. Особого внимания в рамках данной проблемы заслуживают вольтамперометрические методы определения антиоксидантов благодаря своей простоте, селективности и экспрессности.
Целью данной работы является разработка электрохимической методики определения уровня антиоксидантой активности (АОА) биологических сред.
Суть метода разрабатываемого метода состоит во взаимодействие окисляющего агента п-бензохинона c биологической средой (уравнение 1), после чего остаточная концентрация п-бензохинона определяется с помощью вольтамперометрической методики (уравнение 2).
В работе использованы п-бензохинон (99,5%, Диаэм), аскорбат натрия (99%, Alfa Aesar), тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксильная кислота 97%, Sigma Aldrich), кверцетин дигидрат (97%, Alfa Aesar). Вольтамперометрические измерения проводили с помощью потенциостата IPC-Pro M (НПФ «Вольта»), рН растворов определяли с помощью рН-метра SevenEasy (METTLER TOLEDO), редокс потенциал измеряли по методике [3].
о он
+ АО —► (1)
+ 2ё + 2Н+
(2)
Прежде всего, были проведены исследования модельных растворов антиоксидантов (аскорбат натрия, тролокс, кверцетин дигидрат) в диапазоне
5 2
концентраций 10-10-2М. Для анализа к 3 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,4) добавляется 1 мл 10-2М водного раствора п-бензохинона и 1 мл анализируемого раствора. Смесь выдерживалась в течении 5 минут при комнатной температуре после чего проводилось электрохимическое определение
остаточной концентрации п-бензохинона. Определение проводилось в трехэлектродной ячейке с платиновым рабочим электродом, хлорсеребряным электродом сравнения и платинированной платиной в качестве вспомогательного электрода. Анализ проводили с помощью циклической развертки потенциала в течении 5 циклов в диапазоне от -600 до +800 мВ со скоростью развертки 500 мВ/с. Концентрацию п-бензохинона определяли по убыли катодного пика при потенциалах -180^-120 мВ мВ (Рис. 1).
,0.3
-700
500 700 900 Е, мВ (х.С.Э.)
-0.3
Рис. 1. ЦВА п-бензохинона. 1 - фоновый раствор (фосфатный буфер), 2 -фон + п-бензохинона), 3 - фон + 10-2М п-бензохинона + 10-3М аскорбата натрия.
На основании данных по анализу модельных растворов антиоксидантов были построены калибровочные зависимости. Отмечено, что все исследованные в работе растворы анитоксидантов показывают линейную зависимость диапазоне концентраций от 10-5-10-3М. Наилучшим коэффициентом корреляции обладает раствор кверцетина дигидрата, который был выбран нами в качестве стандарта уровня антиоксидантной активности.
Для построения коридора референсных значений уровня АОА биологических сред было проведено исследование плазмы крови 30 практически здоровых людей. Было показало, что уровень АОА составляет 0,8^2,0 ммоль/л в расчете на кверцетин дигидрат. При статистической обработке массива 30 практически здоровых людей был получен коридор значений 1,34±0,22 ммоль/л (Рис. 2).
2,5
■5,5 л' с; о
11 <
50,5
10
15 20
25 ..„ 30 35 № пациента
Рис. 2. Данные по уровню антиоксидантной активности плазмы крови практически здоровых людей (30 человек).
2
0
0
5
При сравнении уровня АОА плазмы крови септических пациентов (8 человек), измеренных предлагаемым методом, была обнаружена высокая корреляция со спектрофотометрическим методом (TAS, «Randox») (Рис. 3)
2,5
2
"jñ
3.5
3
0,5
0 0,5 1 1,5 2 2,5
электрохимический метод, ммоль/л
Рис. 3. Сравнение уровня АОА, измеренного электрохимическим и спектрофотометрическим методами. При исследовании пациентов с трансплантированной почкой была обнаружена корреляция уровня АОА с величинами редокс потенциала (Рис. 4). Таким образом, предложенный метод может служить дополнительным критерием оценки состояния пациента с трансплантированными органами. 2,5 г -30
£ 1,5 о
<С 1
0,5
2
-20
-10
т о
m
с
Q.
10
20
0
5
10 15
Время, сутки
20
Рис. 4. Данные уровня АОА (1) и редокс потенциала (2) плазмы крови пациента с
трансплатнированной почкой.
Выводы.
1. Разработана электрохимическая методика определения уровня антиоксидантной активности биологических сред.
2. Отмечена высокая корреляция с используемым в настоящее время дорогостоящим спектрофотометрическим методом.
3. Получен коридор референсных значений уровня антиоксидантной активности практически здоровых людей, который составил 1,34±0,22 ммоль/л.
Библиографические ссылки: 1. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. М.: РКНПК МЗ РФ, 2001. 78 с.
0
2
1
0
0
2. Кишкун A.A. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М.: Медицинский центр ЦБ РФ, 1997. 318 с.
3. М. Ш. Хубутия, A. К. Евсеев, В. A. Колесников и др. Измерения потенциала платинового электрода в крови, плазме и сыворотке крови // Электрохимия. 2010. Т. 46, № 5, С. 569-573.
УДК 517.977.5:541.183
Е.Н. Иванова, М.Б. Алехина, С.Л. Ахназарова
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
ТЕРМИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ ЦЕОЛИТОВ ТИПА X
Методом планирования эксперимента проведен поиск оптимальных условий термической активации цеолитов типа X. Показано, что скорость отработки адсорбционной емкости цеолитов по кислороду в отличие от азота существенно зависит от условий активации.
The method of planning of experiment is carried out search of optimum conditions of thermal activation of type X zeolites. It is established that speed of working off of adsorbtion capacity of zeolites on oxygen unlike nitrogen essentially depends on activation conditions.
Адсорбционные свойства цеолитов по азоту и кислороду очень сильно зависят от условий предварительной подготовки (активации) адсорбентов, которая должна проводиться особенно тщательно перед загрузкой этих адсорбентов в установку разделения воздуха.
Целью активации является приведение цеолита в состояние, при котором он проявляет достаточно высокую активность по азоту, минимальную активность по кислороду и при этом коэффициент разделения смеси азот-кислород имеет наибольшую величину. Поиск оптимальных условий термической активации осуществлялся с использования метода планирования эксперимента, результаты этой работы опубликованы в [1].
В работе был выполнен полный факторный эксперимент 24 с наложенным на него латинским квадратом. В эксперименте рассматривалось влияние пяти количественных факторов: температуры процесса - х1 (300400 оС), скорости нагрева - х2 (2-5 о/мин), количества С02 в продувочном газе (азоте) - х3 (0-1 об. %), продолжительности процесса - х4 (0,5-1,5 ч) и одного качественного: катионного состава цеолита - х5 (NaX, LiMgNaX) -на следующие критерии: остаточное содержание воды в цеолитах после активации - yi, ( г/100 г), равновесные емкости по азоту и кислороду -y2,y3, (см3/г)
и коэффициент разделения смеси азот-кислород - y4= у2/уз.
Четыре фактора (х1,х2,х3,х4) варьировались в эксперименте на двух уровнях, а один - катионный состав цеолита (х5) - на четырёх уровнях. В качестве объектов исследования были выбраны промышленные цеолиты типа X, производства отечественных и зарубежных фирм.
Полученные по плану результаты были использованы для
