CC BY
54
Вопросы общей патологии
КАЛЬЦИНИРУЮЩИЕ НАНОЧАСТИЦЫ В ПИТЬЕВОЙ ВОДЕ
Гарасько Е. В.*1, доктор медицинских наук,
Шиляев Р. Р.2, доктор медицинских наук,
Пономарев А. П.3, доктор биологических наук,
Горшенин А. П.4
1 Кафедра микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 153012, г. Иваново, просп. Ф. Энгельса, д. 8
2 Кафедра детских болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
3ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец 4 Ассоциация водоснабжения и водоотведения «Чистая вода» Верхневолжского региона,
153000, г. Иваново, ул. Ярославская, д. 20
РЕЗЮМЕ Представлены результаты микробиологического мониторинга качества питьевой воды гг. Иванова, Владимира, Костромы с использованием бактериофизических и электронно-микроскопических методов исследования. В пробах питьевой воды обнаружены способные к размножению наноструктуры, аналогичные выявленным в различных образцах биологических материалов. Метод хроматографического анализа ультраконцентратов осажденных примесей подтверждает факт присутствия кальцинирующих наноструктур в исследованных образцах воды. Присутствие таких структур в подготовленной традиционными способами питьевой воде может потребовать разработки инновационных технологий очистки воды для эрадикации наноструктур.
Ключевые слова: кальцинирующие наноструктуры, пробы питьевой воды, электронная микроскопия, хроматографический анализ.
* Ответственный за переписку (corresponding author): тел.: (4932) 32-73-90
Великий ученый Луи Пастер утверждал, что 90% своих болезней человек выпивает. По данным Всемирной организации здравоохранения, порядка 25% заболеваний в мире передается через воду, и от этих заболеваний ежегодно погибает 25 млн человек, что сравнимо с потерями при крупнейших стихийных бедствиях [7].
Кафедра микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО ИвГМА Минздравсоцразвития России совместно
с Ассоциацией водоснабжения и водоотведения «Чистая вода» Верхневолжского региона более 10 лет проводила микробиологический мониторинг с использованием бактериофизических методов исследования до и после внедрения новых технологий для обеззараживания воды централизованных источников водоснабжения г. Иванова [5, 6]. С 2008 г. совместно с ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир)
Garasko E. V., Shilyaev R. R., Ponomarev A. P., Gorshenin A. P.
CALCINOSIS NANOPARTICLES IN DRINKING WATER
ABSTRACT The results of microbiological monitoring of drinking water quality in Ivanovo, Vladimir, Kostroma by bacteriophysical and electronic microscopy methods of investigation were presented. In the samples of drinking water the authors detected the nanostructures which were able to reproduction and these structures were analogues to those ones which were revealed in various samples of biological materials. The method of chromatographic analysis of ultraconcentrates of precipitated admixtures confi rmed the fact of calcinosis nanostructures presence in water samples examined. The presence of such structures in the drinking water which was prepared by traditional methods might require to develop some innovational technologies of water puri fi cation for nanostructures eradication.
Key words: calcinosis nanostructures, drinking water samples, electronic microscopy, chromatographic analysis.
проводятся исследования питьевои воды на наличие нанообъектов биологической природы. Предпосылкой этих исследований явились публикации в отечественной и зарубежной литературе о нахождении в тканях человека и объектах окружающей среды самовоспроизводящихся биологических наночастиц, или нанобактерий. Их называют также «элементарные тела», «субъединицы», «фильтрующиеся формы», «мини-клетки», «каменные бактерии», «кальцинирующие наночастицы» [1, 10].
Открытие существования новых биологических форм - нанобактерий не менее революционно, чем работы Л. Пастера и Р. Коха о классических бактериях. Термин «нанобактерии» ввёл в научный оборот Ричард Морита в 1988 г., однако «отцом» нанобактерий считается американский геолог Техасского университета Роберт Фольк, который в 1990 г. при исследовании горячих сернистых источников обнаружил уникальные микроорганизмы наноразмеров (20-500 нм) овоидной и призматической форм. Сейчас их относят к роду ЫапоЬайег, их предком считают Ргх^еоЬайепа. Чистые культуры трех штаммов ультрамикробактерий депонированы немецкой коллекцией микроорганизмов в качестве нового вида ЫапоЬайепит Бапдитеит [14].
Исследователи из Финляндии (фирма «ЫапоЬас»), США (НАСА, Калифорнийский университет, Университет Райса, клиника Кливленда и больница при Университете Джорджа Вашингтона), Великобритании (Кардиффский университет), Германии (Ульмский университет), Австралии (Центр микроскопии и микроанализа) и др. установили причастность нанобактерий к процессам биоминерализации в организме человека (при атеросклерозе, мочекаменной болезни, калькулезном холецистите, подагре, узловом зобе, сахарном диабете, поражении опорно-двигательного аппарата, кариесе, новообразованиях, железодефицитных и других состояниях) [11-13].
В России с 2000 г. группой ученых г. Томска, возглавляемой профессором В. Т. Волковым при поддержке Р. Фолька (США) и финских исследователей во главе с О. Каяндером ведутся фундаментальные исследования этого нового фактора современной экологии. В. Т. Волков с коллегами выявил нанобактерии в питьевой воде, донорской крови и при ряде заболеваний человека и животных [2].
Белорусские учёные (В. И. Вощула и др.) экспериментально подтвердили нанобактериальную природу возникновения мочекаменной болезни и развили теорию нанобактериальнозависимого формирования камней, которая основывается на
обнаружении наноформ в культуре из почечных камней, формировании кальциевых камней нанобактериями in vitro, а также в почках после инъекции бактерий в почки кролика [4].
В связи с тем, что до недавнего времени о существовании в природе нанобактерий, окруженных карбонат-апатитным матриксом, науке было неизвестно, существующие нормативные документы в области питьевого водоснабжения не рассматривают их среди факторов, влияющих на качество и безопасность питьевой воды.
Целью настоящей работы является исследование проб питьевой воды из источников централизованного водоснабжения гг. Иванова, Владимира и Костромы на наличие в её составе кальцинирующих наноструктур.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Наноструктуры в пробах питьевой воды выявляли на электронном микроскопе JEM-100CX (Япония) при инструментальном увеличении 10 000-40 000 и ускоряющем напряжении 80 000 В. Подготовку препаратов осуществляли по методике негативного контрастирования 4%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (pH 6,8). Размеры биоструктур определяли непосредственно на негативных фотопластинках с помощью измерительного микроскопа МИР-12т.
Образцы воды для электронной микроскопии готовили двумя методами. Первый включал центрифугирование образцов воды в объёме 1,5 мл при 7 000 об/мин в течение 30 мин. Взвешенные примеси отделялись в осадок, который после удаления надосадочной жидкости ресуспендировали в 50 мкл воды. Второй метод предполагал ультрафильтрацию для концентрирования возможных минерально-органических примесей и бактериальных клеток, которые могли присутствовать в исходной воде. Для этого в фильтровальный модуль типа ФМ02-1000 помещали ацетатцел-люлозную мембрану типа УАМ-300 или УАМ-150 «Владипор» с диаметром пор соответственно 30 и 15 нм. Образцы воды в объёме 0,9-1,0 л заливали в стакан модуля и от воздушного компрессора создавали давление до 2 атм. Весь объём воды пропускали через мембрану, оставляя последнюю без признаков влаги на поверхности. В этом случае все минерально-органические примеси и микроорганизмы размером более 15 нм, оставались на поверхности. Для дальнейших исследований отбирали пробы исходной и пропущенной через мембрану воды (ультрафильтрат) для определения солевого баланса. По окончании фильтрации мембрану с осадком помещали в фарфоровую чашку, заливали жидким азотом
(-196°С) и растирали с помощью пестика до получения порошка мембраны, в составе которого оставались микроорганизмы и минерально-органические образования. Данные образцы обозначали как ультраконцентраты и использовали для дальнейших исследований: электронной микроскопии и анализа содержания химических элементов.
Для подтверждения результатов электронно-микроскопических исследований по присутствию нанобактерий в воде исследовали солевой состав воды до и после ультрафильтрации, а также анализировали содержание химических элементов, задержанных на мембране. Ультраконцентрат в виде порошка выжигали при температуре +550°С в течение 3 часов. Затем к каждому осадку добавляли 0,5 мл соляной кислоты и 5 мл воды. Каждый образец помещали в отдельную пробирку и центрифугировали при 8 ООО об/мин в течение 2-3 мин. Полученные надосадочные жидкости анализировали на жидкостном хроматографе типа «Waters», предназначенном для определения неорганических катионов в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В пробах питьевой воды, прошедшей обычную водоподготовку (хлорирование: первичное, вторичное, а также при замене хлора гипохлоритом натрия) выявлены наноструктуры, аналогичные наблюдавшимся нами в других исследованиях в различных образцах материалов биологического происхождения (кровь, атеросклеротические бляшки, оссифицированные фрагменты щитовидной железы при узловом зобе, зубной камень при пародонтозе и др.) [9, 10]. После ультрафильтрации проб воды в ходе электронной микроскопии концентрата обнаружены преимущественно сферические наноформы размерами от 20 до 200 нм в концентрации 108-109 ед./мкл (рис. 1).
Анализ содержания химических элементов в питьевой воде (рис. 2а и 26) показал, что при ультрафильтрации сохраняется солевой баланс после пропуска воды через полупроницаемые мембраны типа УАМ-300 и УАМ-150.
При фильтрации воды через мембрану УАМ-300 несколько уменьшается содержание кальция. После сжигания ультраконцентрата данной мембраны отмечается присутствие только кальция, который, по данным литературы, входит в состав нанобактерий [2].
На мембране фильтра УАМ-150 задерживаются Са - 0,025 мг/л, Мд - 0,10 мг/л, К - 0,05 мг/л, Ыа -
0,015 мг/л и и - 0,02 мг/л. Полученные данные указывают на то, что ультрафильтрационная мембрана типа УАМ-150 эффективно задерживает наноструктуры минимальных размеров, свидетельством чему является наличие на мембране катионов кальция, лития, натрия и калия. Результаты согласуются с литературными данными, где приводится химический состав осадка из нанобактерий, состоящего из: N - 1,0-1,3%; Р -12,03-14,6%; Са - 23,4-23,5%, Мд - 1,4-1,9%; К - 0,1%; Ыа - 1,2-1,4% [9]. В наших опытах на мембране фильтра УАМ-150 обнаружен литий.
При анализе ультраконцентратов исходной воды подземного источника ОСВ Башутино (г. Кострома) с общей жесткостью 5,0 мг-экв/л и содержанием железа 1,54 мг/дм3, установлено присутствие наносфер диаметром от 20 до 100 нм (рис. За). Помимо наноструктур минимальных размеров в данных образцах были выявлены конгломераты наноформ, которые, по-видимому, являются структурами конденсированного железа, образующимися при осаждении на мембрану в процессе ультрафильтрации или при нанесении на пленки-подложки, при подготовке препаратов для электронной микроскопии (рис. 36).
Рис. 1. Нанообъекты в образцах питьевой воды: а - классическая бактериальная клетка и наносферы, х 40 000; б - наносферы различного диаметра; в - биопленки сферических наноформ, х 60 000
Рис. 2а. Анализ содержания неорганических катионов в воде на жидкостном хроматографе «Waters». Общая жесткость исходной воды 6,9 мг-экв/л. Содержание катионов Са - 12,9 мг/л и Мд - 11,0 мг/л
Рис. 26. Общая жесткость воды после ультрафильтрации (УАМ-150) 6,9 мг-экв/л. Концентрация растворенных катионов Са и Мд остается неизменной (Са - 12,9 мг/л, Мд - 11,0 мг/л)
Рис. 3. Среди нанобактерий сферической формы (а) присутствуют более крупные структуры ■ конгломерат конденсированного железа (б), * 40 ООО
При анализе ультраконцентратов питьевой воды ОСВ Башутино г. Костромы после очистки (Fe < 0,1 мг/дм3, жесткость - 5,0 мг-экв/л) наноформы в ней не выявлены. Полученные результаты согласуются с данными В. Т. Волкова с соавт., установившими корреляционную зависимость между содержанием железа в питьевой воде и плотностью нанобактерий [2].
Для идентификации микроорганизмов, обитающих в исследуемой воде, проводили высев на среду МПА и среду Эндо. Определение вида бактерий проводили на системе VITEK2 compact, предназначенной для идентификации бактерий и дрожжей и определения чувствительности к антибиотикам клинически значимых бактерий. По результатам контроля установлено присутствие бактерий видов Stenotrophomonas maltophilia и Sphingomonas paucimobilis.
Осуществлен высев ультраконцентрата наноструктур питьевой воды на питательную среду Игла МЕМ с двойным набором витаминов и аминокислот. Рост и размножение наноформ на бессывороточной среде были аналогичны наблюдаемым нами в ранее проведенных исследованиях биологических образцов [9, 10]. Полученные данные согласуются с результатами сибирских ученых (В. Т. Волков и др.), которые при исследовании питьевой воды г. Томска и 20 населенных пунктов Томского района выявили нанобактерии во всех исследованных пробах. Они установили корреляционную зависимость между количеством нанобактерий в питьевой воде и уровнем заболеваемости узловым зобом [2]. Эти данные позволяют высказать мнение о том, что наиболее вероятным путем попадания кальцинирующих наночастиц в организм человека с питьевой водой является желудочно-кишечный тракт, хотя не исключаются и другие пути.
Таким образом, полученные результаты исследований проб воды, прошедшей обычную водопод-готовку, согласуются с данными других авторов, также установивших, что фильтрация, аэрация и хлорирование питьевой воды не приводят к эрадикации нанобактерий. Последние выявлены также в образцах наростов каменистой плотности на конструкциях фильтров и в просвете водопроводных труб. Нанобактерии активно поглощают железо, что дает им возможность существовать в абсолютно бескислородной среде в подземной воде. Установлено их участие в ржавлении труб и металлических конструкций. Доказан факт взаимодействия между белками нанобактерий и минералами с образованием наночастиц биологической природы, являющихся активными зародышевыми центрами очагов кристаллизации при биоминерализации с формированием минераль-
ных конкреций с фосфатом кальция при сверхнасыщении кальцием или фосфатом [2].
Вместе с тем, Ян Мартел и Джон Янг [8] утверждают, что нанобактерии, провозглашенные однажды мельчайшими из патогенов, являются неживыми минерально-органическими комплексами. Они действительно влияют на состояние здоровья человека, но совсем иначе, чем считалось вначале. Тем не менее, авторы согласны, что сам факт существования взаимодействий между белками и минералами с образованием наночастиц оказался очень важным: в ходе исследований были выявлены процессы, имеющие прямое отношение к состоянию здоровья человека.
Несмотря на спорность некоторых аспектов рассматриваемой проблемы, а возможно, именно благодаря этой спорности, исследования в данной области продолжаются. В 2008 г. В. Т. Волков с соавт. [3] провел электронную сканирующую микроскопию некоторых бутилированных вод, продаваемых в магазинах Алтайского края. Результат оказался неожиданным: в двух образцах воды не оказалось колоний нанобактерий. Это были родниковые воды, являющиеся динамической самоочищающейся системой - проходя через горные породы и контактируя с различными минералами разной агрегации, они освобождаются от нанобактерий. Немаловажным фактором является присутствие в родниковых водах серебра и золота в виде ионных комплексов, которые подавляют рост бактерии [3].
Таким образом, полученные результаты исследований не вызывают сомнений в факте присутствия в питьевой воде кальцинирующих наноструктур, морфологически идентичных наноформам. Возникает необходимость комплексных исследований питьевой воды для изучения этиологической и патогенетической роли кальцинирующих наноструктур при различных заболеваниях человека и животных. Это позволит минимизировать риски заболеваний,связанных с водой.
ВЫВОДЫ
При электронно-микроскопических исследованиях выявлены нанообъекты в образцах питьевой воды гг. Иванова, Владимира и Костромы.
Наличие в питьевой воде и способность к активному размножению кальцинирующих наноструктур представляет потенциальную опасность в связи с возможностью контаминации организмом человека.
Причастность наноформ к минералообразованию требует разработки инновационных технологий эрадикации наноструктур.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ванштейн М. Б. О нанобактериях // Микробиология.
- 2000. - Т. 69, № 2. - С. 163-174.
2. Волков В. Т. Биоминерализация в организме человека и животных. - Томск: Тандем-Арт, 2004.
3. Волков В. Т., Рихванов Л. П., Волкова Н. Н. Нанобактерия в питьевой воде - новейший биоминерализацион-ный геоэкологический фактор // Биокостные взаимодействия: жизнь и камень : матер. III Международного симпозиума. - СПб., 2007. - С. 102-105.
4. Вощула В. И., Владимирская Т. Э., Сугак Н. К. Морфологические изменения в почке при мочекаменной болезни // Медицина (Минск). - 2007. - № 3. - С. 66-70.
5. Гарасько Е. В., Горшенин А. П. Перспективы использования новых технологий для обеззараживания питьевой воды // Материалы четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова.
- Пущино, 2006. - С. 53-54.
6. Горшенин А. П., Гарасько Е. В. Исследование эффективности внедрения новых технологий для обеззараживания питьевой воды // Вестн. Ивановской медицинской академии. - 2009. - Т. 14, приложение. - С. 88.
7. Друзьяк Н. Г. Вода здоровья и долголетия. - СПб. : Крылов, 2007.
8. Мартел Я., ЯнгДж. Нанобактерии: взлети падение// В мире науки (Биология). - 2010. - Март. - С. 47-55.
9. Морфология и свойства некоторых микроорганизмов, представителей нано- и микромира / А. П. Пономарев [и др.] // Вестн. Ивановской медицинской академии. — 2008. — Т. 13, N3 3—4. — С. 23—29.
10. Шиляев Р. Р., Гарасько Е. В., Урусова Н. А. Современная трансфузиология и применение нанотехнологий для биологической безопасности // Вестн. Ивановской медицинской академии. -2009. - Т. 14, №3. - С. 68.
11. Akerman K. K., Kuronen I., Kajander E. O. Scanning electron microscopy of nanobacteria. Novel bicfi Im producing organisms in blood // Scanning. - 1993.
- Vol. 15, suppl. 3. - P. 90-91.
12. Akerman K. K., Kuikka J. T., Ciftcioglu N. Radiolabeling and in vivo distribution of nanobacteria in rabbit // Proc SPIE Int Soc Opt Eng. - 1997. - Vol. 3111. -P. 436-442.
13. Barr S. C., Linke R. A., Janssen D. Detection of biofi lm formation and nanobacteria under long-term cell culture conditions in serum samples of cattle, goats, cats and dogs // Am. J. Vet. Res. - 2003. - Vol. 64.
- P. 176-182.
14. Folk R. L. SEM imaging of bacteria and nanobacteria in carbonate sediments and rocks // J. Sediment. Petrol.
- 1993. - Vol. 63. - P. 990-999.
Поступила 31.08.10
