Картирование в хромосомах человека гена son, продукт которого гомологичен онкобелками Mos и Мус Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Коллектив авторов, 1992 УДК 575.1:559.324.4

Г.В.Ильинская, Ф.Б.Бердичевский, И.М.Чумаков, Б.П.Копнин

Картирование в хромосомах человека гена SON, продукт которого гомологичен онкобелками Mos и Мус

НИИ канцерогенеза, Институт молекулярной биологии АН СССР

Ранее в Институте молекулярной биологии АН СССР был выделен и идентифицирован новый ген человека SON, белковый продукт которого имеет участки гомологии с онкобелками Mos и семейства Мус [1-4]. Функция белка SON и вовлеченность его изменений в процессы канцерогенеза остаются невыясненными. Было обнаружено, однако, что экспрессия введенного с помощью ретровирусного вектора З1-концевого участка гена SON, кодирующего 889 аминокислотных остатков, вызывает изменения морфологии клеток грызунов и человека различных линий [4 ].

Картирование гена SON в хромосомах человека может помочь выяснить участие этого гена в хромосомных перестройках, характерных для тех или иных форм злокачественных новообразований. При использовании панели гибридных клонов соматических клеток человек—мышь, сохранивших разные человеческие хромосомы, было показано, что ген SON локализован у человека в хромосоме 21 [3 ]. Кроме того, в этих экспериментах в хромосоме 1 была выявлена последовательность ДНК, гомологичная З1-концу гена SON.

В настоящей работе представлены данные о картировании гена SON и его гомолога в хромосомах человека методом гибридизации in situ на метафазных хромосомах, позволяющим определить месторасположение исследуемых последовательностей ДНК соответственно в хромосомах 21 и 1.

Материалы и методы. Вставки кД НК гена SON, sotiT (2299 пар оснований из 5 * -области) и sonC (1454 пары оснований из 3^-области), клонированные в pGEM3 [2], биотинилировали методом ник-трансляции в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой “Clontech” (США), и использовали в качестве зондов для неизотопной гибридизации in situ, проводившейся по методу J.Garson и соавт. [5] с незначительными модификациями. Хромосомные препараты, стимулированные фитогемагглютинином лимфоцитов периферической крови от нормальных доноров, окрашивали на G-полосы, используя минимальные концентрации трипсина, дававшие слабую поперечную исчерченность, едва позволявшую различать каждую хромосомную пару. Лучшие метафазы фотографировали. Затем препараты обесцвечивали проводкой через спирты и гибридизировали с биотинилированными ДНК-зондами. Гибридизацию проводили при 42°С в течение 20 ч. Со-

EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS

G. V. Ilyinskaya, F. B. Berdichevsky, I. M. Chumakov, B.P.Kopnin

Human Chromosome Mapping of Gene SON Whose Product Is Homologic to Mos and Myc Oncoproteins

Research Institute of Carcinogenesis, Institute of Molecular Biology of the USSR Academy of Sciences

A new human gene SON has been isolated and identified at the Institute of Molecular Biology of the USSR AS [1-4 ]. The gene’s protein product has homology regions with the Mos oncoproteins and the Myc family [1-4]. The SON protein function and contribution of its changes to carcinogenesis remain undetermined. However, it has been found that expression of the retrovirus-vector-introduced SON 3'-end coding 889 amino acid residues inflicts morphologic changes in human and rodent cells of various lines [4].

The SON mapping in human chromosomes may help to discover the contribution of the gene to chromosome aberrations characteristic of malignant neoplasms. By using a panel of human-murine somatic cell hybrid clones retaining various human chromosomes it was shown that the SON was localized in man in chromosome 21 [3 ]. Besides, the experiments discovered a DNA sequence in chromosome 1, homologic to the 3'-end of the SON gene.

This paper describes mapping of the SON gene and its homolog in human chromosomes by in situ hybridization on metaphase chromosomes, that allows localization of the DNA sequences to be determined in chromosomes 21 and 1, respectively. Materials and M e t h o d s. cDNA inserts of the SON gene, sonT (2299 base pairs from the 5' region) and sonC (1454 base pairs from the 3' region) cloned in pGEM3 [2], were biotinylated by nick-translation according to a protocol recommended by Clontech (USA) and used as probes for non-isotopic in situ hybridization by a slightly modified method of G.Garson et al. [15]. The chromosome preparations of phytohemagglutinin-stimulated circulating lymphocytes from normal donors were G-strip stained using minimum trypsin concentrations to give just weak transverse strips, so that each chromosome pair could hardly be seen. Photographs were taken of the best metaphases. Then the preparations were decolorized in alcohols and hybridized with the biotinylated DNA probes. The hybridization was performed at 42°C for 20 h. The hybridization mixture consisted of 2xSSC with 50% of for-mamide, 10% of dextrane sulfate, 200 ^g/ml of denaturated DNA of salmon sperm and 0.01 fi g/ml of biotinylated DNA. The glasses were washed consequently in 2xSSC, 0.4xSSC and

0.2xSSC (with sonT probe only) two times for 3-5 min. The biotin within the hybrid molecules was visualized using a streptovidin-

llhliln J.lill J « Jim» «Г Imiil J їм ■ и_« nl.ilil-iJ.,

і гги «уішім «її гм ичуі і ти пгігігіитші ПГ* ■ Нілі сж^і иі_ц)

°DQQ D00DjjD D 00 “ОЩЧО0000 (] дощаоуро oooojpo goo ogogooooooo QQ 0 QQ0000

.Ппіш.

ашюш

■ImJJm

ПГПГ-'. І.ІЛ)

°DD00DaiO Oil

Li.

ГГГ'ТІ «I I

goooooo 8

І «ПІ1 ll

mnv їм и~і

DiyjPT

11II1.1

rrr^ ■ III

°о°шаоосію

10

Il ÜII..

nmrc

“рту

11

«П.ЛІ I

пгепяи

goooopg

12

. I.l

. .ill.II

УГШІ о D 0f-

ІІІ. .

13

14

|° D°| 1 11

la » ■ I

ПГ^Т I II

16

* ll I«1

ГТУПП

оцрцооо

17

111» I

ПОПП

18

..I.

ГКП й°°0 D 19

lull.

fTT^Tl

о nrnn

•San 0 0

20 21

■I III

в-аэ

22

■ uliliii

і ■ ^ и пі і 0 0 Q

■ 11

п^—1

0°

Рис.1. Распределение гранул над разными участками хромосом человека после гибридизации с зондами sonC (черные столбики над схематическими изображениями хромосом) и sonT (нижние белые столбики).

став гибридизационной смеси: 2xSSC с 50% формамида, 10% де-кстрана сульфата, 200 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 0,01 мкг/мл биотинилированной ДНК. Стекла отмывали последовательно в 2xSSC, 0,4xSSC и 0,2xSSC (только в случае зонда sonT) по 2 раза в течение 3-5 мин. Биотин в составе гибридных молекул визуализировали с помощью системы стрептавидин-ще-лочная фосфатаза ("Gene Test DNA Detection ЮГ, фирма “Clontech”, США) в соответствии с рекомендациями производителя и анализировали распределение гранул над хромосомами в предварительно сфотографированных метафазах. С каждым ДНК-зондом было поставлено 4-5 опытов.

Результаты исследования и их обсуждение. Суммарные данные двух опытов о распределении гранул над разными хромосомными участками после гибридизации с каждым из зондов представлены на рис.1. В случае sonT была определена локализация 386 гранул в 78 метафазах. Наибольшее их скопление было обнаружено над хромосомой 21, причем в 14 (19%) из 78 клеток гранулы размещались над серединой длинного плеча одного или обоих гомологов хромосомы 21 (рис.2, а, Ь). Здесь было найдено более 4% (16 из 386) всех выявленных гранул (%2 >225,

Fig. 1. Granule distribution over various human chromosome regions after hybridization with sonC probes (dark bars) and sonT (light bars).

alkaline phosphatase system (Gene Test DNA Detection Kit, Clontech, USA) in accordance with the manufacturer’s recommendations, the granule distribution over the chromosomes was analyzed in the previously photographed sites. 4-5 experiments were carried out with each DNA probe.

Results and Discussion. Data of two experiments on granule distribution over various chromosome regions after hybridization with each probe are summarized in fig. 1. For sonT we determined location of 386 granules in 78 metaphases. The greatest number of the granules was observed over chromosome 21, in 14(19%) of 78 cells the granules were localized over the mid long arm of one or both homologs of chromosome 21 (fig.2, a, b). More than 4% (16/386) of all the granules were observed in that site (#2 >225, p < 0.005). They apparently corresponded to the specific hybridization signal localized in segment 21 q22.1 (fig.3).

In the experiments of hybridization with sonC probe we used milder washing conditions than in the experiments with the sonT in order to identify both gene SON and its homolog(s) by its 3'-end. Analysis

♦о

$

%

%

a

I) I ^*WI1IK

___J

>iV

JS

/

*0

■e-L. d

Рис.2. Фрагменты метафаз, демонстрирующие типичную локализацию гранул в хромосоме 21 после гибридизации с sonT (а) и в хромосоме 1 после гибридизации с sonC (Ь). Те же самые фрагменты метафаз после предварительной окраски на G-полосы (с, d).

р<0,005). Очевидно, они соответствуют специфическому гибридизационному сигналу, локализующемуся в сегменте 21 q22.1 (рис.З).

В опытах по гибридизации с пробой sonC были использованы более мягкие, чем в опытах sonT, условия отмывки, для того, чтобы иметь возможность выявлять не только ген SON, но и его гомолог(и) по З1-концу. При анализе распределения 402 гранул в 68 метафазах (см. рис.1) было обнаружено два отчетливых пика: над серединой длинного плеча хромосомы 21 (13 гранул, %2 >1.44, р<0,01), т.е. над тем же хромосомным участком, где выявлялось скопление гранул после гибридизации с зондом sonT (см. рис.З), и над проксимальной частью длинного плеча хромосомы 1 (рис.2, с, d) (16 гранул, %2 >289, р<0,005). Расположение гранул, выявленных во всех 4 успешных опытах, по хромосомам 1-й пары (см. рис.З) позволяет сделать вывод, что гибридизационный сигнал локализуется в Iql2-q21.

Результаты настоящей работы вместе с данными проведенного ранее исследования панели гибридов соматических клеток человек—мышь [3 ] дают основание заключить, что ген SON локализован у человека в хромосоме 21, в сегменте q22.1. В хромосоме 1, в сегменте ql2-q21 содержится, очевидно, последовательность ДНК, гомологичная З1-концу кДНК гена SON. Остается пока неясным, представляет ли эта последовательность истинный ген, или она является псевдогеном.

Сегмент 21q22, в котором мы картировали ген SON, содержит точки разрывов хромосомных транслокаций, характерных для острого миелобластного лейкоза [t(8; 21)(q22; q22), тип М2 по классификации FAB1], хронического миелоидного лейкоза и миелодисплас-тических синдромов [t(3; 21)(q26; q22) ] и некоторых

Fig.2. Metaphase fragments demonstrating typical granule distribution In chromosome 21 after hybridization with sonT (a) and in chromosome 1 after hybridization with sonC(b). The same metaphase fragments after preliminary G-strlp staining (c, d).

of distribution of 402 granules in 68 metaphases (see fig. 1) found two clear peaks: over the mid long arm of chromosome 21 (13 granules,%1 >144, p < 0.01), i.e. over the same chromosome region as on hybridization with the sonT probe (see fig.3), and over the proximal part of the chromosome 1 long arm (fig.2, c, d) (16 granules, %1 >289, p < 0.005). The granule distribution over the first chromosome pair in all 4 successful experiments shows that the hybridization signal is localized in Iql2-q21.

The results of this investigation and the data of a previous study on human-murine somatic cell hybrids [3 ] allows the conclusion that the human SON gene is localized in chromosome 21 segment q22.1. Chromosome 1 segment ql2-q21 apparently contains a DNA sequence homologic to the З'-end of the cDNA of the SON gene. However, it remains uncertain whether this sequence is a true gene or a pseudogene. Segment 21q22 in which we have mapped the SON gene contains points of chromosome translocation breakage, characteristic of acute myeloblastic leukemia [t(8; 21) (q22; q22), type М2 by FAB classification ], chronic myeloid leukemia and myelo-dysplastic syndromes [t(3; 21) (q26; q22) ] and some other newgrowths [6, 7]. Target genes of these translocations have failed to be identified so far. The chromosome 1 region Iql2-q21 is also involved in a number of changes, characteristic of certain human tumors [6, 7]. Further investigations will be undertaken to find out whether the structure and expression of the gene SON or its homolog changes as a result of these chromosomal aberrations.

Литература / References

1. Бердичевский Ф.Б., Чумаков И.М., Киселев JI.JI. //Молекул, биол. — 1988. — Т.22, № 3. — С. 794-801.

2. Бердичевский Ф.Б., Чумаков И.М. //Генетика. — 1988. — Т. 24, № 2. — С. 366-369.

3. Чумаков И.М. Клеточные гены, родственные генам вируса саркомы Молони: Автореф. дисс. ... д-ра биол.наук. — М., 1990.

21

Рис.З. Схема, отражающая распределение гранул над разными участками хромосомы 21 после гибридизации с sonC (черные кружки) или sonT (белые кружки) и хромосомы 1 после гибридизации с sonC. Каждый кружок соответствует одной грануле.

других новообразований [6, 7]. Гены, являющиеся мишенями этих транслокаций, пока

неидентифицированы. Участок хромосомы 1 Iql2-q21 также вовлечен в ряд изменений, характерных для определенных форм опухолей человека [6, 7]. Предстоит выяснить, не изменяется ли структура и экспрессия гена SON или его гомолога в результате этих хромосомных перестроек.

© Коллектив авторов, 1992 УДК 616-006-092.4/.9:612.015.1

И.Н.Каверина, Ю.М.Васильев, Г.Л.Николсон

Изменения ^трансформированных и трансформированных клеток под действием ингибитора трансглутаминазы монодансилкадаверина

НИИ канцерогена, Онкологический центр М.Д.Андерсена, Хьюстон, США

Одной из характерных черт неопластической трансформации клеток является определенный набор морфологических изменений, связанных с нарушением прикрепления к внеклеточному матриксу и редукцией актиновош цитоскелета. Такие изменения могут

Fig.3. A schematic diagram of granule distribution over various regions of chromosome 21 after hybridization with sonC (dark circles) or sonT (light circles) and chromosome 1 after hybridization with sonC. Each circle represent one granule.

4. Чумаков И.М., Бердичевский Ф.Б., Соколова H.B. и др. // Молекул, биол. — 1991. — Т. 25, № 3. — С. 731-739.

5. Garson J.A., van der Berghe J.A., Komshead J.T. // Nucl. Acid. Res. — 1988. — Vol. 15.— P. 4761-4770.

6. Mitelman F. // Catalog of chromosome aberrations in cancer. — 3-nd Ed. — New York, 1988.

7. Trent J.M., Kaneko Y., Mitelman F. // Cytogenet. Cell Genet. — 1989. — Vol. 51. — P. 533-562.

Поступила 12.12.91. / Submitted 12.12.91.

I.N.Kaverina, Yu.M. Vasiliev, G.L.Nicolson

Changes in Normal and Transformed Cells under Effect of Transglutaminase Inhibitor Monodansylca-daverine

Research Institute of Carcinogenesis,

AUCRC, Moscow, M.D.Anderson Hospital and Tumor Institute, Houston, USA

Neoplastic cell transformation is characterized by certain morphologic changes related to abnormal adhesion to the extracellular matrix and reduction of actin cytoskeleton. These changes may play a significant role in the invasion and metastasizing. Identifi-