CC BY
12Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 24 (63). 2011. № 1. С. 190-195.
УДК 577.152.193
КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ РЕДЬКИ ЧЕРНОЙ ОТНОСИТЕЛЬНО НЕОРГАНИЧЕСКОГО СУБСТРАТА S2O32"
Вяткина О.В., Лаврентьева И.В., Ермакова М.О.
Таврический национальный университет им. В.И.Вернадского, Симферополь, Украина E-mail: oksana_vyatkina@list.ru
В статье изложены результаты исследований, подтверждающих каталитическое действие пероксидазы редьки черной в системе с пероксидом водорода и тиосульфатом натрия. Определены эффективные кинетические параметры изучаемого процесса и средняя молярная активность фермента относительно тиосульфат-иона. Установлены оптимумы концентраций субстратов окислителя и восстановителя и температурный интервал, позволяющие достичь максимальной эффективности окисления исследуемого субстрата.
Ключевые слова: пероксидаза, кинетические параметры, неорганический субстрат, пероксид водорода.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что субстратами пероксидазы являются соединения, резко различающиеся по структуре и химическим свойствам. Проблема субстратной специфичности классических пероксидаз растений до сих пор не решена [1]. Каждый фермент имеет свой собственный профиль субстратной специфичности, и в настоящее время, к сожалению, нельзя заранее предсказать, какова будет активность фермента по отношению к выбранному субстрату. При этом считается, что структура субстрата определяет характер его взаимодействия с ферментом и предполагает наличие дифференциации каталитических центров для субстратов различной природы [2]. Кроме того, необходимо учитывать, что активность растительных пероксидаз во многом зависит от климатических и экологических условий произрастания исходного сырья и от способа его выделения [1, 3].
Следует отметить, что группа органических субстратов пероксидазы весьма обширна и достаточно хорошо изучена в отличие от неорганических субстратов [2, 4-6]. Поэтому целью нашей работы было исследование каталитической активности фосфатно-буферного экстракта пероксидазы, выделенного из корнеплода редьки черной, произрастающей в Крыму, в системе 82032_-Н202-Н20-фермент.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлась пероксидаза корнеплодов редьки черной. Для получения экстракта растительное сырье подвергли очистке стандартым методом [7] и измельчили на пластмассовой терке. Экстракцию проводили фосфатным буфером с рН 7,0.
Определение средней пероксидазной активности ферментного препарата проводили в системе (I): С(Ча^203) = 0,05 моль/л, С(Н2О2) = 0,02 моль/л (У(ферм. преп.) = 5, 7, 10 мл). Общий объем системы доводили дистиллированной водой до 23,1 мл.
Молярную активность фермента рассчитывали по формуле (1)
А =~V (1)
т - V
Где: Av = vнач(S2032") - vKoн(S2032") - количество вещества окисленного тиосульфата, мкмоль;
т - время, с;
V - объем ферментного препарата в исследуемой системе
За единицу активности принимали количество окисленного субстрата (мкМ), катализированное 1 мл ферментного препарата в течение 1 с (2).
мкмоль ...
1 е.а.=--(2)
мл - с
Изучение каталитической активности пероксидазы редьки черной относительно субстрата окислителя (Н2О2) и субстрата восстановителя (Ка^203) проводили в системах (II) и (III) при 1=25 °С , рН=5. Система (II): Сначальная^а^203)= 0,08 моль/л (С(Н2О2) варьировали от 0,01 до 0,11 моль). Система (III): Сначальная(Н2О2) = 0,02 моль/л (С(Ка^203) варьировали от 0,022 моль/л до 0,08 моль/л). Объемная концентрация ферментного препарата в системах составляла Соб= 20%
Смесь оставляли на 10 минут, а реакцию окисления тиосульфата останавливали введением в систему 1 мл 0,2 н Н^04. Остаточные концентрации Ка^203 в исследуемых системах устанавливали методом йодиметрического титрования [8]. Экспериментальные данные использовали для расчета начальных скоростей реакции (3) и степени конверсии тиосульфата в исследуемых системах (а,%) (4).
тс- = — ДС; (3)
Дт
Где АС = Скон^2032-)-Снач^2032-) - разница конечной и начальной концентраций тиосульфата, моль/л;
А т = ткон — тнач - временной интервал, с;
С — С
г! = нач кон -100% (4)
С
нач
Где: Снач - начальная концентрация ^2032-)- в системе;
Скон - конечная концентрация ^2032-) в системе.
Эффективные кинетические параметры: порядок (пэф) и константу скорости реакции (кэф) определяли графическим методом в координатах Вант-Гоффа [9]. Для расчета максимальной скорости ферментативной реакции (мтсХ) и константы Михаэлиса (Км) использовали координаты Лайнуивера-Берка [9].
Для подтверждения каталитического действия пероксидазы редьки черной в реакции окисления тиосульфата исследовали кинетику его окисления в пероксидом водорода в системе (IV), не содержащей фермент. Система (IV): С(Ка28203) = 0,042 моль/л, С(Н2О2) = 0,02 моль/л, V(Н2О) = 1,75 мл.
Для изучения влияния температуры на окислительную активность фермента относительно 82032" использовали систему (V): С(Ка28203) = 0,042 моль/л, С(Н2О2) = 0,02 моль/л, Соб(фермента) = 20%. Активность исследовали в диапазоне температур от 0 °С до 85 °С. Растворы титровали охлажденными, чтобы избежать понижения чувствительности крахмала.
РЕЗУЛЬТАТЫ И обсуждение
В ходе изучения пероксидазной активности в системе (I) определили, что средняя пероксидазная молярная активность фосфатно-буферного экстракта фермента относительно неорганического электронодонорного субстрата 82032"составляет 2,5 е.а.
Результаты кинетических исследований в системах (II), (III), (IV) приведены в Таблице 1.
Таблица 1
Сравнительная характеристика кинетических параметров исследуемых систем
Параметр Система
8202--Н202-Н20 820 2 - Н202 - Н20 - пероксидаза
по восстановителю ^032- ) по окислителю (Н202)
кэф 2,2-10-5 6,3-10"4 8,7-10-5
Пэф 0,4 0,1
wmax, моль/л-с 2,4-10-5 6,2-10-5
Км, моль/л 27-10"3 1,3-10"3
А, е.а. 2,5±0,2
Эксперимент показал, что введение ферментного препарата в концентрации Соб=20% в систему 82032-Н202-Н20 на порядок увеличивает кэф окисления тиосульфата, порядок реакции при этом изменяется с 0,4 до 1, что подтверждает каталитическое действие фермента в данной системе.
Также было установлено, что при концентрациях тиосульфат-иона, превышающих 0,03 моль/л, скорость его окисления в присутствии фермента падает (рис. 1), что может быть связано либо со сменой механизма исследуемой реакции (5), либо с ингибированием фермента одним из продуктов, присутствующих в реакционной смеси.
82032"+2Н202+2Н+ ^ Н2803+Н20 (5)
Известно, что ингибиторами пероксидазы являются ионы, образующие прочные комплексы с ионом Рез+. Так, в избытке тиосульфат-ионов, обладающих высокой способностью к комплексообразованию с ионами железа, образуются растворимые комплексы [Ре(820з)4]6" (Рб=79,4) и [Ре^Оз)]4" (Ра=125,8) [10]. Одновременно с образованием тиосульфатных комплексов железа возможно образование сульфитных [Ре(80з)з] , [Ре(80з)2] комплексов железа [11]. Отметим, что с металлами ион 820з2" координирует через атом серы, поэтому тиосульфатные комплексы легко превращаются в соответствующие сульфиды, также являющиеся ингибиторами фермента [5].
Рис. 1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата восстановителя (820з2-) в системе (III).
Рис. 2. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата окислителя (Н202) в системе (II).
Полученные графическим методом в координатах Лайнуивера-Берка эффективные константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции по субстрату восстановителю равные соответственно 27-10_з моль/л и 2,4-10"5 моль/л-с (табл. 1) находятся в полном соответствии с данными представленными на Рисунке 1. Зависимости начальной скорости реакций пероксидазного окисления тиосульфата от концентрации пероксида водорода представлена на Рисунке 2. При малых концентрациях субстрата-окислителя эта зависимость носит линейный характер, что соответствует первому порядку реакции по основному субстрату. При концентрациях пероксида водорода больше 0,015 моль/л, кривая зависимости скорости реакции от его концентрации выходит на плато, т.е. порядок реакции по пероксиду водорода становится близким к нулю (табл. 1), что полностью соответствует схеме Михаэлиса-Ментен [12].
Установили, что максимальная скорость исследуемой реакции 6,2-10"5 моль/л-с наблюдается при концентрации Н202 равной 0,0з моль/л, а константа Михаэлиса по субстрату окислителю составляет 1 ,з • 10_з моль/л (табл. 1), что говорит о значительно большей избирательности исследуемого фермента по отношению к субстрату-окислителю по сравнению с субстратом-восстановителем.
Результаты исследования зависимости активности исследуемого ферментного препарата, представленные на рисунках з и 4 показали, что максимальные скорость
реакции окисления тиосульфата ^=3,6-10-5 моль/л-с) и степень его конверсии (а=54%) достигаются в системе (V) в интервале температур А 1опт=16-40 °С. Однако правило Вант-Гоффа в данных условиях не выполняется (у=1,4).
Рис.3. Зависимость начальных скоростей реакции ферментативного окисления тиосульфат-иона от температуры °С, (Система V).
Рис.4. Зависимость степени конверсии тиосульфат-иона от температуры °С, (Система V).
ВЫВОДЫ
1. Определено, что средняя пероксидазная молярная активность фосфатно-буферного экстракта фермента относительно неорганического электронодонорного субстрата 82032" составляет 2,5 е.а.
2. Выявлено, что введение ферментного препарата в концентрации Соб=20% в систему 82032~-Н202-Н20 на порядок увеличивает кэф окисления 82032", порядок реакции по тиосульфату при этом изменяется с 0,4 до 1, что подтверждает каталитическое действие фермента в данной системе.
3. Установлено, что эффективные значения константы Михаэлиса (Км) и максимальная скорость ^тах) по субстрату-окислителю соответственно равны 1,3-10-3 моль/л и 6,2-10"5 моль/л-с, по субстрату-восстановителю - 27-10"3 моль/л и 2,4-10"5 моль/л-с.
4. Определены оптимумы концентраций субстратов окислителя и восстановителя и температурный интервал, позволяющие достичь максимальной эффективности окисления тиосульфат-иона в системе 8203 -Н202-Н20 -пероксидаза; они равны
СопТ^2032")=0,03 моль/л, Сопт(Н202)=0,03 моль/л, А1опт=16-40 °С.
Список литературы
1. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / Рогожин В.В. - М. : ГИАРД, 2004. - 240 с.
2. Андреева В.А. Фермент пероксидаза / В.А. Андреева- М. : Наука, 1988. - С.54-55.
3. Александрова Е.Ю. Изучение пероксидазной активности в экстрактах из корневища и корней хрена и ее стабильности к различным воздействиям / Е.Ю. Александрова, М.А. Орлова, П.Л. Нейман // Вестник Московского университета. Сер. Химия. - 2006. - Т. 47, - № 5. - С. 350-352.
4. Рогожин В.В. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы хрена. Биохимия / В.В. Рогожин, В.В Верхотуров. - М. : МГУ, 1997. - 788 с.
5. Рогожин В.В. Роль индолил-з-уксусной кислоты в реакциях окисления быстро и медленно окисляемых субстратов пероксидазы / В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина // Вестник Московского университета, Сер. 2. Химия. - 2004. - Т. 45, - № 6. - С. 42з-428.
6. Айзенштадт М.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын // Химия растительного сырья. - 2009. - № 2. - С. 5-18.
7. Селибер Г.Л. Большой практикум по микробиологии / Селибер Г.Л. - М. : Мир, 1962. - 492 с.
8. Основы аналитической химии. Практическое руководство / [В.И. Фадеева, Т.Н. Шеховцова, В.М. Иванов и др.]; под ред. Ю.А.Золотова. - [2 изд., испр.] - М.: Высшая школа, 200з. - С.294-297.
9. Стромберг А.Г. Физическая химия / А.Г. Стромберг, Д.П. Семченко - М. : Высш. шк., 2001. - 526 с.
10. Хан Г.А. Флотационные реагенты и их применение / Хан Г.А., Габриелова Л.И., Власова Н.С. - М. : Недра, 1986. - 146 с.
11. Васёха М.В. Окислительно-восстановительные процессы в системе Ре(0Н)з(Н2804)-Ка280з-Н20 с осаждением сульфита железа(П) - прекурсора для выделения Ре20з / М.В. Васёха, Д. Л. Мотов // Журн. прикладн. химии. - 2005. - Т. 78. - Вып. 1. - С. 41-44.
12. Багирова Н.А. Кинетика и катализ / Н.А. Багирова, Т.Н. Шеховцова. - М.: Наука, 1999. - С. 625.
Вяткша О.В. Катал^ична актившсть пероксидази редьки чорно!" вщносно неоргашчного субстрату S2O32-/ О.В. Вяткша, 1.В. Лаврентьева, М.О. Ермакова // Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету iм. В.1. Вернадського. Серiя „Бюлопя, хiмiя". - 2011. - Т. 24 (6з), № 1. -С. 190-195.
У статт викладет результата дослщжень, що тдтверджують каталгтичну даю пероксидази редьки чорно! у системi з перекисом водню та тюсульфатом натрдю. Визначеш ефективш каталгтичш параметри процесу що вивчався та середня молярна актившсть ферменту вщносно тюсульфат-юну. Встановлено оптимуми концентрацш субстратш окиснювача та вiдновника, та температурний iнтервал, що дозволяе досягти максимально! ефективностi окиснення дослiджуваного субстрату. Ключовi слова: пероксидаза, кшетичт параметри, неоргашчний субстрат, перекис водню.
Vyatkna O.V. Catalitic activity of peroxidase of a black radish with inorganic substrate S2O32- / O.V. Vyatkina, IV. Lavrentieva, M.O. Ermakova // Scientific Notes of Taurida V.Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2011. - Vol. 24 (63), No. 1. - P. 190-195.
The article presents the results of studies confirming the catalytic effect of black radish peroxidase in the system with hydrogen peroxide and sodium thiosulphate. The effective kinetic parameters of the process being studied and the medium molar activity of the enzyme with thiosulphate ion were determined. Optimum concentration of substrate-oxidant and substrate-reductant and the temperature interval were established, allowing to reach maximum oxidation efficiency of the studied substrate. Keywords: peroxidase, kinetic parameters, inorganic substrate, hydrogen peroxide.
Поступила в редакцию 24.03.2011 г.
