CC BY
99
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ КАНЦЕРОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ СМЕСИ ФОРМАЛЬДЕГИДА... 51
УДК 616.33-006.6-092.9]:547.281.1+549.215
М.А. Сеньчукова, А.А. Стадников, Д.А. Боков КАНЦЕРОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ СМЕСИ ФОРМАЛЬДЕГИДА
И ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА ПРИ ВНУТРИЖЕЛУДОЧНОМ ВВЕДЕНИИ КРЫСАМ
ГБОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава, Оренбург
Контактная информация
Сеньчукова Марина Алексеевна, канд. мед. наук, доцент кафедры онкологии ОрГМА адрес: 460001, г. Оренбург, ул. Чкалова, д. 15, кв. 47; тел. +7(3532)33-33-14 e-mail: masenchukova@vandex.ru
Статья поступила 12.10.2012, принята к печати 30.10.2012.
Резюме
Установлен канцерогенный эффект внутрижелудочного введения смеси формальдегида и перекиси водорода белым беспородным крысам. Каждые две нед., в 1 и 3 день, животным внутрижелудочно вводили по 1,0 мл смеси, состоящей из 0,4 %-ного раствора формальдегида и 0,4 %-ного раствора перекиси водорода в отношении 1 : 1 на протяжении 6 мес. Через 7,5 мес от начала эксперимента у всех оставшихся в живых животных (n=21) выявлены злокачественные опухоли желудка, локализованные в пределах слизистой оболочки с инвазией отдельных опухолевых клеток или их скоплений в мышечную и серозную оболочку органа и опухолевыми эмболами в лимфатических и кровеносных сосудах. В 3 (14,3 %) наблюдениях отмечены метастазы рака в регионарных лимфоузлах и в 6 (28,6 %) - диссеминация по серозной оболочке тонкой кишки. У 4 (19 %) животных зафиксированы опухоли легких. Полученные данные могут быть использованы для изучения МЖК.
Ключевые слова: рак желудка, крыса, формальдегид, перекись водорода.
Senchukova M.A., Stadnikov A.A., Bokov D.A.
CARCINOGENIC EFFECT OF A MIX OF FORMALDEHYDE
AND PEROXIDE OF HYDROGEN BY INTRAGASTRIC ADMINISTRATION OF RAT
Orenburg state medical academy, Orenburg
Abstract
The cancerogenic effect of a mix of formaldehyde and peroxide of hydrogen by the intragastric administration to white outbred rats is established. Each two weeks, in 1 and 3 day, during 6 months the animals entered the 1,0 ml of the mix containing 0,4% formaldehyde and 0,4% peroxide of hydrogen concerning 1:1. In 7,5 months from the beginning of experiment at all survived animals (n=21) are revealed the malignant tumours of a stomach localized within the gastric mucosa with invasion of separate tumoral cells or their congestions in a muscularis propria and serosa, lymphatic and vascular invasion. In 3 (14,3%) cases are noted metastasises in regional lymph nodes and in 6 (28,6%) cases - dissemination on a peritoneum of a small intestine. At 4 (19%) animals are revealed tumours of lungs. Obtained data can be used for studying MGC.
Key words: gastric cancer, rat, formaldehyde, peroxide of hydrogen.
Введение
В настоящее время получены данные, свидетельствующие о том, что ФА обладает цитотокси-ческим и канцерогенным эффектами [10; 12].
В эксперименте на крысах с длительным введением ФА с питьевой водой (в течение 2 лет) показана его способность индуцировать злокачественные лимфомы и опухоли желудочно-кишечного тракта [12]. Большинство исследователей связывают канцерогенные эффекты ФА с его выраженными генотоксическими свойствами, а именно, с его способностью образовывать белковые сшивки ДНК [11; 13]. Что же касается ПВ, в ряде работ установлено, что она также обладает генотоксическими свойствами [5; 6] и, кроме того, способна стимулировать процессы неоангиогенеза [8]. Совместное применение ФА и ПВ приводило к усилению генотоксических свойств ФА, однако, данное исследование проводилось для изучения механизмов атеросклероза [9].
Мы не встретили работ, где ПВ изучалась бы экспериментально, как фактор, способный потенцировать действие известных канцерогенов, хотя роль эндогенных продуктов перекисного окисления
в канцерогенезе достаточно хорошо известна [4; 7]. Все выше сказанное послужило основанием для проведения настоящего исследования.
Цель - оценить канцерогенные свойства смеси ФА и ПВ и возможность ее использования для индукции злокачественных опухолей, в частности рака желудка.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 35 белых беспородных крысах самцах массой 180 - 250 г (30 подопытные, а 5 - контрольные). Содержание животных и эксперименты осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием лабораторных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР).
Животным каждые две недели, в 1 и 3 день, внутрижелудочно вводили по 1,0 мл смеси, состоящей из 0,4 %-ного раствора формальдегида и
0,4 %-ного р-ра раствора перекиси водорода в отношении 1:1 на протяжении 6 месяцев. Смесь готовили при комнатной температуре и вводили в течение 15 минут от момента смешивания растворов. Контролем служили 5 интактных крыс, находив-
шихся на обычном пищевом и водном режиме. Через 6 мес. от начала эксперимента, после наркотизации парами эфира, забиты первые 5 крыс, остальные (21) - через 7,5 мес. Желудки крыс и иные органы, имеющие признаки патологических изменений, изучали гистологически. Парафиновые срезы толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином и иммуногистохимическим методом (ИГХ) с использованием антител к панцитокератину АЕ1/АЕ3 («DAKO», Дания). Препараты изучали с помощью микроскопа Optika B-350 (Optika, Италия) с использованием видеокамеры Digital Camera for Microscope DCM500. Гистологическую структуру опухоли устанавливали в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей пищевода и желудка [14].
Результаты и обсуждение
Введение смеси ФА и ПВ подопытным животным сопровождалось явлениями интоксикации, которые были наиболее выражены в первые сутки после введения смеси.
У подопытных животных наблюдалась заторможенность, вялость, редко - одышка (возможно за счет того, что при введении часть смеси попадала в дыхательные пути), отек мошонки. 4 крысы погибли на 4-6 сутки после 2 введения смеси ФА и ПВ от явлений острой интоксикации. У погибших животных наблюдались отек легких, застойные изменения в печени, выраженный отек слизистой желудка. Смертность составила 13,3 %. По мере увеличения числа введений отмечалась адаптация животных к вводимым ксенобиотикам со снижением выраженности побочных эффектов.
Первые опухоли зафиксированы через 6 мес от начала эксперимента (у 4 из 5 животных). В одном случае опухоль представляла собой экзофитное образование около 0,4 мм в диаметре, в других - очаговые уплотнения слизистой оболочки (0,51,0 см), иногда с микроэрозиями на ее поверхности. Изменения носили одиночный характер и локализовались преимущественно в пределах слизистой оболочки пилорического отдела желудка или на границе пилорического и фундального отделов. Гистологическая картина соответствовала высоко и умеренно (в 1 случае) дифференцированной аденокарциноме желудка на фоне высокой степени ин-траэпителиальной неоплазии. В измененных участках выявлялись атипические железы, неправильной формы, часто с кистозными расширениями. Кубические или уплощенные клетки, выстилающие стенки таких желез, отличались выраженной ати-пией: анизоцитозом, анизокариоцитозом, полихро-мазией ядер, патологическими митозами. В одном случае наблюдалась инвазия опухоли в подслизи-стую основу желудка.
Что касается слизистой оболочки предже-лудка, она выглядела несколько истонченной, складки сглажены. В области перехода преджелуд-ка в тело во всех случаях регистрировались явления дисплазии плоского ороговевающего эпителия. Это проявлялось нарушением архитектоники эпителиального пласта, полярности эпителиальных клеток, их полиморфизмом. Ядра клеток базального слоя гиперхромны, много митозов. Довольно часто в этой области встречались «эпителиальные жемчужины», иногда наблюдался «рост» эпителиального пласта в толщу подслизистой основы слизистой оболочки желудка. На других участках слизистой преджелудка отмечалось истончение пласта по-
кровного эпителия, с признаками инволютивно-дегенеративных изменений в нем.
Через 7,5 мес. злокачественные опухоли в теле и пилорическом отделе желудка зафиксированы у всех животных. Обычно наблюдалось несколько (до 2-3) инфильтрированных участков слизистой оболочки желудка с ригидными складками размером от 0,7^1,0 см до 1,5*3,0 см. У 5 из 21 крысы (23,8 %) обнаружены схожие образования и в слизистой 12-перстной кишки. При микроскопическом исследовании большинство новообразований локализовались в пределах слизистой оболочки желудка. У 17 из 21 (80,9 %) животных были выявлены новообразования, соответствующие перстневидноклеточному раку (рис. 1-2; см. вклейку), у 14 (66,6 %) - очаги высокодифференцированной тубулярной аденокарциномы (рис. 3), у 5 (23,8 %) -умеренно дифференцированной аденокарциномы (рис. 4). В 5 наблюдениях отмечено разрастание опухоли в подслизистой основе органа (рис. 5).
Несмотря на то, что опухоли локализовались в пределах слизистой оболочки и подслизистой основы желудка, у всех животных к концу эксперимента кровеносных и лимфатических сосудах подслизистой основы наблюдались опухолевые эмболы (рис. 6). Тяжи и скопления опухолевых клеток отмечены также в мышечной (рис. 7) и серозной оболочке органа. В 3 случаях в плотных, увеличенных до 0,5-1,0 см регионарных лимфатических узлах большого сальника выявлены метастазы железистого рака, что подтверждалось экспрессией панцитокератина в цитоплазме опухолевых клеток, отличающихся выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом (рис. 8).
В 6 наблюдениях (28,6 %) по серозной оболочке тонкой кишки отмечены белесоватые образования 1-2 мм в диаметре. Микроскопически они были представлены опухолевыми инфильтратами, поражающими всю толщу стенки органа. Большая часть клеток, образующих описанные структуры, были с небольшими гиперхромными ядрами округлой, овальной и неправильной формы, с тонким ободком цитоплазмы. Реакция на панцитокератин в них отсутствовала или была слабо позитивной. Другие клетки имели крупные светлые ядра, различных размеров и формы. Их цитоплазма отличалась более интенсивной реакцией к цитокератину (рис. 9). Указанные клетки нередко формировали мелкие полостные структуры. При диссеминации опухоли по серозной оболочке тонкой кишки во всех случаях наблюдались раковые комплексы в большом сальнике.
Следует отметить, что неопластические изменения развивались на фоне умеренной атрофии слизистой оболочки желудка (в основном пилорического отдела). На участках, расположенных рядом с опухолью отмечались выраженная дисплазии желудочного эпителия и появление в слизистой желудка очаговых лейкоцитарных инфильтратов. В подслизистой основе желудка на участках, расположенных рядом с опухолью, зафиксировано формирование сосудов капиллярного типа, образованных одним слоем эндотелиальных клеток. Клинические исследования свидетельствуют о том, что сосуды подобного типа могут отражать инвазивный и метастатический потенциал злокачественных опухолей [1; 2].
У 4 животных (19 %) выявлены опухоли в легких, которые были представлены белесоватыми уплотнениями от 0,5 до 1,0 см в диаметре, неправильной формы и с нечеткими контурами. При гис-
тологическом исследовании патологические образования были представлены железистыми структурами, неправильной, причудливой формы, часто с сосочковыми разрастаниями в их просвете, с большим количеством митозов, в том числе и патологических, клеточным и ядерным полиморфизмом (рис. 10). В окружающей ткани опухолевые клетки образовывали обширные диффузные инфильтраты со слабо выраженной стромой, неоднородные по клеточному составу. Некоторые инфильтраты состояли в основном из обширных скоплений мелких, лимфоцитоподобных клеток, с гиперхромными ядрами и очень тонким ободком цитоплазмы. Другие - из полиморфных клеток с эозинофильной цитоплазмой и ядрами округлой формы, различной величины и интенсивности окраски, которые располагались либо центрально, либо по периферии клетки, выходя за контуры ее оболочки. В окружающих тканях отмечался выраженный отек, венозное полнокровие, обширные диффузные и очаговые лейкоцитарные инфильтраты, местами обширные кровоизлияния. Наблюдаемые изменения могут соответствовать как метастатическому поражению легких, так и первичным опухолям, которые могли возникнуть в результате попадания смеси в дыхательные пути.
У двух крыс в брыжейке тонкой кишки выявлены увеличенные до 1 см плотные лимфоузлы. При микроскопическом исследовании, на фоне реактивной гиперплазии в корковом слое отмечались единичные фолликулоподобные структуры, не имеющие четких границ, инфильтрирующие мозговой слой и оболочку лимфатического узла. Опухолевые клетки отличались выраженным ядерным полиморфизмом, встречались клетки с гигантскими ядрами, с ядрами неправильной формы, многоядерные клетки. В синусах большое количество плазматических клеток и макрофагов. Такая картина соответствовала злокачественным лимфомам. В других исследованных брыжеечных лимфоузлах наблюдались явления реактивного лимфаденита.
Кроме описанных изменений у подопытных животных также наблюдались выраженные дистрофические и дегенеративные изменения в печени и семенниках, обусловленные хронической интоксикацией. В печени эти изменения выражались расширением и полнокровием вен печеночных долек и синусоидных капилляров, скоплением эритроцитов в просвете сосудов с образованием микротромбов.
В сосудах центральных отделов долек часто отмечалось краевое стояние лейкоцитов и лейкодиа-педез. В перилобулярных отделах печеночных долек размеры гепатоцитов уменьшены, наблюдался пик-ноз ядер клеток, редукция цитоплазмы. Цитоплазма гепатоцитов зерниста.
На поздних сроках эксперимента в ткани печени появлялись очаговые кровоизлияния, с выраженной дистрофией и некрозом гепатоцитов.
В семенниках крыс развивался отек стромы и инволютивные изменения эндокриноцитов (клеток Лейдига). На поздних сроках эксперимента наблюдалась гиалинизация интерстициальной ткани органа. В извитых семенных канальцах отмечалась деструкция сперматогенного эпителия, заполнение канальцев некротизированным клеточным детритом, нарушение целостности собственной оболочки семенных канальцев.
Заключение
Проведенное исследование установило, что смесь ФА и ПВ обладает высокой канцерогенной активностью. С химической точки зрения эта смесь обладает рядом особенностей.
Так, Л.В. Серебренниковым и А.В. Головкиным при изучении продуктов реакции ФА и ПВ методом спектрального анализа [3] было отмечено, что исходные продукты и их комплексы (СН2О...Н2О2) довольно продолжительное время регистрируются в исследуемой смеси. Независимо от соотношения смешиваемых веществ (1 : 1; 1 : 2; 2 : 1) промежуточным и довольно стойким продуктом их реакции является перекисная молекула Н2С(ОН)ООН, которая в дальнейшем может разлагаться на муравьиную кислоту, воду и диоксид углерода.
По сравнению с исследованием М. Soffritti й а1. [12], применение с ФА вместе с ПВ способствовало не только значительному увеличению числа животных с опухолями (12 и 100 % соответственно), сокращению времени введения канцерогена (104 нед. и 26 нед. соответственно), но и стимулировало метастатическую активность индуцированных опухолей желудка.
Результаты исследования могут быть использованы для изучения механизмов желудочного канцерогенеза, в частности опухолевого ангиогенеза и метастазирования.
Литература
1. Бондарь Г.В., Шлопов В.Г., Белецкий Г.Л. и др. Морфология и морфогенез сосудистого русла культи шейки матки после надвлагалищной ампутации по поводу новообразований тела матки и придатков // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 1999. - Т. 8, № 1. - С. 8-12.
2. Сеньчукова М.А., Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., Боков Д.А. Морфологическая характеристика сосудов подслизистой оболочки желудка на участках, прилежащих к опухоли, у больных раком желудка // Вопросы онкологии. - 2010. - Т. 56, № 2. - С.40-1.
3. Серебренников Л.В., Головкин А.В. Реакция формальдегида с пероксидом водорода. ИК -спектры в матрицах из ксенона и расчет интермедиатов и переходных состояний // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. - 2005. - Т. 46, № 6. - 370 -7.
4. Якубовская Р.И., Сергеева Т.В., Немцова Е.Р., Безбородова О.А. Антиоксиданты - место и роль в онкологии // Российский онкологический журнал. - 2003. - № 5. - С. 48-53.
5. Andersson M., Stenqvist P., Hellman B. Interindividual differences in initial DNA repair capacity when evaluating H2O2-induced DNA damage in extended-term cultures of human lymphocytes using the comet assay // Cell Biol Toxicol. - 2007. - 23(6). - Р. 401-11.
6. Horvthov E., Slamenov D., Marslkov L. et al. Effects of borneol on the level of DNA damage induced in primary rat hepatocytes and testicular cells by hydrogen peroxide // Food Chem Toxicol. - 2009. - 47(6). -P. 1318-23.
7. Ishikawa S., Tamaki S., Ohata M. et al. Heme induces DNA damage and hyperproliferation of colonic epithelial cells via hydrogen peroxide produced by heme oxygenase: a possible mechanism of heme-induced colon cancer // Mol Nutr Food Res. - 2010. - 54(8). - P. 1182-91.
8. Kim Y.M., Kim K.E., Koh G.Y. et al. Hydrogen peroxide produced by angiopoietin-1 mediates angiogenesis // Cancer Res. - 2006. - 66(12). - P. 6167-74.
9. Lin Z., Luo W, Li H, Zhang Y. The effect of endogenous formaldehyde on the rat aorta endothelial cells // Toxicol Lett. - 2005. - 159(2). - P. 134-43.
10. McGregor D., Bolt H., Cogliano V., Richter-Reichhelm H.B. Formaldehyde and glutaraldehyde and nasal cytotoxicity: case study within the context of the 2006 IPCS Human Framework for the Analysis of a cancer mode of action for humans // Crit Rev Toxicol. - 2006. - 36(10). - P. 821-35.
11. Neuss S., Speit G. Further characterization of the genotoxicity of formaldehyde in vitro by the sister chromatid exchange test and co-cultivation experiments // Mutagenesis. - 2008. -23(5). - P. 355-7.
12. Soffritti M., Belpoggi F., Lambertin L. et al. Results of long-term experimental studies on the carcinogenicity of formaldehyde and acetaldehyde in rats //Ann N Y Acad Sci. - 2002. - 982. - P. 87-105.
13. Speit G., Schmid O., Neuss S., Schbtz P. Genotoxic effects of formaldehyde in the human lung cell line A549 and in primary human nasal epithelial cells // Environ Mol Mutagen. - 2008. - 49(4). - P. 300-7.
14. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetic of Tumours of the Digestive System. The WHO Classification of Tumours of the Digestive System. - Lyon, France, November 6-9, 1999. - 253 p.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
Рисунки к статье М.А. Сеньчуковой и соавт.
КАНЦЕРОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ СМЕСИ ФОРМАЛЬДЕГИДА
И ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА ПРИ ВНУТРИЖЕЛУДОЧНОМ ВВЕДЕНИИ КРЫСАМ
Рис. 1. Перстневидно-клеточный рак желудка в пределах слизистой оболочки: окраска гематоксилин Майера и эозин, х 200.
Рис. 2. Перстневидно-клеточный рак желудка в пределах слизистой оболочки: окраска гематоксилин Майера и эозин, х 600.
Рис. 3. Очаги высокодифференцированной аденокарциномы с поражением базальных отделов фун-дальных желез желудка: окраска гематоксилин Майера и эозин, х 200.
Рис. 4. Умеренно дифференцированная аденокарцинома желудка в пределах слизистой желудка. Инвазия опухолевых клеток в собственную пластинку и подслизистую основу органа: окраска гематоксилин Майера и эозин, х 200.
Рис. 5. Разрастания перстневидно-клеточного рака в подслизистой основе желудка. Отмечается различная реакция опухолевых клеток на панцитокератин (от выраженной, до практически ее отсутствия): иммуногистохимическая окраска с антителами к панцитокератину (АЕ1/АЕ3), х 200.
Рис. 6. Опухолевый эмбол в кровеносном сосуде подслизистой основы желудка: окраска гематоксилин Майера и эозин, х 600.
Рис. 7. Скопление опухолевых клеток в подслизи-стой основе слизистой оболочки желудка: окраска гематоксилин Майера и эозин, х 600.
Рис. 8. Метастаз рака желудка в лимфоузле большого сальника. Положительная реакция на панцитокератин (АЕ1/АЕ3) в цитоплазме опухолевых клеток: иммуногистохимическая окраска с антителами к панцитокератину (АЕ1/АЕ3), х 600.
Рис. 9. Диссеминаты рака желудка по брюшине Рис. 10. Опухолевое поражение ткани легкого: ок-
тонкой кишки: иммуногистохимическая окраска с раска гематоксилин Майера и эозин, х 200.
антителами к панцитокератину (АЕ1/АЕ3), х 600.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
її
