CC BY
13
ЕД ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ И ОБЗОРЫ
Как влияют на результат ПЦР-тестирования на COVID-19 характеристики тест-системы и эволюция SARS-CoV-2
Костюк С.А.1, Юрбич Ю.Л.1, Симирский В.В.2, Полуян О.С.1
1Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск Хозрасчетное опытное производство Института биоорганической химии НАН Беларуси, Минск
Kostiuk S.A.1, Gorbich Yu.L.1, Simirski V.V.2, Poluyan O.S.1
Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk 2Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus, Minsk
How do the characteristics of the test system and the evolution
of SARS-CoV-2 affect the result of PCR-testing for COVID-19
Резюме. Эволюция вируса SARS-CoV-2 продолжается и требует непрерывной научной оценки с использованием передовых методов анализа генетических последовательностей. Появление и распространение новых генетических вариантов коронавируса SARS-CoV-2, обладающих мутациями, способствующих повышению его трансмиссивности и/или снижению эффективности иммунного ответа, выработанного в отношении ранее циркулировавших штаммов вируса SARS-CoV-2 в результате инфекции или вакцинации, представляет угрозу для здравоохранения во всем мире. Особенно важно получить представление о генетических особенностях вирусов, циркулирующих в популяции людей, выявить те мутации, которые связаны с тропностью вируса, его контагиозностью, а также установить генетические особенности завозных и автохтонных геновариантов коронавирусов, провести их дифференциальную диагностику, что является необходимым условием для создания новых диагностических тест-систем, повышающих качество диагностики вирусных инфекций у человека и направленных на снижение заболеваемости COVID-19.
Ключевые слова: SARS-CoV-2, COVID-19, геноварианты, молекулярная диагностика, мутации, тест-система.
Медицинские новости. — 2022. — №4. — С. 5-10. Summary. The evolution of SARS-CoV-2 is ongoing and requires continuous scientific evaluation using advanced genetic sequence analysis techniques. The emergence and spread of new genetic variants of the SARS-CoV-2 coronavirus wtth mutations that increase its transmissibility and /or reduce the effectiveness of the immune response developed against previously circulating strains of the SARS-CoV-2 virus as a result of infection or vaccination poses a threat to public health worldwide. It is especially important to gain an understanding of the genetic characteristics of viruses circulating in the human population, to identify those mutations that are associated with the tropism of the virus, its contagiousness, as well as to establish the genetic characteristics of imported and autochthonous coronavirus genovariants, to conduct their differential diagnosis, which is a necessary condition for creating new ones. Diagnostic test systems that improve the quality of diagnosis of viral infections in humans and aimed at reducing the incidence of COVID-19.
Keywords: SARS-CoV-2, COVID-19, genovariants, molecular diagnostics, mutations, test system. Meditsinskie novosti. - 2022. - N4. - P. 5-10.
В настоящее время во всем мире регистрируется пандемия, обусловленная новой коронавирусной болезнью COVID-19, которая вызывается коронавирусом SARS-CoV-2 и представляет актуальную всемирную биологическую угрозу. Появление данного вируса привело к тяжелым последствиям для человечества, вызвав развитие тяжелого респираторного заболевания СО^-19, пандемия которого охватила все страны и континенты, унесла и продолжает уносить сотни тысяч человеческих жизней [1, 2, 18, 33].
В ходе эффективного противостояния этой беспрецедентной биологической угрозе мировое медицинское сообщество стремится разработать различные стратегии лечения и профилактики СОVID-19, успех реализации которых напрямую зависит от эффективности применяемых подходов, методов и технологий лабораторной диагностики инфекции.
Сегодня разработаны и применяются 2 основные группы методов микробио-
логической лабораторной диагностики, направленных на установление этиологии СОУЮ-19. Они включают молеку-лярно-генетические методы или методы генодиагностики, направленные на обнаружение РНК возбудителя, а также методы серодиагностики, выявляющие вирусоспецифические антигены и антитела к SARS-CoV-2 [9].
Текущим золотым стандартом для этиологической диагностики SARS-CoV-2 является полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-РВ-ПЦР) на биологических образцах, полученных из верхних дыхательных путей. Точность данного метода должна рассматриваться в первую очередь с позиций диагностической чувствительности, диагностической специфичности и предсказательной ценности положительного и отрицательного результатов. В целом потенциальные уязвимости ОТ-РВ-ПЦР включают общие преаналитические вопросы, такие как обоснование и выбор вида исследуемого биологического материала, неадекват-
ность процедуры взятия, обработки, транспортировки и хранения биологических образцов, сбор нецелесообразного или неадекватного биологического материала (по качеству или объему), наличие в биологических пробах ингибиторов, препятствующих адекватному проведению исследования, наличие ошибок при осуществлении ручных лабораторных манипуляций, а также конкретные лабораторные технические сложные аспекты, такие как контаминация биологического образца и тестирование пациентов, получающих антиретровирусную терапию [10].
Высокая востребованность привела к появлению в Республике Беларусь большого разнообразия различных коммерческих тест-систем, многие из которых уже получили регистрационное удостоверение изделия медицинского назначения, но у каждого есть свои особенности. Так, для моноплексных вариантов характерна более высокая чувствительность (до 500 ГЭ/мл) по сравнению
с мультиплексными вариантами (от 1000 до 10000 ГЭ/мл), тогда как мультиплексные наборы (несколько генов SARS-CoV-2) позволяют избежать появления ложноотрицательных результатов, обусловленных вариабельностью вируса (появление мутаций на месте посадки олигонуклеотидов). Необходимо также отметить, что иногда результаты, полученные при помощи ПЦР-тест-систем, выявляющих несколько вирусных генов, довольно сложно интерпретировать, что может быть связано с недостаточной оптимизацией олиго-нуклеотидного состава. Тем не менее заявленная чувствительность всех коммерческих наборов составляет 1000 ГЭ/мл. Кроме того, независимо от количества специфичных вирусных мишеней в тест-системе обязательно наличие внутреннего контроля, он может быть как эндогенным (ДНК человека), так и экзогенным (например, РНК-фаг). Внутренний контроль позволяет контролировать все этапы протокола от экстракции нуклеиновых кислот до ПЦР. Несмотря на очевидную необходимость внутреннего контроля, не все системы его включают [17, 27].
По техническим причинам такого контроля лишены наборы, основанные на изотермической амплификации, например, петлевой изотермической амплификации (loop-mediated isothermal amplification, или LAMP). Основные преимущества таких тестов - быстрота получения ответа (до 40 минут), отсутствие необходимости в хорошо оборудованной лаборатории и возможность проводить тестирование у постели больного (не требуется термоциклер). Чувствительность тестов на основе LAMP может достигать 1-3 копий РНК в реакцию. Однако, к сожалению, существующие коммерческие тест-системы не имеют заявленной чувствительности [20].
Безусловно, основные «внутренние» характеристики тест-систем для ОТ-РВ-ПЦР - аналитическая чувствительность и аналитическая специфичность, определяются производителем в лабораторных испытаниях, для которых используются специфические образцы с различными концентрациями и образцы, содержащие РНК других, «сезонных» коронавирусов (с целью исключения перекрестного реагирования - неспецифической амплификации коронавирусов, не относящихся к группе SARS).
Для контроля качества проведения исследований в лаборатории ис-
пользуются как контрольные образцы, которые входят в состав тест-системы (ПКО, ОКО - положительный и отрицательный контроли этапа выделения РНК, К+, К- - контроли этапа ПЦР ВКО - внутренний контроль), так и внешние контрольные образцы, ранее протестированные лабораторией, или образцы, полученные лабораторией по системе внешней оценки качества лабораторных исследований. К сожалению, в системе контроля качества молекулярно-генетических исследований в Республике Беларусь до настоящего времени отсутствует панель контрольных образцов.
Важным вопросом в оценке качества диагностикумов для ОТ-РВ-ПЦР является выбор праймеров и молекулярных зондов. Сегодня опубликовано уже несколько десятков работ исследователей разных стран с описанием олигонуклеотидов в ОТ-РВ-ПЦР-тест-системах для идентификации SARS-CoV-2. Анализ данных работ показывает, что существуют разные подходы к созданию ОТ-РВ-ПЦР-тест-систем для выявления SARS-CoV-2 [9, 10, 17, 27].
Наиболее простой и доступный вариант дизайна - это моноплексные тесты, в которых олигонуклеотиды выбраны на один ген вируса. Более сложные модификации позволяют создавать мультиплексные варианты, в которых олигонуклеотиды выбраны на разные гены. В последнем случае праймеры и молекулярные зонды могут иметь разную диагностическую и аналитическую специфичность, что также позволяет в процессе исследования дифференцировать SARS-CoV-2 от родственных коронавирусов и других вирусов респираторных инфекций [17, 27].
Следует понимать, что в геноме ко-ронавирусов идентифицировано достаточное количество регионов, способных выступать мишенями для ОТ-ПЦР - гены, кодирующие структурные белки, в том числе белок шипа, оболочки, трансмембранный протеин, хеликазу и нуклеокап-сид, РНК-зависимую РНК-полимеразу, гемагглютинин-эстеразу, фрагменты открытой рамки считывания 1a и 1b. Для выбора праймеров и молекулярных зондов на SARS-CoV-2 чаще всего используют гены вирусного нуклеокапсида (N1 и N2), ген РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP) и ген Е белка оболочки SARS-CoV-2. Так, для выявления пациентов с COVID-19 CDC (Centers for Disease
Control and Prevention - Центр по контролю и профилактике заболеваний США) рекомендует сначала провести скрининг на наличие гена Е, нуклеотидная последовательность которого не отличается от таковой у вируса SARS, а затем дифференцировать SARS от SARS-CoV-2 при помощи олигонуклеотидов на ген RdRP [10].
В соответствии с протоколом ВОЗ образцы тестируют на наличие генов N и Orflb, но предлагаемые олигону-клеотиды не позволяют различать SARS-CoV-2 и SARS, поэтому для окончательной идентификации вирусов рекомендуется использовать секвени-рование [5].
В таблице приведены открытые для всех желающих последовательности праймеров и зондов, рекомендуемые ВОЗ и CDC [1].
Таким образом, существуют разные подходы к выбору диагностически значимой мишени. Например, CDC предлагает использовать в качестве таковой фрагменты гена нуклеокапсида (N1, N2), тогда как ВОЗ - фрагмент гена E, а для подтверждения специфичности - фрагмент РНК-полимеразы [9, 24].
Следует подчеркнуть, что чувствительность и специфичность ОТ-РВ-ПЦР-реакции зависят не только от используемых мишеней, но в большей степени - от оптимизации условий реакции и дизайна применяемых праймеров и зондов. Убедительных доказательств предпочтительности определенных регионов-мишеней пока нет. Однако существует общий принцип повышения надежности путем выбора двух из них: один - в пределах консервативного для всех коронавирусов региона, другой -в высокоспецифичном для SARS-CoV-2 участке. Это позволяет избежать ложноположительных результатов при взаимодействии с эндемичными коронавирусами и предотвратить получение ложноотрицательного результата вследствие генетического дрейфа ко-ронавируса SARS-CoV-2, что является принципиально важным для молекулярной диагностики [1, 24].
Насколько для результатов ПЦР-тестирования важен факт генетических мутаций вируса SARS-CoV-2? С момента первого обнаружения SARS-CoV-2 в декабре 2019 года накопился значительный массив сведений об изменчивости генома и динамике распространения COVID-19 в странах мира. За период циркуляции в человеческой популяции
ЦабЗОнШ Олигонуклеотиды, рекомендованные ВОЗ и CDC для диагностики COVID-19
Локус Олигонуклеотиды Детектируют
ВОЗ
ORF1b-nsp14 HKU-ORF1b-nsp14F TGGGGYTTTACRGGTAACCT HKU- ORF1b-nsp14R AACRCGCTTAACAAAGCACTC HKU-ORF1b-nsp141P FAM-TAGTTGTGATGCWATCATGACTAG-BHQ1 SARS Coronavirus BetaCoV/bat Bat SARS-like Coronavirus SARS-CoV-2
N-gene HKU-NF TAATCAGACAAGGAACTGATTA HKU-NR CGAAGGTGTGACTTCCATG HKU-NP FAM-GCAAATTGTGCAATTTGCGG-BHQ1 SARS Coronavirus BetaCoV/bat Bat SARS-like Coronavirus SARS-CoV-2
CDC
Envelope protein E_Sarbeco_F ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT E_Sarbeco_R ATATTGCAGCAGTACGCACACA E_Sarbeco_P1 FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 SARS Coronavirus BetaCoV/bat Bat SARS-like Coronavirus SARS-CoV-2
N-gene N_Sarbeco_F CACATTGGCACCCGCAATC N_Sarbeco_R GAGGAACGAGAAGAGGCTTG N_Sarbeco_P FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BHQ1 SARS Coronavirus BetaCoV/bat Bat SARS-like Coronavirus SARS-CoV-2
RdRP gene RdRp_SARSr-F GTGARATGGTCATGTGTGGCGG RdRp_SARSr-R CARATGTTAAASACACTATTAGCATA RdRP SARSr-P1 FAM-CCAGGTGGWACRTCATCMGGTGATGC-BHQ1 RdRp SARSr-P2 FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BHQ1 SARS Coronavirus BetaCoV/bat Bat SARS-like Coronavirus SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 BetaCoV/ bat
геноварианты вируса подвергались фильтрации через иммунные системы каждого организма-хозяина, и при каждой передаче происходил некоторый отбор наиболее продуктивных и быстрее передающихся вариантов. На этот отбор влияет и противоэпидемическая деятельность человека, когда тщательно изолируются тяжелобольные, что способствует прекращению распространения наиболее патогенных вариантов.
Мутация (вирусная или генетическая) SARS-CoV-2 представляет собой изменение генетической последовательности вируса по сравнению с эталонной последовательностью, такие как Wuhan-Ни1 (первая идентифицированная генетическая последовательность) или USA-WA1/2020 (первая идентифицированная в США). Новый вариант (геновариант вируса или генетический вариант), или сублиния SARS-CoV-2, может иметь одну или несколько мутаций, которые отличают его от эталонных последовательностей или преобладающих вариантов вируса, уже циркулирующих в популяции. Варианты SARS-CoV-2 могут иметь разные характеристики. Например, некоторые из них распространяются легче или демонстрируют признаки устойчивости к существующим вариантам лечения, а некоторые могут не оказывать никакого воздействия по сравнению с предыдущим и циркулирующим в настоящее время вирусом [1, 11, 19, 33].
Наиболее информативным методом молекулярно-генетического анализа для идентификации геновариантов ко-ронавируса остается секвенирование. Особенностью пандемии, вызванной SARS-CoV-2, стало наличие самого большого количества последовательностей полного генома коронавируса, полученных за короткий период времени. Хотелось бы подчеркнуть, что полногеномное секвенирование никогда не было так близко к клиническому применению, как в случае пандемии COVID-19.
Существует несколько подходов для полногеномного секвенирования SARS-CoV-2. Классический метод -экстракция нуклеиновых кислот из носоглоточных и/или ротоглоточных мазков и дальнейшее истощение рибо-сомной РНК-хозяина с приготовлением библиотек и последующим секвениро-ванием по стандартным протоколам производителя [13]. Однако данный метод требует достаточного количества РНК вируса и большого количества прочтений. При малой вирусной нагрузке возможна наработка вируса на культурах клеток. Для этого проводят пассирование вируса с использованием клеточных линий Vero V Vero E6, LLC-MK2 и ряда других. Подходом, альтернативным культивированию на клеточных линиях, является полногеномная амплификация вируса SARS-CoV-2. На данный момент было разработано несколько таргетных панелей, позволяющих проводить полногеномное секвенирование SARS-CoV-2.
Одна из них - Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel (Thermo Fisher Scientific; США). Данная панель состоит из двух пулов праймеров для амплификации фрагментов длиной 125-275 пар оснований [4]. Другая панель была разработана Paragon Genomics Inc (США), она включает два пула праймеров и позволяет амплифицировать фрагменты длиной 99 пар оснований [20]. Потенциальня эффективность обнаружения SARS-CoV-2 с помощью панели от Paragon Genomics Inc - 1,15 копий вируса (с вероятностью 95%). Совместное использование двух перекрывающихся пулов праймеров позволяет обеспечить полное покрытие всего генома вируса, и расчетный предел обнаружения составляет 0,29 копий (с вероятностью 95%). Информация о пределе обнаружения SARS-CoV-2 с использованием панели AmpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel в настоящее время отсутствует.
Научный интерес представляют данные филогенетического анализа по нуклеотидным последовательностям геномов вируса SARS-CoV-2, полученным из образцов клинического материала в период с конца декабря 2019 по июль 2020 года, представленные на сайте организации GISAID (https://www.gisaid. org). Учеными было подтверждено наличие ключевых мутаций в геноме вируса SARS-CoV-2 в процессе его адаптации к организму человека при многократной передаче внутри человеческой популяции. Общее число мутаций, которые в совокупности имеют все секвениро-
ванные геномы вируса SARS-CoV-2, составили более тысячи, однако редкие из них зафиксировались и стабильно наследуются [3].
На ранних этапах развития пандемии COVID-19 (к середине января 2020 года) в геноме вируса SARS-CoV-2 стабильно были зафиксированы три основные группы мутаций, сформировавшие, соответственно, три ветви эволюционного развития от одного исходного генома вируса. Ключевые мутации, сформировавшие эти кластеры, следующие: кластер 1 (С8782Т Т28144С); кластер 2 ^11083Т, G26144T); кластер 3 (G1397A, G11083T Т28688С, или С6312А, G11083T С13730Т С23929Т, С28311Т). Основное число мутаций, сформировавших три данных кластера, относится к гену ORF1ab, большинство из которых приводит к замене аминокислот (позиции G1397A. С6312А, и G11083T в кластерах 3 и 2). Три другие, несинонимичные мутации, относятся к генам ORF8 (Т28144С, кластер 1), ORF3а ^26144Т кластер 2) и N (С28311Т кластер 3) [7, 16].
Развитие эволюционных направлений данных трех кластеров замедлилось к концу марта 2020 года, когда в основном обнаруживались варианты штаммов вируса с мутацией в генах ORF1b (позиция Р3Ж) и й ^6^). Появление единичной мутации в генах ORF1b (P314L или С14408Т) и й или A23403G) явилось самым существенным устойчивым изменением в геноме вируса SARS-CoV-2, в результате чего к настоящему времени подавляющее большинство (более 90%) выявляемых изолятов этого вируса имеет данную пару замен. Замена в гене й ^6^) многими исследователями ассоциируется с повышением способности вируса к передаче и снижением его патогенности. Последнее, однако, может быть объяснено и улучшением методологии лечения больных в ходе пандемии. Влияние мутации в гене ORF1b (Р3^) еще в процессе изучения исследователями. Появление и рост числа встречаемости данных мутаций в геномах вируса SARS-CoV-2, а также всеобщее распространение данных геновариантов отмечено в ряде публикаций [7, 15, 16, 23].
Распространение по всему миру геновариантов вируса SARS-CoV-2, имеющих мутации D614G (ген й) и Р3Ж (ген ORF1b), было обусловлено ускоренным процессом их связывания с клеткой
хозяина и проникновением в нее. На основе обобщения эпидемиологических данных было видно, что распространение штаммов новых геновариантов вируса ^»-кластер) ассоциировано не только с ростом заболеваемости, но и со снижением летальности [23].
Проведенный далее сравнительный анализ частоты мутаций на выборке из 8360 геномов показал, что большинство вновь секвенированных геномов вируса SARS-CoV-2, включая варианты, полученные из клинического материала за июль 2020 года, не отличались от генома штамма референса ^и!|апНи-1, N^045512.2) более чем на 10-12 единичных мутаций и редко имели более 15 единичных мутаций. Однако в значительном количестве геномов вируса SARS-Со^2 (>3% от общего числа геномов) в исследуемой выборке сохранялись всего 22 единичные мутации. Указанные 22 единичные мутации располагались в следующих генах: ORF1ab (12), й (2), ORF3а (2), ORF8 (1) и N (4), мутация в позиции С241Т относится к некодирующей области. Остальные гены в большинстве геновариантов вируса остались без изменений (М, Е, ORF6, ORF7ab и ORF10) [6, 28].
Функциональные характеристики указанных выше генов, несущих закрепившиеся мутации, можно разделить на две основные группы: гены, ответственные за синтез неструктурных белков вируса - ORF1ab, ORF3а и ORF8, и гены, синтезирующие соответствующие структурные белки вириона - й и N. Белок S образует гомотримерные шипы на поверхности вирусной частицы и опосредует вход вируса в клетку хозяина. Белок N связывает вирусную РНК и требуется для упаковки вирусной РНК в вирусную частицу во время ее сборки. В то же время белки М и Е не имеют закрепившихся мутаций, хотя являются важными в структуре вириона - белок М придает ему форму и имеет решающее значение вместе с белком Е в организации сборки вируса и формировании зрелых вирусных частиц [2, 21, 32]. Таким образом, важные гены вируса SARS-CoV-2, необходимые для его взаимодействия с клеткой хозяина и связывания вирусной РНК, имеют мутации, закрепившиеся в процессе эволюционной адаптации к организму человека.
Обобщая вышеизложенное, можно утверждать, что геноварианты вируса SARS-CoV-2 из кластеров 1-3 в настоящее время имеют слабое влияние на
эпидемиологическую ситуацию. Число образцов клинического материала, содержащего такие геноварианты вируса, на территории абсолютного большинства стран составляет 7% и менее. Причиной этому послужило появление и широкое распространение геновариантов из «G»-кластера, более адаптированных к организму человека, которые конкурентно вытеснили первичные геноварианты, уже циркулирующие на территории всех континентов.
В дальнейшем в экспериментальной работе [22] были представлены доказательства того, что геноварианты вируса с мутацией в S-белке ^6^) демонстрируют повышенную инфекционную активность (в 5 раз) в клетках, экспрес-сирующих АСЕ2, без участия мутации Р3Ж в гене ORF1b при тестировании в псевдотипированных лентивирусных векторах.
Сегодня наблюдается повсеместное распространение геновариантов вируса SARS-CoV-2, имеющих мутацию D614G (ген й) и Р3^ (ген ORF1b), в отличие от геновариантов вируса SARS-CoV-2, не имеющих данных мутаций, что, видимо, обусловлено ускоренным процессом связывания вируса с клеткой хозяина и проникновением в нее. Характерно, что указанный тренд наблюдается как в мире в целом, так и при независимом анализе в разрезе отдельных регионов, что подтверждает наличие эволюционного преимущества новых геновариантов [21, 28].
В научной литературе описано две гипотезы, объясняющие, как мутация D614G связана с повышенной передачей вируса SARS-CoV-2. Первая гипотеза основана на структурном положении мутации D614G [22, 30] и связана с уменьшением взаимодействия между субъединицами S1 и S2 в S-белке, которое способствует их облегченному расщеплению и, соответственно, дальнейшему слиянию вируса со стенкой клетки хозяина, а также последующему проникновению в клетку. Вторая гипотеза состоит в том, что эта мутация может косвенно усилить взаимодействие рецептор-связывающего домена на поверхности субъединицы S1 белка S-вируса с ангио-тензинпревращающим ферментом 2 (связь RBD-ACE2), что также способствует ускоренному взаимодействию частицы вируса с клеткой [29, 30]. Следует подчеркнуть, что распространение штаммов «G»-кластера ассоциировано не только с ростом заболеваемости (до 200 и
более тысяч ежедневно выявляемых инфицированных), но и со снижением летальности.
Таким образом, одним из актуальных вопросов оценки глобального риска, связанного с пандемией COVID-19, остается интерпретация наблюдаемых изменений в геноме, что имеет значение для долгосрочного прогноза развития эпидемического процесса. И, безусловно, особого внимания заслуживает изучение биологических свойств геновариантов SARS-CoV-2.
К категории приоритетного эпидемиологического значения (variants of concern, VOC) по классификации ВОЗ отнесены следующие генетические варианты SARS-CoV-2: Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1) и доминирующий в период август - ноябрь 2021 года в большинстве регионов мира Delta (B.1.617.2, включая все варианты AY) [8, 12, 14, 25, 26].
Новый геновариант короновиру-са - омикрон, B. 1.1.529, SARS-CoV-2, 30 ноября 2021 года был определен США как вариант, вызывающий озабоченность (VOC). Первый подтвержденный случай омикрон в Соединенных Штатах был выявлен 30 ноября 2021 года. Вариант омикрон имеет значительно больше мутаций, чем предыдущие варианты SARS-CoV-2, особенно в S-гене, кодирующем спайко-вый белок вируса. Некоторые мутации в омикронном варианте SARS-CoV-2 (B.1.1.529) приводят к значительному снижению чувствительности в N-гене или S-гене генетической мишени, которая охватывает часть гена, в которой происходит мутация. В тестах, предназначенных для обнаружения нескольких генетических мишеней, где только одна генетическая мишень имеет пониженную чувствительность из-за мутации, ожидается, что тесты все же обнаружат омикронный вариант SARS-CoV-2. Схема обнаружения, показывающая выпадение или отказ пораженной генетической мишени, может помочь сигнализировать о наличии варианта омикрон в образце пациента с положительным результатом в случае последующего секвенирования образца. Однако положительный результат теста на SARS-CoV-2 с помощью одного из этих тестов не означает, что человек инфицирован вариантом омикрон. Кроме того, не все образцы пациентов с вариантом омикрон обнаруживают мутацию, приводящую к выпадению гена. Следовательно, вариант омикрон все еще может присутствовать без паттерна
обнаружения выпадения гена [8, 12, 14, 25, 26].
Таким образом, важно понимать, что наличие мутаций вируса SARS-CoV-2 в образце пациента может потенциально повлиять на эффективность ОТ-РВ-ПЦР-теста. Влияние мутаций на эффективность теста зависит от нескольких факторов, включая последовательность варианта, дизайн теста и распространенность варианта в популяции.
В феврале 2021 года Food and Drug Administration (FDA) выпустило «Политику оценки влияния вирусных мутаций на тесты на COVID-19», которая содержала рекомендации по оценке потенциального влияния возникающих и будущих вирусных мутаций SARS-CoV-2 на тесты на COVID-19 для продолжительность чрезвычайной ситуации в области общественного здравоохранения, связанной с COVID-19, включая соображения по дизайну тестов для сведения к минимуму воздействия вирусных мутаций и рекомендации по постоянному мониторингу.
23 сентября 2021 года FDA пересмотрело перечень некоторых разрешенных молекулярных, антигенных и серологических тестов, чтобы установить дополнительные условия авторизации в ответ на продолжающееся появление новых вариантов SARS-CoV-2. Данные условия требуют, чтобы разработчики тестов обновили свою авторизованную маркировку и, среди прочего, оценили влияние мутаций вируса SARS-CoV-2 на эффективность своего теста.
Эволюция SARS-CoV-2 продолжается и требует непрерывной научной оценки с использованием передовых методов анализа генетических последовательностей. Появление и распространение новых генетических вариантов коро-навируса SARS-CoV-2, обладающих мутациями, способствующих повышению его трансмиссивности и/или снижению эффективности молекулярно-генети-ческой диагностики, а также снижению эффективности иммунного ответа, выработанного в отношении ранее циркулировавших штаммов вируса SARS-CoV-2 в результате инфекции или вакцинации, что представляет угрозу для здравоохранения во всем мире.
Персонал клинических лабораторий и поставщики медицинских услуг должны знать, что ложноотрицательные результаты могут быть получены при любом молекулярном тесте для обнаружения SARS-CoV-2, особенно если мутация происходит в части генома вируса,
оцениваемой этим тестом. Нарушения в вирусном геноме могут привести к изменениям в вирусных белках и, следовательно, могут повлиять на эффективность молекулярно-генетического и/или серологического теста.
Мы рекомендуем врачам-инфекционистам, сотрудникам специализированных клинических лабораторий, использующим тесты на SARS-CoV-2, и отечественным разработчикам тест-систем для ОТ-РВ-ПЦР для диагностики инфекции COVID-19, учитывать следующее:
- регулярно возникают генетические варианты SARS-CoV-2, и вследствие этого возникают ложноотрицательные результаты ПЦР-тестов;
- отрицательные результаты моле-кулярно-генетического тестирования должны рассматриваться в сочетании с клиническими наблюдениями, историей болезни и эпидемиологической информацией;
- необходимость проведения повторного тестирования с использованием иной ПЦР-тест-системы, если подозрение на COVID-19 сохраняется после получения отрицательного результата теста;
- некоторые геноварианты SARS-Со^2 могут повлиять на производительность теста;
- тесты с отдельными мишенями более восприимчивы к изменениям производительности из-за вирусных мутаций, а это означает, что они с большей вероятностью не смогут обнаружить новые геноварианты;
- тесты с несколькими мишенями с большей вероятностью будут продолжать работать, как описано в маркировке теста, по мере появления новых вариантов. Множественные мишени означают, что молекулярный тест предназначен для обнаружения более одного участка генома SARS-CoV-2 или, в случае тестов на антиген, более одного участка белков, составляющих SARS-CoV-2.
Безусловно, наиболее полную информацию по всем имеющимся мутациям в геноме исследуемого изолята коронавируса ученые получают при использовании полногеномного секве-нирования, однако данный метод еще не может применяться так широко, как ОТ-РВ-ПЦР требует значительных затрат, а также имеет более сильное ограничение по минимальному содержанию РНК SARS-CoV-2 в образце. С учетом данных факторов для обеспечения более
широкого охвата для молекулярно-эпи-демиологического мониторинга целесообразно использовать метод ОТ-РВ-ПЦР для выявления маркеров уже известных наиболее значимых генетических вариантов вируса.
Этот подход позволит динамично обновлять методику путем расширения спектра анализируемых мутаций, включения в следующие версии генетических маркеров новых появляющихся вариантов SARS-CoV-2, представляющих приоритетное значение.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Кузнецова Н.А., Почтовый А.А., Никифорова М.А., Гущин В.А. // Вестник РГМУ. - 2020. -№2. - С.21-25.
2. Ashour H.M., Elkhatib W.F, Rahman Md.M., Elshabrawy H.A. // Pathogens. - 2020. - Vol.9, N3. -P.186. Doi: 10.3390/pathogens9030186.
3. Available from: https://gisanddata.maps.arcgis. com/apps/ opsdashboard/index.html#/bda7594740f d40299423467b48e9ecf6.
4. Available from: https://www.thermofisher.com/ru/ ru/home/lifescience/ sequencing/dna-sequencing/ microbial-sequencing/microbial-identification-ion-torrent-next-generation-sequencing/viral-typing/ coronavirus-research.html.
5. Available from: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20. pdf?sfvrsn=af1aac73_4.
6. Benvenuto D., et al. // Pathog. Glob. Health. - 2020. - Vol.114, N2. - P.64-67. Doi: 10.1080/20477724.2020.1725339.
7. Bhattacharyya Ch., et al. // bioRxiv. - 2020. Doi:10.1101/2020.05.04.075911.
8. Callaway E. // Nature. - 2021. - Vol.600 (7887). -P.21. Doi:10.1038/d41586-021-03552-w. PMID 34824381. S2CID 244660616.
9. Cheng M.P. // Ann. Intern. Med. - 2020. - Vol.172, N11. - P.726-734. Doi: 10.7326/M20-1301.
10. Corman VM., et al. // Euro Surveill. - 2020. - Vol.25, N3. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
11. Cui J., Li F, Shi Z.-L. // Nat. Rev. Microbiol. -2019. - Vol.17, N3. - P.181-192. Doi: 10.1038/ S41579-018-0118-9.
12. Davies N.G., et al. // Science. - 2020. - Vol.372 (6538): eabg3055. Doi:10.1126/science.abg3055.
13. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen / FM. Marty, K. Chen, K.A. Verrill // 2020. Doi: 10.1056/NEJMvcm2010260.
14. Investigation of novel SARS-CoV-2 variant: Variant of Concern 202012/01 / M. Chand, et al. // Public Health England. Archived from the original on 22 February 2021.
15. Korber B., et al. // bioRxiv. - 2020. Doi: 10.1101/2020.04.29.069054.
16. Kupferschmidt K. // Science. - 2020. -Vol.369 (6501). - P.238-239. Doi: 10.1126/ science.369.6501.238.
17. Li C., et al. // bioRxiv. - 2020. Doi: 10.1101/2020.03.12.988246.
18. Li X. // J. Med. Virol. - 2020. - Vol.92, N5. -P.501-511. Doi: 10.1002/jmv.25701.
19. Lu R., et al. // The Lancet. - 2020. - Vol.395 (10224). - P.565-574. Doi: 10.1016/S0140-6736(20)30251-8.
20. Lu R., et al. // Virologica Sinica. - 2020. -Vol.35. - P.344-347.
21. Mousavizadeh L., Ghasemi S. // J. Microbiol. Immunol. Infect. - 2020. - Vol.54, N2. - P.159-163. Doi: 10.1016/j.jmii.2020.03.022.
22. Ogawa J., et al. // bioRxiv. - 2020. Doi: 10.1101/2020.07.21.214932.
23. Pachetti M., et al. // J. Transl. Med. - 2020. -Vol.18. - P.179. Doi: 10.1186/s12967-020-02344-6.
24. Pang J., et al. // J. Clin. Med. - 2020. - Vol.9, N3. - P.623.
25. Preliminary genomic characterisation of an emergent SARS-CoV-2 lineage in the UK defined by a novel set of spike mutations / A. Rambaut, et al. // Written on behalf of COVID-19 Genomics Consortium UK. Archived from the original on 22 February 2021.
26. Roberts M. Covid-19: New mutation of Delta variant under close watch in UK / M. Roberts. - 2021. www.bbc.co.uk.
27. Shen M., et al. // J. Pharm. Anal. - 2020. - Vol.10, N2. - P.97-101.
28. Van Dorp L., et al. // Infect. Genet. Evol. -2020. - Vol.83. - P.104351. Doi: 10.1016/j. meegid.2020.104351.
29. Walls A.C., et al. // Cell. - 2020. - Vol.181, N2. -P.281-292. Doi: 10.1016/j.cell.2020.02.058.
30. Wrapp D., et al. // Science. - 2020. - Vol.367 (6483). - P.1260-1263. Doi: 10.1126/science.abb2507.
31. Wu F, et al. // Nature. - 2020. - Vol.579 (7798). -P.265-269. Doi: 10.1038/s41586-020-2008-3.
32. Zhao Z., et al. // BMC Evol. Biol. - 2004. -Vol.4. - P.21. Doi:10.1186/1471-2148-4-21.
33. Zhou P., et al. // Nature. - 2020. - Vol.579 (7798). -P.270-273. Doi: 10.1038/s41586-020-2012-7.
Поступила 10.12.2021 г.
m
www.mednovosti.by
Повысить цитируемость? Легко!
Цитируемость научной публикации напрямую зависит от популярности научного журнала, его общей цитируемости и размещения публикуемой статьи в интернете.
Публикуясь в высокоцитируемом журнале "Медицинские новости" (издание входит в перечень ВАК Республики Беларусь и ряда стран СНГ), Вы повышаете цитируемость своих статей.
Медицинские новости - самое высокоцитируемое периодическое издание среди журналов медицинского профиля в Беларуси. В электронных библиотеках eLIBRARY.ru журнал "Медицинские новости" имеет цитируемость - 11 009, индекс Хирша - 14, impact factor - 0,237, число просмотров статей в 2020 г. - 11 606, а в КиберЛенинке: просмотр статей - 1 660 763, копирование статей - 205 948.
Редакция журнала "Медицинские новости" по заказу авторов размещает опубликованные статьи на своем сайте, что существенно повышает доступность публикации и вероятность ее цитирования. Возможно ретроспективное размещение Ваших статей, опубликованных в прошлые годы в журнале "Медицинские новости", на нашем сайте mednovosti.by.
Сайт mednovosti.by имеет более 320 000 посещений в месяц из 124 стран.
Привлечение интернет-технологий позволяет в десятки раз повысить свою «узнаваемость» среди своих коллег не только в научном сообществе страны, но и далеко за ее пределами, а также цитируемость научных публикаций, читаемость и востребованность, что ускоряет сроки внедрения научных достижений и передового опыта в практическое здравоохранение.
Публикуясь в журнале "Медицинские новости" с последующим размещением на сайте mednovosti.by, Вы автоматически попадаете в электронные бибилиотеки eLIBRARY.ru и КиберЛенинку и существенно повышаете свою цитируемость.
Тел. редакции (+37517) 373-07-01; моб. (+375 29) 69 59 419. E-mail: redakcia1995@mail.ru
