CC BY
21
УДК 678.5.046, 615.462-036.5, 615.477
A. М. Аронов, д-р экон. наук,
Е. Н. Больбасов, научный сотрудник,
B. В. Гузеев, д-р техн. наук, И. А. Хлусов, д-р мед. наук,
C. И. Твердохлебов, канд. физ.-мат. наук,
Сибирский научно-исследовательский и испытательный центр медицинской техники, Новосибирск, ТФ ФГУ «РНЦ ВТО» им. акад. Г. А. Илизарова Росмедтехнологий, Томск, ГОУ ВПО «Томский Политехнический университет»
Каркасные материалы на основе фторполимера для инжиниринга тканей в клинической ортопедии
Ключевые слова: инжиниринг костной ткани, композиционный материал, сополимер тетрафторэтилен с винилиденфтори-дом, гидроксиапатит, поры, цитотоксичность
В качестве каркаса для инжиниринга костной ткани предложено использовать композиционный материал на основе сополимера тет-рафторэтилена с винилиденфторидом и гидро-ксиапатита. Показано, что его структура представляет собой многоуровневую систему, состоящую из сети связанных между собой макро- и микропор. Сделана оценка цитотоксичнос-ти предложенных каркасных материалов согласно ГОСТ Р ИСО 10993 и проведены in vivo испытания в тесте эктопического костеобразования.
Введение
Современная ортопедия все чаще сталкивается с такой мультифакторной патологией, как несовершенный остеогенез. Одним из наиболее перспективных методов решения данной проблемы является инжиниринг тканей.
Под инжинирингом тканей понимается выращивание в лабораторных условиях тканеподобно-го конструкта, его подготовка к имплантации и имплантация в целях регенерации поврежденной болезнью ткани в ее первоначальное состояние для восстановления функций [1]. Эта многодисциплинарная область затрагивает биологию клетки, химию, физику, материаловедение, хирургию. Внимание данной статьи будет сосредоточено на описании эластичных каркасных материалов, предназначенных для инжиниринга костной ткани на поверхности интрамедуллярных имплантатов.
Интрамедуллярный имплантат, устанавливаемый в костномозговой канал, является основным структурным элементом, придающим жесткость системе имплантат—кость и доставляющим необходимые минеральные и белковые факторы роста для стимулирования процессов остеогенеза.
Основные сложности при изготовлении подобного рода каркасных материалов состоят в противоречивости требований, предъявляемым к ним. В частности, такие каркасы должны обладать, с одной стороны, высокой эластичностью, приемлемой адгезией, толщиной более 150 мкм, которая нужна для формирования трехмерной архитектоники каркаса, а с другой стороны, высокой многоуровневой пористостью с размером пор более 100 мкм, которая нужна для эффективного заселения каркаса костными клетками и врастания костной ткани в поры. Молярное отношение Са/Р в таких материалах должно быть 1,67, что соответствует отношению Са/Р в естественной кости, либо должно быть выше [2].
Одним из способов получения подобных каркасов является использование полимерных композитов — материала, состоящего как минимум из двух фаз: органической — в виде биологически инертного полимерного связующего, обеспечивающего эластичность, адгезию, биологическую инертность, способность к стерилизации; неорганической — в виде биологически активного наполнителя, который может быть представлен мелкодисперсными порошками кальций-фосфатов регулируемого химического строения и (или) их смесями в различных пропорциях. Биологически активный наполнитель обеспечивает успешное протекание остео-индукции и остеокондукции [3].
Данный подход к решению задачи является перспективным, так как позволяет регулировать ряд основных характеристик, предъявляемых к каркасам для инжиниринга костной ткани на поверхности интрамедуллярного имплантата, а именно: 1) регулировать механические характеристики и биологическую активность вплоть до биоинертности путем изменения массовой доли неорганического наполнителя; 2) контролировать элементный состав и скорость биологической деградации ком-
биотехносфера
|№ 1(7/2010
позита путем подбора соответствующих форм кальций-фосфатов; 3) регулировать морфометрические характеристики композита путем регулирования дисперсности входящего в состав наполнителя [1]. При многослойном нанесении материала можно получать каркасы толщиной 200-250 мкм с развитой трехмерной архитектоникой на макро- и микроуровне.
В данной работе предложены композиционный материал и способ формирования биологически активного каркаса для ортопедии, удовлетворяющие требованиям развитой пористости. Проведен анализ медико-биологических свойств каркасов. Определен химический состав полученного каркасного материала.
Материалы и методы
В качестве связующего для изготовления биополимерных каркасов был выбран сополимер тетра-фторэтилена с винилиденфторидом (ТФЭ/ВДВ), что обусловлено его высокой химической стойкостью, хорошими физико-механическими характеристиками, термостойкостью и термостабильностью [4], биологической инертностью [5]. Такие полимеры могут перерабатываться из раствора, что упрощает аппаратную реализацию процесса изготовления каркаса.
В качестве неорганической минеральной фазы биополимерного композита использовался гидрокси-апатит (ГА) биологического происхождения, полученный путем обжига свиных костей с последующим размолом, многократной промывкой, сушкой и просеиванием. Методом рентгенофазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000 доказано, что полученный материал является гидроксиапатитом.
Раствор сополимера ТФЭ/ВДВ готовили растворением порошка сополимера в ацетоне при непрерывном перемешивании и постоянной температуре 70 °С. Дисперсию ГА готовили путем перемешивания порошка ГА в этилацетате в шаровой мельнице при 30 °С в течение 2 ч. После получения раствора сополимера к нему добавляли дисперсию ГА при постоянном перемешивании до достижения необходимой вязкости. Затем композит наносили методом пневматического распыления на предварительно подготовленные и нагретые до 70 °С титановые пластины марки ВТ-6. После нанесения образцы помещали в сушильный шкаф с температурой 150 °С на 12 ч для удаления остатков растворителя. Выбранные режимы позволяют получать гомогенные и гибкие (эластичные) каркасы ТФЭ/ВДВ-ГА из компонентов, приготовленных с массовым отношением полимера ТФЭ/ВДВ к наполнителю ГА, равным 30 : 70.
Поверхность каркаса ТФЭ/ВДВ-ГА была детально исследована на растровом электронном микроскопе «Philips SEM 515» с последующей компьютерной обработкой полученных изображений с помощью пакета программ «Мойс Image Life plus», который позволяет определить морфометрические
характеристики поверхности каркаса: общую поверхностную пористость, площадь и периметр пор.
Внутреннюю структуру макропор исследовали методом атомно-силовой микроскопии с использованием прибора «СЗМ Solver HV». Химический состав каркаса исследовали методом рентгенофлу-оресцентного анализа на установке «Shimadzu XRF 1800». Образцы для исследований в виде дисков диаметром 5 мм изготавливали методом холодного прессования материала. Токсикологические испытания, оценку местнораздражаюшего действия, гемолитическая активность каркаса из композиционного материалов проводили после его стерилизации этиленоксидом в стерилизаторе AN4000 («Andersen Sterilizers Inc.») в соответствии с ГОСТ Р ИСО 1099З. Биологическую совместимость и костеобразующую способность каркаса оценивали in vivo в тесте эктопического костеобразования [4] на 40 самцах мышей линии BALB/С массой 1821 г. Мышам подкожно имплантировали титановые диски из сплава ВТ-6 диаметром d = 1 мм с нанесенным на их поверхность каркасом. Перед имплантацией на диски с композиционным каркасом наносили столбик костного мозга, который извлекали из бедренной кости животных (клеточ-ность 1,5 х 106 клеток/мл), в среде DI-МЕМ (ISN) с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой («Вектор», Новосибирск). Через 1,5 месяца животных умерщвляли эфирным наркозом, диски извлекали, декальцинировали, готовили парафиновые срезы (толщиной 10 мкм) ткани, выросшей на диске. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином и подвергали гистологическому анализу.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлены полученные с помощью растрового электронного микроскопа изображения исследуемых образцов с различным увеличением.
Анализ поверхности каркаса, проведенный методом растровой электронной микроскопии, позволил убедиться в том, что при используемых режимах нанесения стабильно получается поверхность с порами диаметром более 100 мкм, образующими многоуровневые взаимопроникающие структуры. При достаточном увеличении отчетливо видно, что микроструктура каркаса представляет собой пористую систему, в которой частицы ГА связаны между собой полимерным связующим.
Основные морфометрические характеристики каркаса
Общая площадь пор, см2 .................. 441 280
Общая пористость композита, %.......47,79
Минимальная площадь пор, мкм2......... 0,8
Максимальная площадь пор, мкм2 ........ 25 379,6
Средняя площадь пор, мкм2............... 190,0
Минимальный периметр пор, мкм......4,7
Максимальный периметр пор, мкм..... 3393,1
Средний периметр пор, мкм..........22,7
№ 1(7)/2010"[
биотехносфера
Гистограмма распределения пор по размерам приведена на рис. 2.
Анализ полученных данных позволяет выделить как минимум три условных уровня пористости каркаса ТФЭ/ВДВ-ГА: пористость с размерами пор 10 мкм2, микропористость с размерами пор до 5000 мкм2 и макропористость с размерами пор более 8000 мкм2. На наш взгляд, наличие нескольких уровней пористости говорит о существовании нескольких механизмов образования пор. Наибольший вклад в общую поверхностную пористость (ОПП) вносят микропоры с размерами более 5000 мкм2.
На рис. 3 представлено изображение внутренней структуры макропор композитного каркаса, полученное с помощью атомно-силового микроскопа «С3М Solver HV». Данная методика позволила определить, что стенки макропор пронизаны системой более мелких пор размером 0,5 мкм. Можно предположить, что стенки микропор имеют подобную структуру.
Таким образом, микроскопические исследования структуры композитного каркаса показывают, что она аналогична структуре губчатой кости. Это является основным фактором, способствующим заселению каркаса остеобластами и прорастанию костной ткани в его поры с образованием костных блоков типа «биокомпозит — костная ткань», что ведет к увеличению жесткости фиксации, интраме-дуллярного имплантата в костномозговом канале [7].
Химический состав композитного каркаса, определенный методом РФА, масс. %
Са........................................................37,1635
Р..........................................................16,3777
О..........................................................32,6303
Г ..........................................................11,7968
Mg........................................................0,6010
К..........................................................0,0444
Ма........................................................0,5422
N1........................................................1,9413
Остальные..............................................0,8441
Анализ элементного состава показывает, что основной состав композитного каркаса — кальций, фосфор, фтор и кислород. В материале присутствуют примеси магния, никеля, калия, углерода, а
также следовое количество меди, железа и натрия. Наличие примесей можно объяснить тем, что в используемом ГА биологического происхождения имеются различного рода включения [7].
В табл. 1 приведены данные о токсичности, ме-стнораздражающем действии, апирогенности и стерильности биокомпозита, полученные в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993. В ходе исследований не отмечалась гибель лабораторных животных, не было выявлено макроскопических изменений ор-
0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
мкм
Рис. 2 Гистограмма распределения пор по размерам на поверхности каркаса
Рис. 3
Внутренняя структура макропор, область сканирования. 5 х 5 мкм
|№ 1(7)/201Q
биотехносфера
Результаты исследования цитотоксичности композитного каркаса
Показатель Допустимые значения Результаты испытаний Вывод о соответствии
Раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки животных в баллах: 1 кожа слизистая глаза кролика 0 0 0 0 Соотв. Соотв.
Острая токсичность при в/бр. введении, смерность Макроскопические изменения органов и тканей Весовые коэффициенты внутренних органов (наличие достоверных изменений) Нет Нет Нет Нет Нет Нет Нет Нет Соотв. Соотв. Соотв. Соотв.
Гемолитическая активность, % Не более 2 0,7 Соотв.
Индекс токсичности, % 70-120 88,4 Соотв.
Пирогенность Не более 3 °С 0,4 Соотв.
Микробиологические показатели Стерильно Стерильно Соотв.
ганов и тканей, изменений весовых коэффициентов внутренних органов. Вытяжки из композитного каркаса не оказывали местного и общего раздражающего воздействия на кожу и слизистые оболочки лабораторных животных.
Результаты исследования композитного каркаса in vivo после подкожной имплантации мышам линии BALB/C
Воспаление в месте имплантации...... Отсутствие
реакции
Инкапсуляция имплантанта......... Слабая
реакция
Тканевая пластинка, % ............ 100
Гистологическая оценка............ Кость с
костным мозгом
Эффективность роста костной ткани, % . 93
В ходе исследования отмечено, что животные легко переносили оперативное вмешательство. Не отмечались естественная гибель животных, локаль-
Рис. 4
Гистологический срез препарата на композитном каркасе, окраска — гематоксилин-эозин, увеличение 300
ные либо общие воспалительные и токсические реакции на имплантат, при этом биосовместимость образцов имплантата с нанесенным каркасом была хорошей. Поверхность каркаса имела тонкую стро-мальную капсулу. Гистологический срез полученного препарата представлен на рис. 4.
На гистологическом срезе (рис. 4) видны костная ткань (1) и костномозговые полости, заполненные костным мозгом (2). Наблюдается врастание кости в поры покрытия (ingrowth). Таким образом, проведенные исследования показывают возможность применения композитных каркасов ТФЭ/ВДВ-ГА для инжиниринга костной ткани в ортопедии.
Авторы выражают благодарность сотрудникам Томского материаловедческого центра коллективного пользования ГОУ ВПО ТГУ за помощь в проведении исследований.
| Л и т е р а т у р а |
1. Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. М.: Техносфера, 2007. 303 с.
2. Шаркеев Ю. П., Колобов А. В., Хлусов И. А., Карлов А. В., Легостаева Е. В., Шашкина Г. А. Биокерамические покрытия с высоким содержанием кальция для медицины // Физ. мезомеханика. 2004. Т. 8. Спец. вып. Ч. 2. С. 83-86.
3. Баринов С. М., Комлев В. С. Биокерамика на основе фосфатов кальция. М.: Наука, 2005. 203 с.
4. Катаева В. М., Попова В. А., Сажина Б. И. Справочник по пластическим массам. Т. 1. М.: Химия, 1975. 498 с.
5. Графская Н. Д. Сравнительная оценка сетчатых полимерных материалов как алопротезов брюшной сетки при грыжах: дис.... канд. мед. наук. М., 1967. 212 с.
6. Шутов Р. Б. Оперативное удлинение врожденно укороченной голени автоматическим дистрактором с применением интрамедуллярного армирования спицами с гидроксиапатитным покрытием: дис. ... канд. мед. наук. Курган, 2009. 226 с.
7. Карлов А. В., Шахов В. П. Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики. Томск: БТТ,2001. 477 с.
№ 1(73/2010 J"
биотехносфера
