КОРОНАВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ (МУТАЦИИ, ГЕНОТИПЫ)

Хайтович А. Б.; Ермачкова П. А.

УДК: 616.98-036-07-08:578.834.11 DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-1-61-75

КОРОНАВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ (МУТАЦИИ, ГЕНОТИПЫ)

Хайтович А. Б., Ермачкова П. А.

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия

Для корреспонденции: Хайтович Александр Борисович, доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского», е-mail: [email protected]

For correspondence: Aleksandr B. Khaitovich, MD, Professor of the Department of Microbiology, Virusology and Immunology, Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, е-mail: [email protected]

Information about author:

Khaitovich A. B., http://orcid.org/0000-0001-9126-1182 Yermachkova P. A., http://orcid.org/0000-0002-8782-4007

РЕЗЮМЕ

В публикации проанализированы исследования о выявленных мутациях и их влиянии на изменчивость коронавирусов; о выделенных генотипах (линиях, кластерах, клайдах) у SARS-CoV-2, которые имеют важное значение для: оценки биологических свойств коронавирусов; определения эпидемиологических путей заноса и распространения вируса; изучения эволюции и происхождении вируса; определения влияния вируса на клинические проявления; разработки лекарственных препаратов, воздействующие на некоторые мишени вируса. В работе описаны генотипы (кластеры, типы, линии) у SARS-CoV-2 и их географическое и временное распространение.

Ключевые слова: коронавирус, геном, мутации, генотипы, кластеры, типы, линии, S-белок.

CORONAVIRUS (GENOME STRUCTURE, REPLICATION) Khaitovich A. B., Yermachkova P. A.

Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia

SUMMARY

The publication analyzes studies on identified mutations and their impact on the variability of coronaviruses; on the identified genotypes (lines, clusters, clades) in SARS-CoV-2, which are important for: assessing the biological properties of coronaviruses; determination of the epidemiological pathways for the introduction and spread of the virus; studying the evolution and origin of the virus; determining the effect of the virus on clinical manifestations; drug development that targets some of the targets of the virus. The work describes the genotypes (clusters, types, lines) of SARS-CoV-2 and their geographical and temporal distribution.

Key words: coronavirus, genome structure, mutations, genotypes, clusters, types, lines, S-protein.

В ранее опубликованных работах описана современная таксономия и классификация коронавирусов, которые известны с 30-х годов прошлого столетия, выделенные от различных источников, в том числе от млекопитающих, птиц и других представителей животного мира [1; 2]. В этих работах описаны коронавирусы, имеющие медицинское значение и вызывающие заболевания среди людей, а также обобщены данные иностранных и отечественных исследований, посвященные структуре, генома и репликации, и их особенностям у 7 видов ко-ронавирусов, вызывающие заболевания среди людей. В работах большое внимание уделяется описанию вируса 8ЛЯ8-СоУ-2, который вызвал пандемию СОУГО-19, продолжающуюся до настоящего времени [1; 2]. Данная публикация яв-

ляется продолжением работ по обобщению многочисленных результатов исследований вируса 8ЛЯ8-СоУ-2 и посвящена мутациям и генотипам этого вируса. Полученные данные играют существенную роль в понимании эволюции вируса, его происхождения, изменении его патогенности и инфекционности, лечении заболевания, разработке профилактических препаратов и других проблемных вопросах.

Мутации.

Мутации - это изменения в кодирующей последовательности генома, которые ведут к изменениям структуры и функции различных биологических объектов, в том числе и вирусов, и передаются по наследству. Различают спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации происходят при отсутствии каких-ли-

2021, т. 11, № 1

бо воздействий из вне, способные вызвать изменения в нуклеиновой кислоте, и чаще всего связаны с ошибками при репликации (частота -106-109), что может приводить к изменениям в геноме, влияющие на структуру и функцию вирусных частиц, в том числе и у коронавирусов (HCoV). Индуцированные мутации продуцируются мутагенами и повышают частоту спонтанных мутаций. Мутации возникают тремя типами молекулярных изменений: точечная - нуклео-тидная замена (изменение единственного кодо-на, кодирующий одну аминокислоту) в мРНК и изменяет аминокислотную последовательность в протеине; сдвиг рамки считывания (frameshift) делеции или вставки нуклеотидов; интеграция транспозонов, IS-последовательностей в нуклеиновой кислоте (делеция) и включение новых фрагментов нуклеиновой кислоты, которые вызывают чрезвычайные изменения в генах.

РНК-вирусы характеризуются высокой частотой мутаций, которые до миллиона раз превышают у их хозяев. Частота мутаций управляет эволюцией вируса и вариабельностью генома, тем самым позволяя вирусам избегать иммунный ответ организма, развивать лекарственную устойчивость, влиять на патогенность вируса, изменять клиническое течение патологических процессов. Мутации отмечены у всех вирусов, в том числе и у коронавирусов. Геномы корона-вирусов, размер которых колеблется примерно между 26 000 и 32 000 основаниями, включает в себя переменное число (от 6 до 11) открытых рамок считывания (ORFs). Первая ORF, составляющая примерно 67% всего генома, кодирует 16 неструктурных белков, в то время как остальные кодируют вспомогательные и структурные белки [3]. Трансляция обеих ORF приводит к синтезу двух полипротеинов, которые подвергаются действию вирусных протеиназ для высвобождения компонентов комплекса репликации-транс-

крипции и имеет некоторые отличия у разных видов HCoV (рис.1) [4; 5; 6].

Мутации в S-белке (рецептор-связываю-щем домене коронавирусов).

Из тринадцати мутаций, идентифицированных в области, кодирующей S-белка, шесть -были в субъединице S2, где по две - находились в слитом пептиде (FP) и в гептадном повторе 1 (HR1). Когда мутации S2 были выявлены на фоне мышиного коронавируса (MHCoV) дикого типа, карциноэмбриональным антигеном мышиным (mCEACAM), опосредованная инфек-ционность была сильно затруднена. Вместе с тем, комбинации четырех изменений остатка S2 опосредовали расширение диапазона хозяев [7]. В другом исследовании было продемонстрировано, что парные мутации в домене HR1 и FP ге-паран сульфат связывающего варианта MHCoV были достаточными для устранения зависимости с карциноэмбриональным антигеном человека (hCEACAM), а не mCEACAM в качестве рецептора, расширяя диапазон хозяина [8; 9; 10].

Показано, что S-белки всех коронавиру-сов имеют большое сходство, особенно в S2-областях, но они значительно отличаются в деталях и механизмах проникновения. Специфичность связывания рецепторов различна; кон-формационные последствия связывания рецепторов различаются; время протеолитического расщепления по отношению к высвобождению вируса, прикреплению и интернализации (от лат. interims — внутренний, что означает процесс освоения внешних структур, в результате которого они становятся внутренними регуляторами), также отличаются [11; 12].

Рецептор-связывающий домен (RBD) в белке шипа это наиболее вариабельная часть генома HCoV. Установлено, что мутация шести аминокислот в RBD является критической для связывания с рецепторами ACE2 (angiotensin-

Н С о V ! : < • у с

" üRFlfe — 5 - *» «

HCoV-NLiS 5 (

ORFtb ~ £ - J EH*]—СЮ"

WCDV.OC43 S

HCDV-HKUI S

SARS CuV 5'

M£R5-CoV 5

CRFlb " SS " "£ " S " JYS2 E" «2

E-C0»"* ORF,b - HE — 5 — ч ЭЧ H1

Рис. 1. Схемы сравнительного строения геномов у коронавирусов разных видов, вызывающих заболевания у людей [4, 5]. Условные обозначения:

А. Структура геномов у вирусов HCoV 229Е, HCoV КЬ63, HCoV ОС43, HCoV НКШ, SARS-CoV, MERS-

CoV; В. Структура генома вируса SARS-CoV-2.

converting enzyme 2) и для определения диапазона хозяев SARS-CoV-подобных вирусов. Координаты мутаций в SARS-CoV - Y442, L472, N479, D480, T487, Y4911, которые соответствовали L455, F486, Q493, S494, N501, Y505 в SARS-CoV-2, где пять, из этих шести остатков, различаются между собой. Анализ показал, что SARS-CoV-2 может связывать человеческий ACE2 с высокой степенью аффинности. Для оценки степени аффинности использовались вычислительные методы и проведенный анализ показывает, что взаимодействие вируса с клеткой не являлись идеальным; последовательность RBD SARS-CoV-2 отличается от SARS-CoV и связь не оптимальная для связывания рецептора. Поэтому высокоаффинное связывание S-белка спайка SARS-CoV-2 с человеческим ACE2, вероятнее, является результатом естественного отбора на человеческом, или подобном человеку ACE2, который позволяет возникать другому оптимальному связыванию. Это может быть одним из доказательств того, что SARS-CoV-2 не является продуктом целенаправленных манипуляций (рис. 2) [6; 13; 14; 15].

Рис. 2. Строение S-белка у коронавирусов разных видов [6].

Условные обозначения: Общая структура RBD SARS-CoV-2, связанного с АСЕ2.

(а) Общая топология мономера шиповидного белка SARS-CoV-2. NTD, ^терминальный домен. RBD, рецептор-связывающий домен. RBM, рецептор-связывающий мотив. SD1, поддомен 1. SD2, поддомен 2. FP, пептид слияния. HR1, геп-тадный повтор 1. HR2, гептадный повтор 2. ТМ, трансмембранная область. 1С, внутриклеточный домен.

(б) Последовательность и вторичные структуры RBD SARS-CoV-2. RBM окрашен в красный цвет.

(с) Общая структура RBD SARS-CoV-2, связанного с АСЕ2. АСЕ2 окрашен в зеленый цвет. Ядро RBD SARS-CoV-2 окрашено в голубой цвет, а RBM — в красный. Дисульфидные связи в RBD SARS-CoV-2 показаны в виде линии и обозначены желтыми стрелками. ^концевая спираль АСЕ2, ответственная за связывание, помечена.

Исследования АСЕ2 рецептора на мышах показало, что изменение структуры рецептора, может привести к изменению концентрации Ang II и Ang (1-7), а также апелина, нейротензина, кинина, что может служить одним из подходов к лечению COVID-19 [6, 16]. Кроме того, некоторые исследования показали эффективное действие противовоспалительного, иммуноде-прессивного стероидного препарата - дексаме-тазона - на течение коронавирусной инфекции и снижение риска возникновения осложнений

[17; 18].

Мутация у SARS-CoV-2 в гене RdRp.

Мутагенная способность вируса зависит от нескольких факторов, включая точность вирусных ферментов, реплицирующих нуклеиновые кислоты, таких как РНК-зависимая РНК-полимераза SARS-CoV-2 (от англ. RNA-dependent RNA-polymerase - RdRp). Проведен геномный анализ 220 геномных последовательностей у вирусов, выявленных у инфицированных пациентов SARS-CoV-2 в различных странах (с декабря 2019 г. по март 2020 г.) [19]. Данные о структуре геномов взяты из баз данных GISAID и GenBank и затем математически обработаны. Проведено выравнивание геномов с использованием Clustal Omega (программа выравнивания между тремя или более последовательностями), а для оценки статистической значимости применяли U-критерий Манна-Уитни (от англ. MannWhitney U-test - статистический критерий, используемый для оценки различий между двумя независимыми выборками по уровню какого-либо признака, измеренного количественно) и критерий Фишера (F-критерий - статистический критерий при выполнении нулевой гипотезы имеет F-распределение и проводится путём сравнения значения статистики с критическим значением распределения Фишера при заданном уровне значимости) [20; 21]. Результат исследований выявил 8 новых повторяющихся мутаций у SARS-CoV-2, расположенных в позициях 1397, 2891, 14408, 17746, 17857,18060, 23403 и 28881. Мутации в положениях 2891, 3036, 14408, 23403 и 28881 наблюдаются преимущественно в Европе, а мутации, расположенные в позициях 17746, 17857 и 18060 обнаружены исключительно в Северной Америке. Впервые в исследовании была выявлена и предсказана молчащая мутация, связывающая фрагмент в гидрофобном расщеплении SARS-CoV-2 в гене RdRp, которая соседствует с идентифицированной мутацией 14408 - в Англии (в штамме от 9 февраля 2020 г.). Другая мутация в RdRp, изменяющая его аминокислотный состав появилась 20 февраля 2020 г. в Ломбардии, Италия. Вирусы с мутацией RdRp имели медиану из 3

точечных мутаций с диапазоном 2-5 или медиану из 1 мутации с диапазоном 0-3 (значение р <0,001). В настоящее время для лечения БЛЯБ-СоУ-2 используется несколько препаратов, нацеленных на ферменты RdRp, некоторые из них имеют предсказанный связывающий фрагмент в гидрофобной расщелине БЛЯБ-СоУ-2 RdRp, которая соседствует с идентифицированной мутацией 14408, это свидетельствует о возможной предрасположенности вирусных фенотипов к лекарственной резистентности [20; 21]. До сих пор наиболее часто используемым и надежным тестом для диагностики COVID-19 является ОТ-ПЦР, выполняемая с использованием мазков из носоглотки или других образцов из верхних дыхательных путей. Используются различные гены-мишени РНК, при этом часть тестов направлены на обнаружение RdRp и ORF1. Прай-мерный зонд RdRpSARSr имеет более низкую чувствительность, чем другие тесты [22].

Мутация G614 (мутация D614 в настоящее время называется G614). Мутация в геноме БЛЯБ-СоУ-2 повышает вероятность HCoV проникать в клетки организма человека от 2,5 до 8 раз. В результате точечной мутации G614 произошла замена в 614 аминокислоте, участвующей в строительстве S-белков оболочки вируса, с помощью которого он прикрепляется к рецепторам клетки, с аспарагиновой кислоты - на глицин. Эта мутация в ранний период пандемии была характерна для более, чем половины изученных штаммов вируса, а в настоящее время встречается повсеместно, и помогает вирусу проникать в организм, ускорять его распространение между самыми разными типами человеческих клеток, приводит к большей вирусной нагрузке у человека. Мутация G614 почти всегда встречается вместе с другой мутацией P314L и меняет работу участка ORF1b, который важен для копирования РНК-вируса и его размножения внутри зараженных клеток. При этом наиболее сильно могут пострадать легкие, печень и кишечник, т.е. мутации оказывают влияние на клинические проявления и вызывает полиорганные поражения с тяжелыми формами заболевания. Кроме того, мутация G614 делает вирус более устойчивым к иммунитету и вероятно может усиливать патогенность за счет увеличения степени кон-тагиозности, что проявится в появлении новых штаммов [23; 24; 25].

Мутации в 103 геномах SARS-CoV-2. В ходе обработок баз данных было отобрано 103 штамма с имеющимися мутациями. У штаммов БЛЯБ-СоУ-2 ^С 045512), RaTG13 и GD Pangolin-CoV наследственное состояние определялось на основании сравнения геномных последовательностей и выравниваний. Ресурс для анализа и

сравнение геномов, созданного в University of California, Santa Cruz, основан на инструменте поиска BLAT (программа для быстрого нахождения 95% последовательностей и установления сходства длиной 25 оснований и более). В общей сложности идентифицировано мутаций в 149 участках геномных последовательностей среди 103 секвенированных штаммов. Родовые состояния были определены как 43 повторяющиеся (синомимические), 83 - не неповторяющиеся (несиномимические), две стоп-мутации. Выявленные мутации были как синомимиче-ские - 65,1% (28/43), так и не синомимические (уникальные мутации) - 84,3% (70/83). Полученные результаты указывают на недавнее происхождение этих мутаций. Несинонимичные мутации, которые имели производные аллели, по крайней мере, в двух штаммах SARS-CoV-2, затрагивали шесть белков, как в структурных, так и неструктурных белков: ORF1ab (A117T, I1607V, L3606F, I6075T), S (H49Y, V367F), ORF3a (G251V), ORF7a (P34S), ORF8 (V62L, S84L) и N (S194L, S202N, P344S) [26], что указывает на возможности происхождения мутаций в структуре разных белков у SARS-CoV-2.

Мутация, вызвавшая делецию размером 382 н.п., в нуклеотидной последовательности генома вируса.

Делеция 382 нп в нуклеотиде штаммов SARS-CoV-2 усекает открытую рамку считывания 7b (ORF7b) и ORF8; удаляет регуляторную последовательность транскрипции ORF8 (TRS); устраняет транскрипцию ORF8. Самый ранний вариант делеции 382 н.п. был обнаружен в Сингапуре 29 января 2020 г., причем вирусы с делецией циркулировали в стране и составляли 23,6% (45/191) образцов SARS-CoV-2, проверенных в этом исследовании. Затем SARS-CoV-2 с такой же мутацией была обнаружена на Тайване. Мутации одновременно с другими удалениями в белке ORF 7b / 8 различной длины, от 62 до 345 нп, были обнаружены и в других географических точках, включая Австралию, Бангладеш и Испанию [27].

Аналогичная мутация описана во время эпидемии атипичной пневмонии в 2003/2004 г. в ORF8 SARS-CoV, когда также наблюдалось ряд делеций, и в конечном итоге варианты их стали преобладающими, что привело к гипотезе, что ORF8 был эволюционной точкой для адаптации SARS-CoV к людям. Мутации в ORF8 SARS-CoV были связаны со снижением репликативной приспособленности и ослаблением вируса. Тем не менее, из-за успешного контроля эпидемии атипичной пневмонии, важность этих мутаций для эпидемиологической оценке SARS-CoV у людей, не была установлена [28; 29; 30; 31].

Делеционные вирусы SARS-CoV-2 с мутацией 382 н.п. показали значительно более высокую репликативную приспособленность in vitro по сравнению с диким штаммом, тогда как в вирусной нагрузке у пациентов не наблюдалось различий, что указывает на то, что варианты мутационных вирусов сохранили свою репликативную приспособленность. При инфекции SARS-CoV-2 наблюдался устойчивый антительный ответ на ORF8, что позволяет предположить, что появление делеций ORF8 может быть связано с иммунным отбором и во время продолжительной передачи SARS-CoV-2 в человеческой популяции могут возникать дополнительные варианты де-леции среди штаммов, выделенных от людей. Появление нескольких штаммов SARS-CoV-2 с делециями ORF8 в сочетании с доказательством сильного иммунного ответа на ORF8 указывает на то, что отсутствие ORF8 может способствовать уклонению от иммунной системы хозяина. Полученная информация может иметь ключевой характер об эволюционном поведении SARS-CoV-2 по мере адаптации вируса к новым человеческим хозяевам и появлении новых вариантов [28].

Мутация в RBD белка-шипа в положении

501. В настоящее время (декабрь 2020 г.) в Великобритании обнаружено несколько новых и, вероятно, более инфекционных штаммов ко-ронавируса - это VOC202012/01 и N501Y (мутация в RBD белка-шипа в положении 501, где аминокислота аспарагин N заменена тирозином Y), а также делеции 144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H. Мутация N501Y располагается около связи с рецептором ACE2, что приводит к прочному связыванию вируса с рецептором и придает преимущество данному штамму в способности заражать клетки. Исследования показывают, что новые штаммы могут более часто вызывать патологический процесс у детей в возрасте от 11 до 17 лет. VOC202012/01 обладает большей контагиозностью, а базовое репродуктивное число R соответствует от 0,39 до 0,93 и отличается 17 мутациями: 14 несинонимичными и тремя делециями, а восемь расположены в спайк-белке [32; 33]. Эта мутация стремительно распространяется в мире и заносится в разные страны. Однако о влиянии мутации на изменения в инфекционности патологического процесса, влиянии на выработку специфического (адаптивного) иммунитета, достоверных данных в научных публикациях пока нет и вероятно, что, как и другие известные в настоящее время мутации, существенного влияние на эти процессы не оказывает.

Представленные результаты исследований по структуре генома коронавирусов и изменчи-

вости показывают, что все процессы, носящие наследственный характер связаны с мутациями и редко с рекомбинациями. Все ИСоУ, вызывающие заболевания у людей обладают этой способностью. Скорость мутации оценена как 0.80 - 2.38^10-3 нуклеотидов в год, что было документально доказано для 8ЛЯ8-СоУ [34]. По сравнению с 8ЛЯ8-СоУ вариабельность в геномах 8ЛЯЗ-СоУ-2 и МЕЯБ-СоУ менее выражена, она еще ниже у других видов коронавирусов. Установлено, что во время вспышки 2003/2004 гг. адаптивные мутации в 8-белке SARS-CoV приводили к более сильному связыванию с рецептором АСЕ2. Крио-ЭМ анализ предоставил структурные доказательства того, что 8-белок 8ЛЯ8-СоУ-2 связывается с АСЕ2 с еще более сильной аффинностью [35, 36]. Учитывая, что рецептор-связывающий домен также содержит преобладающие нейтрализующие эпитопы, вариации в этом домене могут иметь отношение к разработке вакцины против 8ЛЯЗ-СоУ-2 [9; 37].

Кроме того, предполагается, что вторичные структуры РНК генов 8ЛЯ8-СоУ-2 являются лекарственными мишенями. Существует возможность смоделировать влияние общих мутаций структуры РНК 8ЛЯ8-СоУ-2 и восприимчивости генома к интерференции со стороны мРНК в клетке хозяина. Влияние мутаций на вторичные структуры, мишени мРНК предполагает потенциальную основу для разработки вакцин, указывает на эволюцию коронавируса, его естественное происхождение, обеспечивает лучшее понимание тропизма и патогенеза вируса [38].

Генотипы.

Генотипов основных штаммов нового коронавируса семь: GR, G, GH, О, 8, Ь и V. Однако штаммы географически распределены неравномерно: на каждом континенте циркулирует преимущественно не более двух основных вариаций. Данные о степени распространения геномов по миру предоставляет GISAID (материалы исследования с декабря 2019 г. по декабрь 2020 г.), где географически отображено 3469 типов вариации генотипа (рис. 3 и 4) [39]. В свою очередь Nextstrain отображает эволюционные связи вируса 8ЛКБ-СоУ-2 с продолжающейся пандемией СОУГО-19. Показано первоначальное появление коронавируса в Ухане, Китай, в ноябре-декабре 2019 г., за которым последовала устойчивая передача инфекции от человека к человеку, приведшая к развитию пандемии [40].

Известные спонтанные мутации, которые обнаружены у 8ЛКБ-СоУ-2, выявили в геномных последовательностях среди штаммов, циркулировавших в начале пандемии как минимум две группы генотипов: Ь-тип и 8-тип, которые отличались в зависимости от места и времени

Рис. 3. Данные о степени распространения вариантов генома SARS-CoV-2 по континентам мира с декабря 2019 г. по декабрь 2020 г. отображены 3469 типов вариации генотипа [41].

Условные обозначения: Вверху справа перечислены варианты генома. Цвет соответствует изображению на карте, где преобладает тот или иной генотип.

Рис. 4. Эпидемиология различных геномов SARS-CoV-2 c декабря 2019 г. по декабрь 2020 г. [41].

Условные обозначения: Слева вверху: обозначения основных типов геномов (GR, GH, G, S, GV, O, L, V). Изображено 3540 вариантов исследованных геномов за 1 год пандемии.

выявления. Отличия в геномах вирусов состоят в виде двух однонуклеотидных полиморфизма (от англ. Single nucleotide polymorphism - SNP). Группы штаммов отличались один от другого по последовательностям аминокислот в нуклеиновой кислоте, которая произошла в одном типе нуклеотида в геноме под влиянием спонтанной мутации, по сравнению с другим типом нукле-отида. Генетических рекомбинаций при этом не обнаружено. Линии S и L генотипов могут быть четко определены только двумя тесно связанными SNP в положениях 8,782 (ORF1ab: мутация T8517C) и 28,144 (ORF8: мутация C251T, S84L). Хотя мутация T8517C в ORF1ab не изменяет последовательность белка (она заменяет кодон AGT (Ser) на AGC (Ser)), что может повлиять на ORF1ab перевод, так как AGT явля-

ется предпочтительным, в то время как AGC не является таковым. ORF1ab - кодирует репликазу / транскриптазу, необходимую для репликации вирусного генома и играет роль в вирусном патогенезе. Репликаза HCoV обладает широким спектром ферментативной активности, несколько nsps (nonstructural proteins) охарактеризованы как многофункциональные субъединицы [41]. L-линия (~70%) была более распространена, чем S-линия (~30%) у исследованных вирусов SARS-CoV-2. S-линия эволюционно более тесно связана с коронавирусами животных [42]. Изучение различий по времени показало, что вирус S-типа, по-видимому, старше, и вызывает не такие тяжелые формы COVID-19, как второй L-тип, который появился позднее. Две разновидности нового коронавируса различались и

своим географическим распространением. В г. Ухане 96,3% заболевших заразились SARS-CoV-2 L-типа, а за пределами этого города таких было меньше - 61,6%, однако позднее доля L-типа снизилась до 60%, что вероятно связано с низкой тяжестью заболевания и/или экологической пластичностью. У одного пациента из Австралии, обнаружили одновременно L- и S-разновидности, т.е. у некоторых штаммов выявлялись смешанные генотипы. Кроме того, анализ мутационной нагрузки показал, что в линии L накоплено значительно большее число производных мутаций, чем в линии S (P <0,0001, критерий суммы рангов Уилкоксона). Эти результаты подтверждают мнение о том, что две линии вирусов SARS-CoV-2 могли испытывать различное избирательное давление из вне. Чтобы определить эволюционные изменения, связанные с линиями L и S, было исследовано геномное выравнивание SARS-CoV-2 и других высоко родственных вирусов. Оказалось, что нуклеотиды линии S в сайтах 8,782 и 28,144 были идентичны ортологическим сайтам (гомология, возникающая вследствие непосредственной эволюции данной последовательности в процессе видообразования; гомология может также возникать при внутривидовой дупликации последовательности; в этом случае непосредственный потомок данного гена (ортолог), существовавшего у предкового вида, во вновь образовавшемся виде может образовать семейство генов, члены этого семейства называются паралогам [26]) и наиболее близкородственных вирусов. Примечательно, что оба сайта были высоко консервативны и в других вирусах. Хотя L-линия (~70%) была более распространенной, чем S-линия (~30%) у исследованных вирусов SARS-CoV-2, S-линия была эволюционно более связана с коронавирусами животных [26; 43].

Определена нуклеотидная последовательность уникального участка мРНК коронавируса MHV-A59. Обнаружены две открытые рамки считывания (ORF): ORF1 потенциально кодирует белок из 261 аминокислоты; его аминокислотная последовательность содержит элементы, которые указывают на свойства связывания нуклеотидов. ORF2 предсказывает белок из 413 аминокислот; в нем отсутствует кодон инициации трансляции, и, вероятно, является псевдогеном. Аминокислотная последовательность ORF2 имеет 30% гомологии с последовательностью гемагглютинина HA1 вируса гриппа С. Короткий участок нуклеотидов ORF2 имеет 83% гомологии с нуклеотидными последовательностями MHC класса I. Предполагается, что оба сходства являются результатом рекомбинаций [44].

Позднее было изучено 160 полных геномов вируса, отобранных по всему миру из разных

стран (период с 24 декабря 2019 года по 4 марта 2020 года). Исследователи выявили уже три центральных варианта (генотипа), отличающихся аминокислотными изменениями, которые назвали А, В и С, причем А являлся наследственным типом от летучей мыши из коронавируса [45]. Типы А и С встречались чаще за пределами Восточной Азии, то есть в США и Австралии. Тип А подразделялся на два подкласса А, которые отличаются между собой мутацией Т29095С. Тип А, вероятно, мутировал в тип В двумя мутациями: Т8782С и С28144Т, меняющий лейцин на серин. Тип В, является наиболее распространенным в Восточной Азии, и его наследственный геном, по-видимому, не распространился за пределы этого региона без предварительной мутации в В-тип, что указывает на иммунологическую или экологическую устойчивость этого типа за пределами Азии. Тип С отличается от своего родительского типа В мутацией G26144T, которая превращает глицин в валин и возник за пределами материкового Китая, встречается в основном у жителей Европы (Франции, Италии, Швеции и Англии), а также в США (Калифорнии), Бразилии, Сингапуре, Тайване и Южной Корее [46].

Несколько мутаций коронавируса 8ЛЯ8-СоУ-2 устойчивы к воздействию антител, что заключается в механизме его взаимодействия с белковым сегментом RBD, который 8ЛЯЗ-СоУ-2 использует для проникновения в клетки. При этом некоторые из этих мутаций широко распространены у заболевших на территории Европы, а в Нидерландах и Дании выявлена неуязвимая для всех антител мутация [47].

Мутация в генах человека также влияет на иммунный ответ организма при инфицировании коронавирусом. Исследования показали, что пациенты с мутациями в генах TYK2, DPP9, ОА8, IFNAR2 госпитализированы в тяжелом состоянии. Мутация в гене TYK2 приводит к гиперактивации процессов воспаления, повреждающая, в первую очередь, ткань легких. А мутация IFNAR2 нарушает синтез интерферона, играющего важную роль в начале заболевания [48].

В июне 2020 г. проведен анализ более 10422 геномов 8ЛЯ8-СоУ-2 с использованием специальных алгоритмов, который считывал всю генетическую базу данных и удалял из нее те части генома и фрагменты генов, которые полностью совпадали или были идентичны. Использовался подход, когда номер аллеля каждой нуклеотид-ной последовательности гена в геноме вируса, создавал тип последовательности 8Т, которая кодировалась как последовательность номеров аллелей для каждого из 10 генов в вирусном геноме. Такой подход позволял связывать 8Т

в четко определенные клональные комплексы (CC), которые согласуются с филогенией. Была построена карта генома вируса SARS-CoV-2, показывающая длину в парах оснований 10 ORF, количество аллелей в текущей базе данных и преобладание двух верхних аллелей каждого ORF в изолятах базы данных штаммов. Используя алгоритм для построения минимального связующего дерева (MST) и идентификации основателей, было выявлено 24 CC (клональных комплекса - генотипов), которые представляют 79% (4352/5510) всех уникальных ST. Показано, что оценка ST и CC согласуется с множественными внедрениями вируса в определенных географических точках. Кроме того, использовалась временная оценка соотношения ST / CC, чтобы выявить колебания, а также замену некоторых ST новыми линиями в определенных географических точках. Затем глобальный регион происхождения для каждой последовательности генома был сопоставлен с каждой CC, и была выявлена сильная связь некоторых CC с определенными географическими местоположениями. Геномы СС 255, 300, 301, 317, 348, 355, 369, 399, 454, 498, 985, 1063, 1148 выявлены преимущественно в Европе. Геномы СС 26, 800 и 927 обнаружены в основном в Азии. Геном CC256 циркулирует на западном побережье США и в штате Вашингтон (первые два изолята были из Китая и первый - из Вашингтона еще 19.01.2020). Геном CC258 обнаружен на восточном побережье США, но связан с другими CC, встречающимися преимущественно в Европе, где и первоначально находился, а затем, и в других местах в США. Анализ показал, что 99% изолятов происходят из CC258 и его потомков CC 768, 800, 844 и 1063, которые несут мутацию G25563T в ORF3a (88% всех изолятов, которые несут эту мутацию). Геном CC800 преобладает на Ближнем Востоке (75% в Саудовской Аравии и Турции) и связан с ST338 и ST258, который в основном встречается в США, что указывает на то, как происходила передача вируса из США на Ближний Восток [48; 49].

Исследовались химерные варианты (химера — организм, состоящий из генетически разнородных клеток) у RBD. В отличие от изменения отдельных аминокислот, химерные RBD показывают, что RBD 2 и 3 клайда (совокупность вирусов, схожие по генетической последовательности) совместимы с человеческим ACE2. Возможно, что рекомбинация с вирусом клайда 1 обеспечит совместимость с человеческим ACE2. Следует отметить, что RBD SARS-CoV-2 содержит больше контактных участков с человеческим ACE2, которые находятся в клайде 1. Предполагается, что SARS-CoV-2 возник

в результате рекомбинации между клайдом 1 и другими представителями [50].

Временные графики, наиболее распространенных в мире 12 СС, показывают появление новых CC с течением времени, таких как CC255, CC300 и CC258. CC4, самые первые штаммы -представляли 60% секвенированных геномов в середине января, но к середине марта снизились до 5%. Временной график в Китае показывает экспансию местных клонов (CC4 и CC256), которые, вероятно, распространились на другие страны в начале пандемии, а затем со временем уменьшились в Китае. CC258 был впервые выделен в Китае в середине марта, тогда как к концу февраля он уже представлял 14% геномов в Европе, потенциально отражая передачу новых СС обратно в Китай позднее в период пандемии. К концу января, CC4 представлял 39% секве-нированных геномов в Китае, но был выделен в г. Ухани (Китай) в единственном числе. Это показывает, что циркулирующие клоны могут по-разному выявляться в один и тот же момент времени в разных частях одной и той же страны. В Европе выявлено разнообразие во времени и расширение локальных CC300 и CC255 (после середины февраля 2020 г.). В США обнаружена двойная циркуляция: на западном и восточном побережьях с доминированием CC258 (более 45%). В Вашингтоне, отмечается замена CC256 на CC258, возможно, путем проникновения с Восточного побережья или Европы. В Нью-Йорке наблюдалась другая картина, которая сопровождалась постоянным доминированием CC258. Тем не менее, более детальный взгляд на ST в Нью-Йорке, а не на CC, указывает на изменяющуюся эпидемиологическую картину со снижением ST258 и ростом тесно связанных SLV и DLV с ST258 [48; 49].

С функциональной точки зрения, установлено существование 24 клональных групп 8ЛЯ8-СоУ-2, состоящие из родственных друг другу штаммов вирусов, из которых 6 генотипов (кластерных групп) основные. С помощью инструмента GNUVID можно быстро вводить последовательности и кластеризовать последовательности всего генома в быстро меняющейся пандемии, и использовать для временного отслеживания появляющихся клонов (генотипов) для выявления вероятного географического и временного происхождения вирусов [49], что чрезвычайно важно для оценки географической циркуляции 8ЛЕ8-Со¥-2 [51; 52].

Исследования, в этом направлении, выполнили и российские ученые, которые получили предварительные результаты, подтверждающие эту возможность [52; 53]. Филогеографический анализ, секвенированных геномов 211 штаммов

8ЛЯ8-СоУ-2, выделенные в России в марте-апреле 2020 г., в сравнении с данными базы GISAID, дополненный материалами историй путешествий пациентов, от которых были изолированы геномы, показал, что получено 67 строго синхронизированных интродукций (заселение какой-либо территории новым видом вируса) в России. Все, кроме одного из этих штаммов, поступили из некитайских источников, предполагая, что закрытие границы с Китаем помогло задержать распространение 8ЛЯ8-СоУ-2 в России. Анализ мутаций, произошедших в геномах во временном и территориальном распространении позволил выделить, по меньшей мере, 9 различных линий штаммов вирусов (кластеров, генотипов), которые соответствовали передаче внутри страны. Отдельный кластер передачи соответствовал внутрибольничной вспышке в Российском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии имени Вредена Р.Р. в г. Санкт-Петербурге [52]. Анализ показал, что только первые два случая заболеваний в России в январе 2020 г. были связаны с завозом из Китая. Появление последующих случаев заболеваний со 2 марта 2020 г. считалось связанным с завозом из Италии и затем до 21 марта 2020 г. регистрировались в России только завозные случаи из Китая, Италии, Испании и Великобритании, где внутри стран проходила циркуляция вируса [52].

В другом исследовании был проведен филогенетический анализ и оценка изменений в исследуемых вирусных геномах, разделенных на четыре основных кластера. Ключевое направление эволюции генома вируса SARS-CoV-2 сопряжено с появлением единичной мутации в гене 8 [54].

Филогенетический анализ выявил родословные и показал, что множественные индивидуальные образцы филогенетически переплетаются с последовательностями геномов, обнаруженных при циркуляции внутри России. Установлено, что самый ранний пациент вернулся в Россию из Франции, этот образец содержал в кладе французские и датские последовательности, но в предковом родстве оказался французским в более ранних датах и, следовательно, является более правдоподобным источниками. Кроме того, по филогенетическому положению кладов установлен импорт генотипа из Швейцарии в Республику Саха, генотипа из Саудовской Аравии в Чеченскую Республику; ряд генотипов не указывают конкретной территории куда произошел занос, но указывает откуда - из США, Дании, Франции, Чили, Англии, Швеции и др. стран Европы [53; 54].

Кроме территориальной, появилась возможность выявить и временную зависимость по филогеографическому анализу. Временная динамика распространения 8ЛЯ8-СоУ-2 в России показала, что после внедрения в популяцию людей вирус распространился по всей России. Москва и Санкт-Петербург являются крупными транспортными узлами, вместе обслуживая 77% международных воздушных перевозок во всей России, поэтому было сформулирована гипотеза, что вирус был ввезен через эти города и распространен по всей России через них. Однако филогенетический анализ показал, геномы, выделенные от пациентов в г. Москве или г. Санкт-Петербурге, не находятся на более коротких ветках, чем образцы из других регионов; на самом деле, ветви, ведущие к ним, имеют тенденцию быть достоверно немного длиннее (0,88 против 0,37, р = 0,006), что предполагает развитие эпидемии в России с вектором практически одновременным внедрением во множественные регионы [52; 53].

Самый большая вспышка в г. Санкт-Петербурге произошла в Российском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии имени Вредена Р.Р., где выявлено от 2 до 4 различных интродукций и их начальное быстрое распространение, было ограничено установлением карантина. Родословная вспышки в г. Санкт-Петербурге, определила человека с историей путешествий в Испанию. Образцы образуют три отдельные группы, каждая со своим набором мутаций. Самая большая группа, группа (кластер, генотип) 1, включает в себя 41 последовательность, полученную в период с 3 по 22 апреля 2020 г. и представляет собой российскую линию передачи. Группа 2 содержит 7 из 9 последовательностей в другом кладе, которая несет английскую последовательность генома. Группа 3 включает 4 последовательности и представляет собой собственный клад, но в другой отличительной российской линии передачи. Группы 1 и 2 принадлежат к линии, определенной тремя мутациями в положениях 28881, 28882 и 28883, и дополнительно определяются мутациями в положениях 26750 и 1191 соответственно. Напротив, группа 3 принадлежит к другой линии и поддерживается мутацией в положении 20268, которая широко распространена в мире и появилась в начале филогенетической истории 8ЛКБ-СоУ-2, а также двумя дополнительными мутациями, что является убедительным доказательством того, что группа 3 происходит не из того источника, что группы 1 и 2. Байесовский анализ показал как минимум два разных попадания 8ЛКБ-СоУ-2 - 1-2 группы (среднее значение - 15 марта) и 3 группы (сред-

нее значение - 17 марта), Оценка филодинами-ческих параметров была стабильная, поскольку контагиозный коэффициент (Re) составлял 3,72 (95% ДИ 2,48-5,05) до 8 апреля 2020 г. и снизился до 1,38 (95% ДИ 0,48-2,41) после 8 апреля 2020 г. [52; 53].

Следует обратить внимание на то, что базовый стеблевой кластер включал 100 идентичные последовательности геномов российских штаммов, а также 4323 последовательности геномов у штаммов, циркулирующих за пределами России. Этот непосредственный предок пяти российским линиям передачи и 19 стволовым син-глетонам (одиночные), указывает на то, что эти последовательности были многократно завезены в Россию и может быть положено не только в эпидемиологическую оценку происходящих процессов, но и на эффективность профилактических и противоэпидемических мероприятий, проводящихся в России.

Недавние результаты исследования показали, в геноме 8ЛЯ8-СоУ-2 отсутствует какая-либо потенциально рецидивирующая мутация, значительно повышающая трансмиссивность 8ЛЯ8-СоУ-2 на данном этапе. Подтверждено, что геномное разнообразие популяции корона-вирусов в настоящее время все еще очень ограничено. Следует предположить, что 8ЛЯ8-СоУ-2 будет расходиться в фенотипически различные линии. Однако исследователи утверждают, что нет оснований полагать, что этот процесс приведет к появлению какой-либо линии с повышенной способностью передачи в её человеческом организме [52; 55].

Таким образом, анализ результатов исследований 8ЛЯ8-СоУ-2 по возможному появлению мутаций показал, что их накопление происходит медленно - замена в нуклеотидных последовательностях со средней скоростью ~ 1 на 1000 нуклеотидов на сайт в год [56], т.е. геном накапливает, в среднем, одну мутацию на 2-3 передачи вируса, поэтому он не столь изменчив как вирус гриппа и ВИЧ. Секвенирование геномов возбудителя меняет понимание возникновения и передачи заболеваний, ускоряя идентификацию патогенов и способствуя обмену данными между исследователями [57 - 59]. Изучение генотипов, отображающих истинную изменчивость вируса, помогает оценить эпидемиологические закономерности распространения вируса в мире и дает надежду на получение вакцинного препарата, обладающего стабильными свойствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Коронавирусы в процессе репликации и своей жизнедеятельности обладают способностью к наследственной изменчивости генома посред-

ством, в первую очередь, спонтанных мутаций, но частота их относительно невысока по сравнению с другими РНК вирусами, такими как вирус гриппа А и ВИЧ. Представленные результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что мутации оказывают влияние на вирус, который эволюционирует и может формировать географические варианты штаммов (европейские, североамериканские и азиатские), которые могут сосуществовать, причем каждый из них характеризуется разными паттернами мутаций.

Генетические варианты со временем будут продолжать возникать в результате спонтанных мутации и естественного отбора, и вероятно, могут появится другие варианты мутаций типа делеций с устойчивой передачей SARS-CoV-2 у людей. Хотя метагеномика может предоставить в настоящее время передовые инструменты для отслеживания меняющейся динамики SARS-CoV-2, в первую очередь необходимо изучать сложные механизмы наследственной изменчивости, лежащие в основе патогенности, эпидемиологического процесса, моделей передачи и иммунитета хозяина, чтобы обеспечить более полное понимание происходящей пандемии заболевания.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Хайтович А. Б. Коронавирусы (таксономия, структура вируса). Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2020;10(3):69-75. doi: 10.37279/2224-6444-2020-10-3-69-81.

2. Хайтович А. Б. Коронавирусы (структура генома, репликация). Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2020;10(4):82-93.

3. Wu A., Peng Y., Huang B., Ding X., Wang X., Niu P., et al. Genome Composition and Divergence of the Novel Coronavirus (2019-nCoV) Originating in China. Cell Host Microbe. 2020;27(3):325-328. doi:10.1016/j. chom.2020.02.001.

4. Fung T. S., Liu D. X. Human Coronavirus: Host-Pathogen Infection. Annual Review of Microbiology. 2019;73:529-557. doi:10.1146/annurev-micro-020518-115759.

5. Kim D., Lee J-Y., Yang J-S., Kim J. W, Kim V. N., Chang H. The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell. 2020;181(4).14:914-921.e10. doi:10.1016/j. cell.2020.04.011.

6. Lan J., Ge J., Yu J., Shan S., Zhou H., Fan S., Zhang Q., Shi X., Wang Q., Zhang L., Wang X. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor binding domain bound

to the ACE2 receptor. Nature. 2020;581(7807):215-220. doi:10.1038/s41586-020-2180-5.

7. Almazan F., DeDiego M.L., Galan C., Escors D., Alvarez E., Ortego J., Sola I., Zuniga S., Alonso S., Moreno J.L., Nogales A., Capiscol C., Enjuanes L. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 2006; 80(21):10900-10906. doi:10.1128/ JVI.00385-06.

8. de Haan, C. A., Te Lintelo E., Li Z., Raaben M., Wurdinger T., Bosch B. J., and Rottier P. J. Cooperative involvement of the S1 and S2 subunits of the murine coronavirus spike protein in receptor binding and extended host range. J. Virol. 2006;80:10909-10918. doi:10.1128/ JVI.00950-06.

9. Fung S. Y., Yuen K. S., Ye Z. W., Chan C. P., D. Y. A tug-of-war between severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 and host antiviral defense: lessons from other pathogenic viruses, Emerging Microbes & Infections. 2020;9(1):558-570. doi:10.1080/22221751.2020.1736644.

10. Glowacka I., Bertram S., Muller M.A., Allen P., Soilleux E., Pfefferle S., Steffen I., Tsegaye T.S., He Y., Gnirss K., Neimeyer D., Schneider H., Drosten C. Evidence that TMPRSS2 activates the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein for membrane fusion and reduces viral control by the humoral immune response. J. Virol. 2011;85(9):4122-4134. doi: 10.1128/JVI.02232-10.

11. Li F., Berardi M., Li W., Farzan M., Dormitzer P. R., Harrison S. C. Conformational states of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein ectodomain. J. Virol. 2006; 80(14):6794-6800. doi: 10.1128/JVI.02744-05.

12. Narayanan K., Huang C., Makino S. SARS coronavirus accessory proteins. Virus Res. 2008;133(1):113-121. doi:10.1016/j.virusres.2007.10.009.

13. Zhu X., Liu O., Du L., Lu L., Jiang S. Receptor-binding domain as a target for developing SARS vaccines. J. Thorac. Dis. 2013;5(2):142-148. doi:10.3978/j. issn.2072-1439.2013.06.06.

14. Wan Y., Shang J., Graham, R., Baric R.S., Li F. Receptor Recognition by the Novel Coronavirus from Wuhan: An Analysis Based on Decade-Long Structural Studies of SARS Coronavirus. J. Virol. 2020;94(7):120-127. doi: 10.1128/JVI.00127-20.

15. Tay M. Z., Poh C. M., Renia L., MacAry P. A., Ng L.F.P. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention. Nat Rev Immunol. 2020;20(6):363-374. doi:10.1038/s41577-020-0311-8.

16. Alenina N., Bader M. ACE2 in Brain Physiology and Pathophysiology: Evidence from Transgenic Animal Models. Neurochem Res. 2019;44(6):1323-1329. doi:10.1007/s11064-018-2679-4.

17. Bunim J. J., Black R. L., Lutwak L., Peterson R. E., Whedon G. D. Studies on dexamethasone, a new synthetic steroid, in rheurheumatoid arthritis: a preliminary report; adrenal cortical, metabolic and early clinical

effects. Arthritis Rheum. 1958;1(4):313-331. doi:10.1002/ art.1780010404.

18. Jones G., Sebba A., Gu J., Lowenstein M. B., Calvo A., Gomez-Reino J. J., Siri D. A., Toms'ic" M., Alecock E., Woodworth T., Genovese M. C. Comparison of tocilizumab monotherapy versus methotrexate monotherapy in patients with moderate to severe rheumatoid arthritis: the AMBITION study. Ann Rheum Dis. 2010;69(1):88-96. doi:10.1136/ard.2008.105197.

19. Graham R. L., Sparks J. S., Eckerle L. D., Sims A. C., Denison M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. Virus Res. 2008;133(1):88-100. doi:10.1016/j.virusres.2007.02.017.

20. Pachetti M., Marini B., Benedetti F., Giudici F., Mauro E., Storici P., Masciovecchio C., Angeletti S., Ciccozzi M., Gallo R.C., Zella D., Ippodrino R.. Emerging SARS-CoV-2 mutation hot spots include a novel RNA-dependent-RNA polymerase variant. J Transl Med. 2020;18(1):179. doi:10.1186/s12967-020-02344-6.

21. Sola I., Almazan F., Züniga S., Enjuanes L. Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015;2(1):265-288. doi: 10.1146/annurev-virology-100114-055218.

22. Sethuraman N., Jeremiah S. S., Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 2020;323(22):2249-2251. doi:10.1001/jama.2020.8259.

23. Korber B., Fischer W. M., Gnanakaran S. Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike: Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus. Cell. 2020;182(4):812-827. doi:10.1016/j.cell.2020.06.043.

24. Zhang L., Jackson C. B., Mou H. SARS-CoV-2 spike-protein D614G mutation increases virion spike density and infectivity. Nat Commun. 2020;11(1):6013. doi:10.1038/s41467-020-19808-4.

25. Plante J.A., Liu Y., Liu J., Xia H., Johnson B.A., Lokugamage K.G., Zhang X., et al. Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness. Nature. 2020. doi:10.1038/ s41586-020-2895-3.

26. Tang X., Wu C., Li X., Song Y., Yao X., Wu X., Duan Y., Zhang H., Wang Y., Qian Z. Cui J., Lu J. On the origin and continuing evolution of SARS-CoV-2. National Science Review. 2020;7(6):1012-1023. doi: 10.1093/nsr/ nwaa036.

27. Su Y.C.F., Anderson D.E., Young B.E., et al. Discovery and Genomic Characterization of a 382-Nucleotide Deletion in ORF7b and ORF8 during the Early Evolution of SARS-CoV-2. mBio. 2020;11(4):1610-1620. doi:10.1128/mBio.01610-20.

28. Guan Y., Zheng B.J., He Y.Q., Liu X.L., Zhuang Z.X., Cheung C.L., Luo S.W., Li P.H, Zhang L.J., Guan Y.J., Butt K.M., Wong K.L., Chan K.W., Lim W., Shortridge K.F., Yuen K.Y., Peiris J.S.M., Poon L.L.M. Isolation and characterization of viruses related to the SARS coronavirus from animals in southern China. Science. 2003;302:276-278. doi:10.1126/science.1087139.

29. He J-F., Peng G-W., Min J., Yu D.W., Liang W.J., Zhang S.Y., Xu R.H. Chinese SARS Molecular

Epidemiology Consortium. Molecular evolution of the SARS Coronavirus during the course of the SARS epidemic in China. Science. 2004;303:1666-1669. doi:10.1126/ science.1092002.

30. Chiu R. W. K., Chim S. S. C., Tong Y-K., Fung K.S.C., Chan P. K. S., Zhao G-P., Lo Y.M.D. Tracing SARS-coronavirus variant with large genomic deletion. Emerg. Infect. Dis. 2005;11:168-170. doi:10.3201/ eid1101.040544.

31. Lau S. K. P., Feng Y., Chen H., Luk H. K. H, Yang W-H. Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus ORF8 protein is acquired from SARS-related coronavirus from greater horseshoe bats through recombination. J. Virol. 2015;89:10532-10547. doi: 10.1128/JVI.01048-15.

32. Zhu N., Zhang D., Wang W. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727-733. doi:10.1056/NEJMoa2001017.

33. Zhou P., Yang X. L., Wang X. G. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270-273. doi:10.1038/ s41586-020-2012-7.

34. Zhao Z., Li H., Wu X, Zhong Y., Zhang K., Zhang Y-P., Boerwinkle E., Fu Y-X. Moderate mutation rate in the SARS coronavirus genome and its implications. BMC Evol Biol. 2004;4:21. doi: 10.1186/1471-2148-4-21.

35. Neuman B.W., Kiss G., Kunding A.H., Bhella D., Baksh M. F., Connelly S., Droese B., Klaus J. P. A structural analysis of M protein in coronavirus assembly and morphology J. struct. Biol. 2011;174(1):11-22. doi: 10.1016/j.jsb.2010.11.021.

36. Wrapp D., Wang N., Corbett K. S., Goldsmith J. A., Se C.-L., Abion O., Graham B.S., McLellan J.S. Cryo-EM structure of 2019 nCoV peak in prefusion conformation. Science. 2020;367(6483):1260-1263. doi: 10.1126 / science. abb2507.

37. Jiang S., Du L., Shi Z. An emerging coronavirus causing pneumonia outbreak in Wuhan, China: calling for developing therapeutic and prophylactic strategies. Emerg. Microbes. Infect. 2020;9:275-277. doi: 10.1080/22221751.2020.1723441.

38. Rad S. A., McLellan A. D. Implications of SARS-CoV-2 Mutations for Genomic RNA Structure and Host microRNA Targeting. Int J Mol Sci. 2020;21(13):4807. doi:10.3390/ijms21134807.

39. GISAID - Genomic epidemiology of hCoV-19. 2020. Available at: https://www.gisaid.org/epiflu-applications/phylodynamics/. Accessed January 3, 2021.

40. Nextsrain - Genomic epidemiology of novel coronavirus - Global subsampling. 2020. Available at: https://nextstrain.org/ncov/global/. Accessed January 3, 2021.

41. Subissi L., Posthuma C. C., Collet A. One severe acute respiratory syndrome coronavirus protein complex integrates processive RNA polymerase and exonuclease activities. Proc Natl Acad Sci

USA. 2014;111(37):E3900-E3909. doi:10.1073/ pnas.1323705111.

42. Lu R., Zhao X., Li J., et al. Genomic characterization and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 2020;395(10224):565-574. doi:10.1016/ S0140-6736(20)30251-8.

43. Yu W.B., Tang G. D., Zhang L., Corlett R. T. Decoding the evolution and transmissions of the novel pneumonia coronavirus (SARS-CoV-2 / HCoV-19) using whole genomic data. Zool Res. 2020;41(3):247-257. doi:10.24272/j.issn.2095-8137.2020.022.

44. Luytjes W., Bredenbeek P. J., Noten A. F., Horzinek M. C., Spaan W. J. Sequence of mouse hepatitis virus A59 mRNA 2: indications for RNA recombination between coronaviruses and influenza C virus. Virology. 1988;166(2):415-422. doi:10.1016/0042-6822(88)90512-0.

45. Ren W., Li W., Yu M., Wendong L. Full-length genome sequences of two SARS-like coronaviruses in horseshoe bats and genetic variation analysis. J Gen Virol. 2006;87(11):3355-3359. doi:10.1099/vir.0.82220-0.

46. Forster P., Forster L., Renfrew C., Forster M. Phylogenetic network analysis of SARS-CoV-2 genomes. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117(17):9241-9243. doi:10.1073/pnas.2004999117.

47. Greaney A.J., Starr T.N., Gilchuk P., Zost S.J., Binshtein E., Loes A.N., Hilton S.K., Huddleston J., Eguia R., Crawford K.H.D., Dingens A.S., Nargi R.S., Sutton R.E., Suryadevara N., Rothlauf P.W., Liu Z., Whelan S.P.J., Carnahan R.H., Crowe Jr. J.E., Bloom J.D. Complete Mapping of Mutations to the SARS-CoV-2 Spike Receptor-Binding Domain that Escape Antibody Recognition. Cell Host Microbe. 2020;1931-3128. doi:10.1016/j. chom.2020.11.007.

48. Moustafa A. M., Planet P. J. Rapid whole genome sequence typing reveals multiple waves of SARS-CoV-2 spread. BioRxiv. 2020;1-7. doi: 10.1101/2020.06.08.139055.

49. Letko M., Marzi A., Munster V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat Microbiol. 2020;5(4):562-569. doi:10.1038/s41564-020-0688-y.

50. Menachery V. D., Yount B. L. Jr, Debbink K., Agnihothram S., Eralinski L., Plante J. A., Graham R.L., Scobey T., Ge X-Y., Donaldson E.F., Randell S. H., Lanzavecchia A., Marasco W. A., Shi Z-L., Baric R. S. A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat Med. 2015;21(12):1508-1513. doi:10.1038/nm.3985.

51. Andersen K. G., Rambaut A., Lipkin W. I., Holmes E. C., Garry R. F. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat Med. 2020;26(4):450-452. doi:10.1038/s41591-020-0820-9.

52. Комиссаров А. Б., Сафина К. Р., Гарушянц С. К., Фадеев А. В., Сергеева М. В., Иванова А. А., Дани-ленко Д. М., Лиознов Д., Шнейдер О. В., Швырев Н., Спирин В., Глызин Д., Щур В., Базыкин Г. А. Геномная

эпидемиология ранних стадий вспышки атипичной пневмонии в России. medRxiv. 2020;1-43. doi:10.1101/ 2020.07.14.20150979.

53. Краснов Я. М., Попова А. Ю., Сафронов В. А., Федоров А. В., Баданин Д. В., Щербакова С. А., Кутырев В. В. Анализ геномного разнообразия SARS-CoV-2 и эпидемиологических признаков адаптации возбудителя COVID-19 к человеческой популяции. Проблемы особо опасных инфекций. 2020;(3):70-82. doi:10.21055/0370-1069-2020-3-70-82.

54. van Dorp L., Richard D., Tan C. C. S., Shaw L. P., Acman M., Balloux F. No evidence for increased transmissibility from recurrent mutations in SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020;11(1):5986. doi:10.1038/s41467-020-19818-2.

55. Rambaut A. Phylogenetic analysis of nCoV-2019 genomes. 176 genomes. Virological. January

2020. Available at: https://virological.org/t/phylodynamic-analysis-176-genomes-6-mar-2020/356. Accessed January 3, 2021.

56. Sawicki S. G., Sawicki D. L., Siddell S. G. A contemporary view of coronavirus transcription. J Virol. 2007;81(1):20-29. doi:10.1128/JVI.01358-06.

57. Pairo-Castineira E., Clohisey S., Klaric L., Bretherick, A. D., Rawlik, K., Pasko, D., Baillie, J. K. Genetic mechanisms of critical illness in Covid-19. Nature. 2020; doi:10.1038/s41586-020-03065-y.

58. Wise J. Covid-19: New coronavirus variant is identified in UK. BMJ. 2020;16(371):4857. doi: 10.1136/ bmj.m4857.

59. Rambaut A, Loman N., Pybus O. Preliminary genomic characterization of an emergent SARS-CoV-2 lineage in the UK defined by a novel set of spike mutations. ARTIC Network. Dec 2020. Available at: https:// virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutations/563. Accessed January 3,

2021.

REFERENCES

1. Khaitovich A.B. Coronavirus (taxonomy, virus structure). Crimean Journal of Experimental and Clinical Medicine. 2020;10(3):69-75. doi: 10.37279/2224-64442020-10- 3-69-81. (In Russ).

2. Khaitovich A.B. Coronavirus (genome structure, replication). Crimean Journal of Experimental and Clinical Medicine. 2020;10(4):82-93. (In Russ).

3. Wu A., Peng Y., Huang B., Ding X., Wang X., Niu P., et al. Genome Composition and Divergence of the Novel Coronavirus (2019-nCoV) Originating in China. Cell Host Microbe. 2020;27(3):325-328. doi:10.1016/j. chom.2020.02.001.

4. Fung T. S., Liu D. X. Human Coronavirus: Host-Pathogen Infection. Annual Review of Microbiology. 2019;73:529-557. doi:10.1146/annurev-micro-020518-115759.

5. Kim D., Lee J-Y., Yang J-S., Kim J. W, Kim V. N., Chang H. The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell. 2020;181(4).14:914-921.e10. doi:10.1016/j. cell.2020.04.011.

6. Lan J., Ge J., Yu J., Shan S., Zhou H., Fan S., Zhang Q., Shi X., Wang Q., Zhang L., Wang X. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 2020;581(7807):215-220. doi:10.1038/s41586-020-2180-5.

7. Almazan F., DeDiego M.L., Galan C., Escors D., Alvarez E., Ortego J., Sola I., Zuniga S., Alonso S., Moreno J.L., Nogales A., Capiscol C., Enjuanes L. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 2006;80(21):10900-10906. doi:10.1128/JVI.00385-06.

8. de Haan, C. A., Te Lintelo E., Li Z., Raaben M., Wurdinger T., Bosch B. J., and Rottier P. J. Cooperative involvement of the S1 and S2 subunits of the murine coronavirus spike protein in receptor binding and extended host range. J. Virol. 2006;80:10909-10918. doi:10.1128/ JVI.00950-06.

9. Fung S. Y., Yuen K. S., Ye Z. W., Chan C. P., D. Y. A tug-of-war between severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 and host antiviral defense: lessons from other pathogenic viruses, Emerging Microbes & Infections. 2020;9(1):558-570. doi:10.1080/22221751.2020.1736644.

10. Glowacka I., Bertram S., Muller M.A., Allen P., Soilleux E., Pfefferle S., Steffen I., Tsegaye T.S., He Y., Gnirss K., Neimeyer D., Schneider H., Drosten C. Evidence that TMPRSS2 activates the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein for membrane fusion and reduces viral control by the humoral immune response. J. Virol. 2011;85(9):4122-4134. doi: 10.1128/JVI.02232-10.

11. Li F., Berardi M., Li W., Farzan M., Dormitzer P. R., Harrison S. C. Conformational states of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein ectodomain. J. Virol. 2006; 80(14):6794-6800. doi: 10.1128/JVI.02744-05.

12. Narayanan K., Huang C., Makino S. SARS coronavirus accessory proteins. Virus Res. 2008;133(1):113-121. doi:10.1016/j.virusres.2007.10.009.

13. Zhu X., Liu O., Du L., Lu L., Jiang S. Receptor-binding domain as a target for developing SARS vaccines. J. Thorac. Dis. 2013;5(2):142-148. doi:10.3978/j. issn.2072-1439.2013.06.06.

14. Wan Y., Shang J., Graham, R., Baric R.S., Li F. Receptor Recognition by the Novel Coronavirus from Wuhan: An Analysis Based on Decade-Long Structural Studies of SARS Coronavirus. J. Virol. 2020;94(7):120-127. doi: 10.1128/JVI.00127-20.

15. Tay M. Z., Poh C. M., Rénia L., MacAry P. A., Ng L.F.P. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention. Nat Rev Immunol. 2020;20(6):363-374. doi:10.1038/s41577-020-0311-8.

16. Alenina N., Bader M. ACE2 in Brain Physiology and Pathophysiology: Evidence from Transgenic Animal

Models. Neurochem Res. 2019;44(6):1323-1329. doi:10.1007/s11064-018-2679-4.

17. Bunim J. J., Black R. L., Lutwak L., Peterson R. E., Whedon G. D. Studies on dexamethasone, a new synthetic steroid, in rheurheumatoid arthritis: a preliminary report; adrenal cortical, metabolic and early clinical effects. Arthritis Rheum. 1958;1(4):313-331. doi:10.1002/ art.1780010404.