CC BY
61
УДК 616.15
Д.В. Тёмин, А.К. Евсеев1, Г.Р. Гараева1, Т.Г. Царькова
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва, Россия
АНАЛИЗ ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОГО БАЛАНСА СЫВОРОТКИ КРОВИ
Проведено сопоставление данных анализа потенциала при разомкнутой цепи и антиок-сидантной активности сыворотки крови практически здоровых людей (n=31). Найдена корреляция величин потенциала при разомкнутой цепи и уровня антиоксидантов сыворотки крови практически здоровых людей. Показана возможность применения комплексного анализа для мониторинга состояния пациентов после трансплантации почки.
The data of the blood serum open circuit potential and antioxidant activity for practically health people (n=31) were analyzed. Correlation between blood serum open circuit potential value with antioxidant activity level for practically health people was found. Simultaneous monitoring of open circuit potential with antioxidant activity level in patient after kidney transplantation was done.
Актуальность оценки баланса про- и антиоксидантной систем организма не вызывает сомнений. Известно, что в нормально функционирующем организма существует равновесие между генерируемыми в процессе жизнедеятельности активными формами кислорода (АФК) и элементами антиоксидантной системы. Нарушения такого баланса при острых заболеваниях различной этиологии могут приводить к окислительным стрессам либо к замедлению радикальных процессов, т.е. к нарушениям процессов очищения внутренней среды организма от продуктов распада.
К активным формам кислорода относят кислородсодержащие радикалы - супероксидный анион-радикал (О2"), гидропероксидный радикал (НО2^) и гидроксил-радикал (НО^), а также пероксид водорода (Н2О2) и ги-похлористую кислоту (НОО). К АФК может быть отнесен также еще один эндогенный кислородный радикал - окись азота (NO^), образующая при взаимодействии с О2- сильный окислитель пероксинитрит (ONOOH) [1].
С другой стороны клетки для защиты от АФК продуцируют специализированные системы: ферментативная антиоксидантная система и не-
ферментативная антиоксидантная система. В качестве неферментативной антиоксидантной системы могут выступать: жирорастворимые и водорастворимые антиоксиданты [2].
В настоящее время для оценки состояния про- и антиоксидантной систем организма, при обилии инструментальных аналитических методов, как правило, внимание уделяется одной из них.
Маркером состояния прооксидантной системы является малоновый ди-альдегид [3], характеризующий процессы перекисного окисления липидов.
С другой стороны, для оценки активности антиоксидантной системы разработано большое количество методов определения антиоксидантов, которые различаются по типу источника окисления, окисляемого соединения и способу его детектирования [4]. Однако, несмотря на большое количество методов, имеются трудности при сравнении результатов, полученных различными исследователями [5].
С электрохимической точки зрения, реакции, характерные для про- и антиоксидантной систем, можно описать сумой окислительно-восстановительных процессов (1):
Ох1 + Яеё2 ^ Ох2 + Яе1 (1)
Если данная реакция осуществляется в электрохимической системе, то она разбивается на два электродных процесса, или две окислительно-восстановительные реакции:
Ох1 + п1е ^ Яе1 (2)
Ох2 + п2е ^ Яеё2 (3)
При погружении в данную систему инертного электрода можно измерить скачок потенциала, описываемый уравнением Нернста:
Е = Ео + ^Т/пЕ>1п(аох/акес1) (4)
Измеряемый потенциал, устанавливающийся на инертном электроде, называют окислительно-восстановительным потенциалом (редокс потенциалом). В отношении биологических сред организма (кровь, сыворотка крови, плазма крови, спинномозговая жидкость) правильнее будет применять термин потенциал при разомкнутой цепи, поскольку на границе раздела фаз электрод/биологическая жидкость протекают не только окислительно-восстановительные процессы и конечный потенциал имеет более
сложную природу. Однако, несмотря на это, величина потенциала при разомкнутой цепи является интегральным отражением окислительно-восстановительных процессов, протекающих в организме [6].
Ряд исследований, сделанных нами ранее [7,8], послужил базисом к созданию комплексного метода определения состояния про- и антиокси-дантных систем организма с помощью разработанных нами электрохимических методов измерения потенциала при разомкнутой цепи и определения общей антиоксидантной активности биологических сред.
Целью данной работы является анализ данных измерения потенциала при разомкнутой цепи и уровня общей антиоксидантной активности сыворотки крови для разработки диагностических критериев оценки состояния пациентов после трансплантации почки.
В работе использованы сульфат натрия (Лабтех, «хч»), сульфит натрия (Лабтех, «хч»), п-бензохинон (Диаэм, «ч»), гидрохинон (Merck, 99%), кверцетин дигидрат (Alfa Aesar, 97%).
Все растворы были приготовлены на бидистиллированной воде, рН измеряли с помощью рН-метра SevenEasy (METTLER TOLEDO).
Сыворотку крови получали центрифугированием цельной крови практически здоровых людей (n= 31) и пациентов после трансплантации почки (n=5) при 1500g в течении 15 мин в центрифуге CR 3.12 (Jouan).
Измерение потенциала при разомкнутой цепи проводили с помощью
гладкого поликристаллического платинового электрода с рабочей площа-
2 2
дью 3,3-10" см , хлорсеребряный электрод использовали в качестве электрода сравнения. Динамика изменения величина потенциала при разомкнутой цепи в течение 30 мин фиксировались в непрерывном режиме с помощью потенциостата IPC-Compact (НПФ «Вольта»). Объем образцов для исследования составлял 2 мл.
Измерение уровня общей антиоксидантной активности проводили с помощью циклической вольтамперометрии. Величину общей антиокси-дантной активности оценивали как снижение величины катодного пика в анализируемом растворе по сравнению с фоновым раствором. Фоновый раствор представлял собой смесь 4 мл фосфатного буфера (рН 7,4) и 1 мл раствора, содержащего эквимолярную смесь (2,5 мМ) бензохинона и гид-
рохинона в фосфатном буфере. Анализируемый раствор представлял собой смесь 3 мл фосфатного буфера, 1 мл эквимолярной смеси (2,5 мМ) бензо-хинона и гидрохинона в фосфатном буфере и 1 мл исследуемой сыворотки крови. Циклическая вольтамперометрия проводилась в течение 5 циклов в диапазоне потенциалов от -600 до +800 мВ (х.с.э.) при скорости развертки потенциала 500 мВ/с. В качестве модельного раствора использовали 10 М раствор кверцетин дигидрата.
При анализе данных величин потенциала при разомкнутой цепи и уровня общей антиоксидантной активности 31 практически здорового человека было обнаружено, что во всех случаях направление и величина сдвига потенциала при разомкнутой цепи совпадает с направлением и величиной сдвига уровня общей антиоксидантной активности сыворотки крови (рис. 1). Данное наблюдение может свидетельствовать о непосредственной связи величины потенциала при разомкнутой цепи с уровнем общей антиоксидантной активности сыворотки крови.
-60 о
Рис. 1. Сравнение потенциала при разомкнутой цепи (ПРЦ, ▲) и уровня общей антиоксидантной активности (ОАА, □) 31 практически здорового человека
Одной из важных задач является выявление взаимосвязи уровня ан-тиоксидантной активности сыворотки крови с патологическими состояниями различной этиологии. Особый интерес представляют пациенты после трансплантации органов, поскольку в послеоперационном периоде пациент постоянно находится на поддерживающей терапии иммуносупрес-сивными препаратами. Кроме того, ранее нами были получены данные [9],
свидетельствующие о значительных сдвигах потенциала при разомкнутой цепи (более 25 мВ) при наличии дисфункции трансплантата.
При одновременном мониторинге потенциала при разомкнутой цепи и уровня общей антиоксидантной активности сыворотки крови у пациентов после трансплантации почки было выявлено, что, как правило, потенциал коррелирует с уровнем антиоксидантной активности сыворотки крови (рис. 2). Однако в ряде случаев была обнаружена противоположная динамика.
Рис. 2. Данные потенциала при разомкнутой цепи (1) и уровня общей антиоксидантной активности (2) сыворотки крови пациента З. с трансплантированной почкой
Так у пациента С. (рис. 3) с 8 по 12 сутки обнаружено смещение потенциала при разомкнутой цепи в отрицательную область потенциалов, сопровождающееся падением уровня общей антиоксидантной активности. Возможно, что данное явление связано с проводимым лечением в послеоперационном периоде. Подобные наблюдения могут сигнализировать о дисбалансе функционирования про- и антиоксидантной систем пациента и необходимости коррекции его лечения. Обнаруженный эффект требует дополнительных исследований.
Таким образом, можно предположить, что отсутствие корреляции величин редокс \потенциала и содержания антиоксидантов в сыворотке крови пациентов после трансплантации почки при одновременном мониторинге этих величин может быть связано с необходимостью коррекции лечения.
Рис. 3. Данные потенциала при разомкнутой цепи (1) и уровня общей антиоксидант-ной активности (2) сыворотки крови пациента С. с трансплантированной почкой
Библиографический список
1. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. - М.: РКНПК МЗ РФ, 2001. - 78 с.
2. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. - Л.: Наука, 1985. - 230с.
3. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и др. - М.: Слово, 2006. - 556 с.
4. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В. Методы исследования ан-тиоксидантов // Химия растительного сырья. - 2004. - №3. - С. 63-75.
5. Яшин Я.И., Яшин А.Я. Проблема определения содержания антиок-сидантов // Компетентность. - 2009. - Т. 69, № 8. - С. 50-53.
6. Plasma Oxidation-Reduction Potential and Protein Oxidation in Traumatic Brain Injury / Rael L.T. [a.o.] // Journal of neurotrauma. - 2009. - Vol. 26. - P. 1203-1211.
7. Measurements of Platinum Electrode Potential in Blood and Blood Plasma and Serum / Khubutiya M. Sh. [a.o.] // Russian Journal of Electrochemistry. - 2010. - Vol. 46, No. 5. - P. 537-541.
8. Определение антиоксидантной активности биологических жидкостей на электрохимически модифицированном платиновом электроде / Андреев В.Н. [и др.] // Современная лаборатория №1. - 2013. - Т. 193, № 3. - С. 68-71.
9. Мониторинг редокс потенциала сыворотки крови для диагностики осложнений при лечении пациентов с трансплантированной печенью / Ху-бутия М.Ш. [и др.] // Трансплантология. - 2012. - № 1-2. - С. 60-64.
