CC BY
575
Becтник flBO PAH. 2010. № 5
УДК 669:620.19+669.295+541.13
С.В.ГНЕДЕНКОВ, Ю.П.ШАРКЕЕВ, С.Л.СИНЕБРЮХОВ, О.А.ХРИСАНФОВА, Е.В.ЛЕГОСТАЕВА,
А.Г.ЗАВИДНАЯ, А.В.ПУЗЬ- И.А.ХЛУСОВ
Кальций-фосфатные биоактивные покрытия на титане
Рассмотрены условия формирования на титане методом плазменного электролитического оксидирования в электролитах различного химического состава биоактивных кальций-фосфатных поверхностных слоев, содержащих гидроксиапатит. Изучены их состав, морфология, антикоррозионные и механические характеристики. По результатам исследования предложены оптимальные режимы получения. Поверхностные слои, формируемые на титановых имплантатах, изучены в условиях in vitro и in vivo. Показано, что биологическая активность покрытий определяется суперпозицией специфических параметров: химическим составом, в частности значениями концентраций кальция и фосфора, отношением элементов и морфологией (шероховатостью) поверхности.
Ключевые слова: титан, гидроксиапатит, имплантат, плазменное электролитическое оксидирование, антикоррозионные свойства, упругопластические свойства, остеогенез.
Calcium-phosphate bioactive coatings on titanium. S.V.GNEDENKOV (Institute of Chemistry, FEB RAS, Vladivostok), Yu.P.SHARKEEV (Institute of Strength Physics and Materials Science, SB RAS, Tomsk), S.L.SINEBRYUKHOV, O.A.KHRISANFOVA (Institute of Chemistry, FEB RAS, Vladivostok), E.V.LEGOSTAYEVA (Institute of Strength Physics and Materials Science, SB RAS, Tomsk), A.G.ZAVIDNAYA, A.V.PUZ’ (Institute of Chemistry, FEB RAS, Vladivostok), I.A.KHLUSOV (Siberian State Medical University, Tomsk).
Conditions of formation of bioactive calciumphosphate surface layers, containing hydroxyapatite, on titanium using the method of plasma electrolytic oxidation in different electrolyte solutions are considered in the paper. Composition, morphology, anticorrosion and mechanical properties and composition of these coatings are investigated. On the basis of results of this investigation optimal regimes of their production are offered. Bioactive surface layers formed on the titanium implants are tested in vitro and in vivo conditions. It is shown that bioactivity of layers depends on chemical composition, specifically calcium and phosphorous concentrations, their ratio and morphology (roughness) of the surface.
Key words: titanium, hydroxyapatite, implant, plasma electrolytic oxidation, anticorrosion properties, elastoplastic properties, osteogenesis.
Современная медицина широко использует искусственные материалы для замены поврежденных тканей и органов. В зависимости от назначения вводимые в организм имплантаты должны замещаться живой тканью и / или функционировать длительное время. Большую часть используемых в настоящее время имплантатов изготавливают из
ГHEДEHKOB Сергей Bаcильeвич - доктор химических наук, заместитель директора, CИHEБPЮXOB Сергей Леонидович - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, XPИCAHФOBA Oльга Aлeкceeвна -кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ЗABИДHAЯ Aлeкcандра Григорьевна - кандидат химических наук, научный сотрудник, ПУЗЬ Aртeм Bикторович - младший научный сотрудник (Институт химии ДBO PAH, Bладивоcток), ШAPKEEB Юрий Петрович - доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией, ЛEГOCTAEBA Елена Bикторовна - кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник (Институт физики прочности и материаловедения CO PAH, Томск), XЛУCOB Игорь Aльбeртович - доктор медицинских наук, профессор (Сибирский государственный медицинский университет, Томск).
E-mail: svg21@hotmail.com
Pабота выполнена при частичной финансовой поддержке ДBO PAH (гранты 09-ЬП27-13, 09-П-CO-04-001, 10-III-B-04-010).
титана и титановых сплавов - материалов с приемлемыми (но небезупречными) коррозионными и коррозионно-механическими свойствами. Эти материалы не должны подвергаться коррозии и вызывать реакций иммунной системы, иметь характеристики, приближенные к механическим характеристикам костной ткани, интегрироваться с ней и стимулировать процесс остеогенеза. Этим требованиям отвечает биоактивная керамика на основе гидроксиапатита и фосфатов кальция [6].
Физические и химические свойства гидроксиапатита Ca10(PO4)6(OH)2 обеспечивают идеальную биосовместимость, активно стимулируя остеогенез и восстановление костной ткани. Изделия из гидроксиапатита в настоящее время применяют в травматологии, стоматологии, ортопедии и косметологии как биосовместимый биоактивный материал для регенерации костной ткани, идентичный по химическому составу ее минеральной компоненте.
Так же широко при операциях по восстановлению поврежденной кости используют материалы на основе фосфатов кальция. Иногда для повышения биосовместимости с костной тканью применяют гидроксиапатит нестехиометрического состава (Чо-х^Х^Л-хда^ где 0 < x < 1), разбавляя более растворимыми фосфатами кальция, например трехзамещенным ортофосфатом [5].
Установлено, что важной характеристикой, определяющей отклик организма на чужеродный материал, является не только химический состав, но и морфология поверхности имплантата [11]. В ряде случаев для повышения адгезионной прочности перед нанесением покрытий на титановую основу необходимо создать шероховатость поверхности с помощью пескоструйной обработки или химического травления, формирующих многоуровневую (многомодальную) поверхность с высокопористой структурой [4].
Покрытия, содержащие гидроксиапатит, позволяют улучшить биосовместимость металлического имплантата с костной тканью и уменьшить побочные негативные явления, возникающие при использовании имплантата без покрытия. Наиболее технологичный и популярный метод модификации поверхности металлов и сплавов - плазменное электролитическое (или микродуговое) оксидирование (ПЭО) [1]. В настоящее время в Институте химии ДВО РАН продемонстрирована возможность формирования на поверхности титана ВТ1-0 слоев с гидроксиапатитом, имеющих приемлемые адгезионные характеристики [3]. Гидроксиапатит синтезируется на поверхности титана в процессе ПЭО. Данные о фазовом, элементном составе, морфологии, антикоррозионных, механических и упругопластических характеристиках исследуемых слоев позволяют предполагать возможность их практического применения в медицине. Благодаря составу, близкому к минеральному составу костной ткани, и наличию системы пор формируемые покрытия перспективны для применения в имплантационной хирургии.
Однако до сих пор нет четкого представления о том, какими физико-химическими свойствами (шероховатостью, пористостью, элементным и фазовым составом и т.д.) должны обладать разрабатываемые покрытия. Целью настоящей работы являются изучение кальций-фосфатных поверхностных ПЭО-слоев, содержащих гидроксиапатит, на титане ВТ1-0, исследование их фазового состава, морфологии, антикоррозионных и механических характеристик, а также количественных показателей остеогенеза in vivo.
Методика
В качестве тестируемых образцов применяли квадратные пластинки с округленными краями размером 10 х 10 х 1 мм из титана ВТ1-0 с биоактивными кальций-фосфатными покрытиями, сформированными по методике [2] методом ПЭО. Перед оксидированием для стандартизации поверхности и освобождения поверхности металла от заусенцев, наростов, различных дефектов образцы подвергали механической обработке.
ПЭО проводили в монополярном (анодном) и биполярном (анодно-катодном) режимах с помощью автоматизированной системы управления и контроля (АСУиК), состоящей из источника тока, контрольно-измерительного блока, персонального компьютера и программного обеспечения. В качестве источника тока использовали стандартный реверсивный тиристорный агрегат типа ТЕР4-100.460Н-2-2УХЛ4. АСУиК обеспечивает контроль (с функцией отслеживания сбоев) параметров технологического процесса в режиме реального времени.
Для формирования поверхностного слоя образец погружали в водный раствор электролита и в течение 5 мин проводили обработку с использованием моно- или биполярного режимов ПЭО. Температуру электролита во всех экспериментах поддерживали в пределах 25-27оС.
Электрохимические свойства формируемых на титане слоев исследовали методами поляризационных характеристик и электрохимической импедансной спектроскопии (ЭИС) на электрохимической системе 12558WB (Solartron Analytical, Англия). Измерения проводили в 0,5 М растворе NaCl при комнатной температуре.
Механические и упругопластические свойства оксидных слоев (микротвердость, модуль упругости) изучали с помощью динамического ультрамикротвердомера DUH-W201 (Shimadzu, Япония) путем вдавливания алмазного индентора (пирамиды Берковича с углом при вершине 100°) в исследуемое покрытие. Толщину покрытий измеряли на поперечном шлифе образца.
Рентгенофазовый анализ покрытий выполнен на автоматическом рентгеновском дифрактометре D8 ADVANCE (BRUKER, Германия) с использованием СиКа-излучения.
Топологию поверхности в плоскости полученных покрытий изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) S5500 (HITACHI, Япония). На этом же приборе определяли содержание элементов на поверхности покрытия методом энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС).
При изучении имплантатов in vivo использовали 15 мышей-самцов линии BALB/c из коллекционного фонда НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН. Животным под эфирным наркозом подкожно вводили по 2 имплантата с нанесенным в асептических условиях столбиком сингенного костного мозга (средняя площадь мозга 7,5 мм2), взятого из бедренной кости мышей. Костный мозг служил источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и ростовых факторов. Для адгезии клеток органную культуру костного мозга на дисках предварительно культивировали в течение 45 мин в культуральной среде, содержащей 95% RPMI-1640 (ICN) и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN). Образования тканевых пластинок при раздельном подкожном введении мышам подложек и фрагментов костного мозга не наблюдалось. Имплантаты извлекали через 45 сут и фотографировали в отраженном свете с фиксированными параметрами. Для гистологического анализа применяли стандартные методы световой микроскопии тонких срезов. После декальцинации тканевых пластинок, выросших на имплантатах, серийные тонкие (10 мкм) парафиновые срезы, выполненные перпендикулярно поверхности дисков, окрашивали гематоксилином-эозином.
Шероховатость поверхности оценивали по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы Talysurf 5-120 (разрешающая способность 1 нм). Параметр шероховатости поверхности (R) определялся согласно ГОСТ 2789-73 как среднеарифметическое отклонение профиля в пределах нескольких участков измерений.
Методику компьютерной морфометрии применяли для выявления количественных параметров срезов посредством измерения их оптических характеристик. Площадь объектов вычисляли при помощи программы ImageJ 1.34p согласно статистике серых уровней в модификации.
Результаты и обсуждение
После проработки различных кальцийсодержащих электролитических систем и режимов оксидирования установлено, что на поверхности титана ВТ1-0 методом ПЭО можно формировать различные кальций-фосфатные покрытия, в том числе с гидрокси-апатитом (рис. 1).
В качестве компонентов электролита для формирования ПЭО-покрытий на титане были выбраны кальцийсодержащие соли с Са/Р, близким к отношению в костной ткани человека (1,67). В таблице приведены составы электролитов, условия формирования, фазовый и элементный составы и отношение Са/Р для покрытий, полученных на титане в электролитах, содержащих цитрат и ацетат кальция с добавлением двузамещенного фосфата натрия. Как следует из анализа результатов эксперимента (см. таблицу), покрытия, полученные в ацетатсодержащем электролите, содержат гидроксиапатит. Покрытия, сформированные в цитратсодержащем электролите, хотя и содержат в составе кристаллической фазы только диоксид титана, но, судя по величине Са/Р, в них присутствуют кальций-фосфатные соединения в виде рентгеноаморфной фазы.
Важным фактором, определяющим синтез гидроксиапатита в поверхностном слое, является характер поляризации при ПЭО. Гидроксиапатит Са10(РО4)6(ОН)2 был получен только в биполярном режиме ПЭО в ацетатсодержащем электролите, а в цитратсодержащем электролите достигнуты большие концентрации Са и Р в составе покрытия (см. таблицу) при невысоких концентрациях электролита. Вероятно, при биполярном режиме обработки титана переполяризация электрода приводит к последовательному насыщению приэлектродного пространства ионами кальция и фосфата. При катодной поляризации приповерхностные слои электролита насыщаются ионами Са2+, при анодной поляризации - ионами (НРО4)2-, которые, взаимодействуя, образуют молекулы кальций-фосфатных соединений: Са10(РО4)6(ОН)2, Са3(Р04)2, СаНР04 • 2Н20. Кроме того, в биполярном режиме ПЭО в состав плазмы вовлекается большее количество элементов электролита, что обеспечивает на поверхности имплантата более интенсивный, чем в монополярном режиме, электрохимический синтез кальций-фосфатных соединений из соответствующих элементов. Биполярный режим плазменного электролитического формирования покрытий имеет некоторые преимущества перед монополярным. В интервале катодной поляризации
Рис. 1. Дифрактограмма образца покрытия на титане, полученного в ацетат-фосфатном электролите. Кружки Саю(Р04)6(ОН)2, треугольники - Са3(РО4)2
^ Состав электролита о Яа, Фазовый состав 5" кости, 5" костн.
д (г/л); о мкм покрытия мм2 мозга, мм2
^ режим поляризации ^ §
1 Саз(СА°Л-4Н20 (30); №2НР0^2Н20 (30); монополярный 17 2,15 тіо2 + рентгеноаморфная фаза 0,4483 0,4318 11,32 3,18 3,69 0,86
2 Саз(СА°Л-4Н20 (20); №2НР0^2Н20 (20); монополярный 17 2,86 _ “ _ 0,4749 0,8140 11,49 3,11 3,28 0,95
3 Саз(СА0Л-4Н2° (40); №2НР0^2Н20 (40); монополярный 11 9,13 _ “ _ 0,3346 0,2950 6,29 9,28 5,24 1,77
4 Саз(СА0Л-4Н2° (20); №2НР0^2Н20 (20); биполярный 9 1,97 _ “ _ 0,7635 0,3670 19,07 11,73 7,21 1,63
5 Са(СН3С00)2-2Н20 (50); Ш2НРО„ (25); биполярный 17 1,79 (С^РОДОН + 0,7453 0,5450 2,57 17,22 8,85 1,94
происходит переформирование двойного электрического слоя (Гельмгольца, или Гуи-Чеп-мена), который снижает ионный транспорт и вероятность проникновения окисляющих реагентов к обрабатываемому электроду. Кроме того, в катодный период наряду с разупоря-дочиванием двойного электрического слоя электролита происходит переформирование слоя, увеличивающего сопротивление переносу заряда (область пространственного заряда) в материале самого покрытия. В силу этих причин при последующем положительном смещении на аноде реализуются более мощные плазменные разряды. В состав плазмы при этом попадает большее количество элементов электролита. Теплота, выделяемая при термической деструкции цитратсодержащих и ацетатсодержащих анионных комплексов, обеспечивает большую длительность теплового воздействия на формируемый материал оксидного слоя (по сравнению с длительностью, обеспечиваемой разрушением легких анионов), что в свою очередь способствует переходу соединений, входящих в материал покрытия, из метастабильного состояния в стабильное. Это влияет на морфологию поверхностных слоев, изменяет антикоррозионные характеристики покрытий. Исследование элементного состава покрытий показало, что во всех образцах присутствуют кальций и фосфор (см. таблицу), в то время как рентгенофазовый анализ не подтвердил наличия кальций-фосфатных соединений в некоторых покрытиях. Это означает, что такие соединения либо присутствуют в концентрации менее 10% (предел обнаружения рентгенофазового анализа), либо находятся в составе рентгеноаморфной фазы.
Данные ЭДС позволяют вычислить отношение кальция к фосфору, которое показывает степень соответствия состава покрытия, полученного методом ПЭО, составу минеральной компоненты костной ткани.
При исследовании методом электронной сканирующей микроскопии морфологии полученных в цитрат-фосфатном и ацетат-фосфатном электролитах покрытий было установлено, что их поверхность развитая, имеет поры, наличие которых благоприятно для врастания в них костной ткани и формирования более прочного соединения имплантата с костью (рис. 2).
Были изучены коррозионные и механические свойства кальций-фосфатных покрытий, полученных методом ПЭО. Для оценки электрохимических свойств сформированные в указанных условиях на титане ВТ1-0 покрытия исследовали методом ЭИС (рис. 3). Как следует из рисунка, спектр образца с естественной оксидной пленкой (кривая 1) имеет четко выраженный максимум на кривой зависимости фазового угла от частоты, что
Содержание хим. элементов, ат. %
Ті
Са
Р
Са/Р
Рис. 2. СЭМ-изображения поверхности образцов с ПЭО-покрытиями, сформированными в цитрат-фосфатном (а) и ацетат-фосфатном (б) электролитах
И, Ом - см2
ю6
ю5 ю4 ю3 ю2 101
\he\a, °
-100
-75 -50 -25 0
10'2 10*1 10° 101 102 1 03 1 04 1 0*
I Гц
Рис. 3. Диаграмма Боде (зависимость модуля импеданса (а) и фазового угла (б) от частоты) для покрытий, полученных на титане ВТ1-0 при различных условиях: 1 - естественный оксид; 2 - монополярный потенци-остатический режим (цитрат-фосфатный электролит); 3 - биполярный режим (цитрат-фосфатный электролит)
характеризует оксидную пленку как однородный беспористый слой. Наличие на поверхности металла слоев, сформированных при оксидировании, приводит к изменению вида кривых и возникновению дополнительного перегиба, что свидетельствует о появлении дополнительной (высокочастотной) временной константы, связанной с морфологическими изменениями (шероховатостью, пористостью) поверхностного слоя. Это соответствует экспериментальным данным, полученным методом сканирующей электронной микроскопии (рис. 2). Сопротивление пленки на образцах с полученными покрытиями соизмеримо с сопротивлением образца без покрытия, содержащего только естественный оксид титана (рис. 3). Это объясняется значительной сквозной пористостью формируемых оксидных слоев и высокой степенью развитости их поверхности (реальная площадь контакта ПЭО-слоев с электролитом во время измерений намного больше по сравнению с видимой).
На рис. 4 приведены поляризационные кривые, полученные в искусственном физиологическом растворе для покрытий, сформированных в цитратсодержащем электролите. В данном случае покрытия на титане несколько облагораживают стационарный потенциал, ток коррозии мало меняется и остается в пределах 20-60 нА/см2 как для образца с естественной оксидной пленкой, так и для образцов с ПЭО-покрытием.
Одним из важнейших условий для заместителей кости, в особенности тех, которые используются в качестве нагруженных деталей, является близость их механических характеристик свойствам естественной костной ткани. Изделия из титана имеют модуль упругости Е = 80 ГПа (при микротвердости Н = 2,7 ГПа), что значительно больше, чем у естественной кости, для которой Е = 20 ГПа (при Н = 0,6-0,8 ГПа) [15]. Несоответствие этих параметров является причиной возникновения краевых напряжений в месте соединения имплантата с костью. При определенных величинах
деформаций, возникающих при нагрузках, кость иногда отслаивается от имплантата, что приводит к некрозу.
Поэтому в данной работе изучались механические и упругопластические характеристики кальций-фосфатных поверхностных слоев на титане.
Для образца с покрытием, полученным в цитрат-фосфатном электролите, на рис. 5 приведена нагрузочно-разгрузочная динамическая зависимость глубины проникновения индентора в исследуемый материал от величины приложенной силы. Характер нагрузочной кривой различен для покрытия и подложки. При постепенно возрастающей нагрузке для поверхностного слоя, содержащего кальций-фосфат-ные соединения, из-за морфологических особенностей (пористости, развитости поверхности) микроструктура поверхности постепенно нарушается вследствие разрушения стенок пор, в результате чего на кривой 2 наблюдаются небольшие изгибы (рис. 5). Согласно измерениям, микротвердость поверхностного ПЭО-слоя составила 2,2 ГПа, модуль Юнга (E = 30 ГПа) почти в 2,5 раза меньше, чем у титана ВТ1-0. Таким образом, сформированное на поверхности титана каль-ций-фосфатное покрытие имеет более близкие к естественной костной ткани механические характеристики по сравнению с подложкой, что также является важным достоинством получаемых методом ПЭО оксидных гетерогенных слоев. Каль-ций-фосфатное покрытие в этой ситуации может выполнять функции демпфера, минимизируя вероятность отслоения кости от имплантата при деформациях.
Основополагающим фактором успешного применения любого материала в медицине является предварительное тестирование in vitro и in vivo. Как правило, испытания in vivo длятся несколько месяцев, поэтому проводится предварительное тестирование in vitro, которое в ходе простых экспериментов в лабораторных условиях позволяет разделить материалы по степени биоактивности.
Для оценки биологической активности образцов с ПЭО-покрытиями использовали выдержку исследуемых образцов в искусственной среде, имитирующей плазму крови человека (Simulated Body Fluid - SBF). Образцы помещали в модельную среду при постоянной температуре 37 ± 0,5°С. Раствор меняли каждые двое суток в течение месяца. Состав SBF-раствора [9] включает следующие исходные компоненты: NaCl, NaHCO3, KCl, K2HPO4 • 3H2O, MgCl2 • 6H2O, CaCl2, Na2SO4, деионизированная дистиллированная вода. Величина рН 7,4 достигалась добавлением трис-гидроксиметил-аминометана (СН2ОН)3 CNH2 и 1 М раствора HCl.
Е, В
10’° 10'9 10 е 10'7 1СГ6
j, А/см2
Рис. 4. Поляризационные кривые для поверхностных слоев, полученных при различных условиях: 1 - естественный оксид, полученный в результате окисления титана на воздухе; ПЭО-покрытия, сформированные: 2 - в монопо-лярном потенциостатическом режиме (цитрат-фосфатный электролит); 3 - в биполярном режиме (цитрат-фосфат-ный электролит)
F, мН
й, мкм
Рис. 5. Нагрузочно-разгрузочная динамическая зависимость глубины проникновения индентора в образец от нагрузки: 1 - образец без покрытия, 2 - образец с покрытием, полученным в цитрат-фосфатном электролите
Рис. 6. СЭМ-изображение поверхности образца титана ВТ1-0 с покрытием, полученным в ацетатно-фосфатном электролите: до (а) и после (б) выдержки в SBF-растворе в течение 30 сут
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
Е, кэВ
Рис. 7. Данные энергодисперсионной спектроскопии ПЭО-по-крытия до (а) и после (б) выдержки в SBF-растворе в течение
30 сут
После выдержки покрытий в насыщенном по ионам Ca2+ и PO4-SBF-растворе происходят минерализация и осаждение кристаллов кальций-фосфатных соединений на активных центрах поверхности покрытия, поверхность образца выравнивается, формируется чешуйчатая структура гидроксиапатита, присутствие которого подтверждается методом ренгенофазового анализа (рис. 6). ПЭО-слои, сформированные в ацетатно-фосфатном электролите, показывают приблизительно одинаковую активность при испытании в SBF, поэтому на рис. 6 приведены изображения поверхности только для одного формирующего электролита.
Полученные результаты согласуются с данными работ [7, 10, 12-14], в которых констатируется, что кальций-фосфатные покрытия с определенным уровнем шероховатости могут индуцировать образование кристаллического гидроксиапатита [7]. При выдержке образца в SBF-растворе на поверхности покрытия наблюдается рост гидроксиапатита, образование которого в SBF-растворе является критерием биоактивности пленки. Покрытие улучшает биоактивность оксидной пленки и стимулирует биологические реакции in vivo, ускоряя рост кости и уменьшая время вживления имплантата.
Методом энергодисперсион-
ной спектроскопии исследованы образцы с кальций-фосфатным покрытием до и после выдержки в искусственном физиологическом растворе в течение 30 сут (рис. 7). Анализ ЭДС-диаграммы показывает отсутствие сигнала Ti после выдержки образца в SBF-растворе, что объясняется образованием существенного по толщине слоя гидроксиапатита. Изучение данных энергодисперсионной спектроскопии показывает увеличение
концентрации Ca и значения Са/P на поверхности образца, находящегося в течение 30 сут в SBF-растворе.
Установлено, что эффективность остеоинтеграции, т.е. врастания имплантатов, зависит от состояния кости, структуры и свойств имплантируемого изделия, его адгезии, механических свойств, процессов на границе раздела покрытие-костная ткань и покрытие-имплантат [8]. Эти факторы можно выявить только в результате прямого эксперимента на биологическом объекте.
Для дальнейшего более глубокого исследования биоактивности ПЭО-покрытий in vivo проведены эксперименты по вживлению титановых имплантатов с покрытиями, полученными в цитрат-фосфатном и ацетат-фосфатном электролитах, непосредственно в организм лабораторных мышей. Результаты исследований показали, что подкожная имплантация дисков не вызвала воспалительных и аллергических явлений. Было установлено, что для возникновения остеоиндуктивных свойств необходимо наличие в покрытии соединений фосфора и кальция в определенном количественном соотношении. Однако, судя по результатам эксперимента, этот фактор является не единственным значимым: важны также шероховатость кальций-фосфатного слоя и абсолютная концентрация Ca и P в покрытии.
На гистологических препаратах тканевых пластинок, выросших на искусственных поверхностях с ПЭО-слоями, при окраске гематоксилином-эозином была выявлена грубоволокнистая костная ткань с полостями, заполненными костным мозгом (рис. 8).
Количественные параметры гистологического состава (кость, костный мозг) тканевых пластинок, показатель шероховатости R , фазовый состав и отношение Ca/P покрытий приведены в таблице. В режиме ПЭО на титане в растворах электролитов, содержащих цитрат и ацетат натрия, получены биологически активные кальций-фосфатные покрытия. При этом данные рентгенофазового анализа, согласно которым в составе некоторых покрытий обнаружен только диоксид титана, не отрицают присутствия в них кальций-фосфатных соединений в виде рентгеноаморфной фазы. Об этом можно судить по высоким значениям величины Ca/P в образцах, содержащих только TiO2. В составе образца 5 присутствуют гидроксиапатит кальция и фосфат кальция (см. таблицу). Величина Ca/P составила 1,92. Ключевым фактором оценки биоактивных свойств полученных покрытий является количество сформированной на их поверхности костной ткани.
В результате исследования влияния параметра шероховатости R на количественные показатели остеогенеза in vivo не было выявлено линейной зависимости показателей площади кости и площади костного мозга от параметра шероховатости искусственных поверхностей R (рис. 9). Однако на графике обнаружены точки экстремума биоактивности при шероховатости покрытий в диапазоне 2-З мкм.
Это согласуется с данными ранее проведенных исследований in vitro, выявивших оптимум шероховатости (R = 2-3 мкм) искусственных поверхностей для проявления наилучших остеогенных свойств MMCK человека. Mожно предположить, что опти-мумы значений Ra для остеогенной дифференцировки MMCK человека in vitro и MMCK мыши в тесте эктопического костеобразования во многом схожи Рис. 8. Mорфологическaя структура тканевых пластинок,
выросших на кальций-фосфатных покрытиях в тесте эктопи-
Важную роль играет как абсолют- F , - . - .
ческого костеобразования у мышей: фрагменты кальций-фос-ное содержание в поКрытии ф°сф°- фатного покрытия (1), костная пластинка (2), лакуны, запол-
ра и кальция, так и их соотношение. ненные красным костным мозгом (3). Увеличение 400
Максимальное костеобразование наблюдалось для образцов 4 и 5. Хотя их фазовые составы различны (TiO2 и рентгеноаморфная фаза - для образца 4, гид-роксиапатит и Ca3(PO4)2 - для образца 5), величина Ca/P в них велика по сравнению с таковой в остальных образцах (см. таблицу). Образец 3 имеет достаточно высокое значение Ca/P, но содержание Ca и P меньше по сравнению с образцами 4 и 5. Параметр шероховатости Ra для образца 3 имеет максимальное значение среди исследуемых поверхностей. Образцы 1 и 2 имеют оптимальную величину шероховатости R : 2,15 и 2,86 мкм, соответственно (рис. 9, таблица). Однако величины концентраций Ca и P, а также величина Ca/P для этих образцов существенно ниже, чем для образцов 4 и 5. В силу этих причин, вероятнее всего, рост костной ткани на этих поверхностных слоях (образцы 1- 3) будет незначительный. Таким образом, шероховатость поверхности является важным, но недостаточным условием костеобразования.
Выводы
Методом ПЭО на изделиях из титана ВТ1-0 получены кальций-фосфатные и оксидные покрытия, исследованы их фазовый и элементный составы, морфология поверхности, определена величина Ca/P. Изучены коррозионные свойства покрытий. Установлено, что по своим механическим характеристикам кальций-фосфатные покрытия приближаются к механическим характеристикам костной ткани.
Испытания покрытий в искусственном SBF-растворе продемонстрировали биологическую активность изучаемых поверхностных слоев. Биологическая активность поверхностных слоев в системе in vivo определяется суперпозицией специфических параметров: химическим составом, в частности значениями концентраций Ca и P, а также их отношением и морфологическими особенностями (шероховатостью) кальций-фосфатного покрытия на поверхности титановых имплантатов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гнеденков С.В., Хрисанфова О.А., Завидная А.Г Плазменное электролитическое оксидирование металлов и сплавов в тартратсодержащих растворах. Владивосток: Дальнаука, 2008. 143 с.
2. Гнеденков С.В., Хрисанфова О.А., Синебрюхов С.Л. и др. Формирование на титане поверхностных слоев, содержащих гидроксиапатит // Коррозия: материалы, защита. 2008. № 8. С. 24-30.
3. Пат. 2348744 РФ. Способ нанесения кальций-фосфатного покрытия на имплантаты из титана и его сплавов / С.В.Гнеденков, О.А.Хрисанфова, С.Л.Синебрюхов, А.В.Пузь, М.В.Нистратова; Ин-т химии ДВО РАН. № 2007126453/02; заявл. 11.07.2007; опубл. 10.03.2009. Бюл. № 7.
4. Пат. 2385740 РФ. Биоактивное покрытие на имплантате из титана и способ его получения / Е.В.Легостаева, Ю.П.Шаркеев, Т.В.Толкачева, А.И.Толмачев, П.В.Уваркин; Ин-т физики прочности и материаловедения СО РАН. № 2008137320/15; заявл. 17.09.2008; опубл. 10.04.2010. Бюл. № 10.
5. Путляев В.И. Современные биокерамические материалы // Соросов. образоват. журн. 2004. Т. 8, № 1. С. 44-50.
Рис. 9. График зависимости площади кости (квадраты) и костного мозга (кружки) от шероховатости покрытия
6. Han Y., Hong S.-H., Xu K. Structure and in vitro bioactivity of titania-based films by micro-arc oxidation // Surf.
Coat. Technol. 2003. Vol. 168. P. 249-258.
7. Huang P., Xu K.-W., Han Y. Preparation and apatite layer formation of plasma electrolyte oxidation film on tita-
nium for biomedical application // Mater. Lett. 2005. Vol. 59. P. 185-189.
8. Kim M., Kawashita M. Novel bioactive materials with different mechanical properties // Biomaterials. 2003. Vol. 24. P. 2161-2175.
9. Kokubo T., Takadama H. How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity? // Biomaterials. 2006. Vol. 27. P 2907-2915.
10. Ryu H.S., Song W.-H., Hong S.-H. Biomimetic apatite induction of P-containing titania formed by microarc oxidation before and after hydrothermal treatment // Surf. Coat. Technol. 2008. Vol. 202. P. 1853-1858.
11. Suchanek W., Yashima M., Kakihana M., Yoshimura M. Hydroxyapatite ceramics with selected sintering additives // Biomaterials. 1997. Vol. 18. P. 925-933.
12. Wei D., Zhow Y, Jia D., Wang Y. Biomimetic apatite deposited on microarc anatase-based ceramic coatings // Ceram. Int. 2008. Vol. 34. P. 1139-1144.
13. Wei D., Zhow Y., Jia D., Wang Y. Characteristics and in vitro bioactivity of a microarc-oxidized TiO2-based coating after chemical treatment // Acta Biomater. 2007. Vol. 3. P. 817-827.
14. Wei D., Zhow Y., Jia D., Wang Y. Characteristics of microarc oxidized coatings on titanium alloy formed in electrolytes containing chelate complex and nano-HA // Appl. Surf. Sci. 2007. Vol. 253. P. 5045-5050.
15. Zysset P.K., Guo X.E., Hofler C.E. et al. Elastic modulus and hardness of cortical and trabecular bone lamellae measured by nanoindentation in the human femur // J. Biomech. 1999. Vol. 32. P. 1005-1012.
Новые книги
Дальневосточье академическое: наша история в событиях, фактах, биографиях
(1970-2010) / автор-составитель АА.Калинин , науч. ред. чл.-корр. РАНЮ.Н.Кульчин.
Владивосток: Дальнаука, 2010. - 472 с. - ISBN 978-5-8044-1131-3.
Президиум ДВО РАН
690990, Владивосток, ул. Светланская, 50
Fax: (4232)22-87-50, E-mail: dvo@hq.febras.ru
В истории развития академической науки на Дальнем Востоке нашего Отечества ясно прослеживаются этапы ее зарождения и взросления (1932-1939), состоявшиеся благодаря мудрости и бескорыстным усилиям академика В.Л.Комарова и его учеников; угасания, связанного с военно-политической обстановкой и другими причинами (1939-1943); постепенного возрождения из малочисленной станции в научно-исследовательскую базу (1943-1949). В 1949 г. вышло постановление Совета министров СССР о преобразовании Дальневосточной и Сахалинской научно-исследовательских баз в филиалы АН СССР, ставшими в 1957 г. частью Сибирского отделения Академии наук.
Началом новейшей истории развития академической науки в российском Притихоокеа-нье можно считать 1970 г., когда по инициативе академика М.В.Келдыша из состава СО АН СССР были выделены научно-исследовательские учреждения Благовещенска, Владивостока, Петропавловска-Камчатского, Магадана, Южно-Сахалинска, Хабаровска и образован Дальневосточный научный центр Академии наук СССР. Его рождение стало свидетельством способности академического сообщества российского Притихоокеанья самостоятельно и активно изучать дальневосточную отечественную территорию, ее воды и воздушное пространство, Мировой океан, войти в общемировую науку.
Эта книга - попытка показать, как ученые Дальневосточного отделения Российской академии наук, преемника Дальневосточного научного центра (1970-1987) и Дальневосточного отделения (1987-1991) АН СССР, участвуют в развитии отечественной и мировой науки.
