РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ COVID-19 В ФОРМАТЕ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
А. К. Шуряева1, Т. В. Малова1, Е. Е. Давыдова2, Ю. А. Савочкина1, Е. В. Богословская1, Р. Р. Минтаев1'2, Г. М. Цыганова1, Е. Е. Шивлягина1, А. Ш. Ибрагимова1, А. О. Носова1, Г. А. Шипулин1, С. М. Юдин1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования" Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии наук, Москва, Россия
В конце декабря 2019 года в городе Ухань, Китай, возникла вспышка неизвестного коронавируса, позднее идентифицированного как SARS-CoV-2. Вирус вызывает опасное респираторное коронавирусное заболевание человека - COVID-19. Цель. Для выявления случаев заболевания и предотвращения его распространения на территории Российской Федерации необходимо создание эффективной диагностической тест-системы. Материалы и методы. На основании анализа выравнивания нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2 были выбраны праймеры и зонд для ОТ-ПЦР, оптимизированы условия проведения анализа. Результаты. В кратчайшие сроки разработана и зарегистрирована диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 в мазках со слизистой оболочки носоглотки и ротоглотки, мокроте и фекалиях. Высокая специфичность системы показана на репрезентативной выборке генетического материала вирусного и бактериального происхождения, аналитическая чувствительность составила 1 *103 ГЭ/мл в мазках со слизистой носоглотки и ротоглотки и мокроте, 5х104 ГЭ/мл в образцах фекалий. Диагностические показатели (чувствительность и специфичность), установленные при клинических испытаниях на образцах, полученных от пациентов с подтвержденной инфекцией COVID-19, от пациентов с иной этиологией заболевания и клинически здоровых людей, составили 100% (диапазон 94,2-100 % с доверительной вероятностью 95 %).
Ключевые слова: коронавирус, молекулярная диагностика, SARS-CoV-2, COVID-19, SARS-COV-2, ОТ-ПЦР в реальном времени, диагностика инфекционных заболеваний
Финансирование: исследование проведено за счет собственных средств ФГБУ "ЦСП" ФМБА России. Статья получена: 15.07.2020 Статья принята к печати: 13.08.2020 Опубликована онлайн: 19.08.2020 DOI: 10.47183/mes.2020.011
DEVELOPMENT OF THE KIT FOR DIAGNOSTICS OF COVID-19 BY REAL TIME RT-PCR
Shuryaeva AK1, Malova TV1, Davydova EE2, Savochkina YuA1, Bogoslovskaya EV1, Mintaev RR1,2, Tsyganova GM1, Shivlyagina EE1, Ibragimova ASh1, Nosova AO1, Shipulin GA1, Yudin SM1
1 Federal State Budgetary Institution "Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks" of the Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russia
2 I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Late in December 2019, an outbreak of an unknown coronavirus, later identified as SARS-CoV- 2, emerged in the city of Wuhan, China. It causes a dangerous respiratory coronavirus disease in humans — COVID-19. Objective. To detect cases of the disease and prevent its spread across the Russian Federation it is necessary to create an effective diagnostic test system. Material and methods. Based on the analysis of the alignment of the SARS-CoV-2 nucleotide sequences, primers and a probe for RT-PCR were selected, and the analysis conditions were optimized. Results. The diagnostic system was developed and registered in the shortest possible time in real-time RT-PCR format for detecting SARS-CoV-2 coronavirus RNA in smears from the nasopharynx and oropharynx, sputum and feces. The high specificity of the system was verified on a representative set of viruses and microorganisms, the analytical sensitivity was 1x103 copies / ml in smears from the mucous membrane of the nasopharynx and oropharynx and sputum, 5x104 copies / ml in fecal samples. Diagnostic sensitivity and specificity established during clinical trials on samples from patients with confirmed COVID-19 infection, from patients with a different etiology of a disease and clinically healthy people were to 100% (range 94.2-100% with a confidence level of 95%).
Keywords: coronavirus, molecular diagnostics, COVID-19, SARS-CoV-2, SARS-COV-2, real-time RT-PCR, diagnosis of infectious diseases
Funding: the study received funding from the Strategic Planning Center, Federal State Budgetary Institution under the Federal Medical-Biological Agency of Russia
Received: 15.07.2020 Accepted: 13.08.2020 Published online: 19.08.2020
DOI: 10.47183/mes.2020.011
Вирус SARS-CoV-2 — новый штамм коронавируса, выявленный в конце 2019 года во время вспышки пневмонии в Китае [1, 2, 3]. Он вызывает опасное респираторное коронавирусное заболевание человека — COVID-19. В тяжёлой форме COVID-19 осложняется пневмонией с острой дыхательной недостаточностью, которая обуславливает высокий уровень смертности.
SARS-CoV-2 является одноцепочечным РНК-вирусом, относится к роду бета-коронавирусов, генетически близок к SARS [4, 5, 6]. На сегодняшний день клиническое значение имеют бета-коронавирусы OC43, HKU1, SARS, MERS и SARS-CoV-2 и альфа-коронавирусы 229E и NL63 [2, 5, 7].
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила СОУЮ-19 чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение (РНЕ1С), а затем в марте 2020 года была объявлена пандемия [6]. Уровень распространения болезни в мире расценивается как очень высокий. Число случаев заболевания, в том числе со смертельными исходами, а также число затронутых стран неуклонно растет, в связи с чем правительства разных стран принимают беспрецедентные меры для предотвращения распространения данного вируса. По данным на 30 июня 2020г. в мире зарегистрировано 10 360 882 случаев заражения коронавирусом 8АЯ8-СоУ-2,
507 014 из них закончились летальным исходом. Россия по количеству случаев заражения находится на третьем месте (первое и второе — США и Бразилия соответственно), число зарегистрированных случаев на 30.06.20-646 929, с летальным исходом - 9 306 [8].
Для своевременного выявления заболевания и предотвращения его дальнейшего распространения на территории Российской Федерации возникла острая необходимость в создании в кратчайшие сроки диагностической системы для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологических образцах с высокой чувствительностью и специфичностью, что стало целью данного исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На момент начала разработки тест-системы 19.01.20 в базе данных GISAID были размещены нуклеотидные последовательности 8 полноразмерных геномов вируса SARS-CoV-2 (ранее CoV Wuhan), имеющих незначительные генетические различия: (BetaCoV/Nonthaburi/74/2020|EPI_ ISL_403963-crop, BetaCoV/Nonthaburi/61/2020|EPI_ISL_403962, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019|EPI_ISL_ 402119, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020|EPI_ISL_402120, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019| EPI_ISL_402121, BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-01/2019|EPI_ISL_402123, BetaCoV/ Wuhan/WIV04/2019 |EPI_ISL_402124, BetaCoV/ Wuhan-Hu-1/2019|EPI_ISL_402125 и короткий фрагмент BetaCoV/Kanagawa/1/2020|EPI_ISL_402126). Для выравнивания геномов нового коронавируса SARS-CoV-2 и геномов других коронавирусов использовали программу Mega X, алгоритм Clustal W. Для выбора диагностических праймеров и зонда был определен участок генома в области гена РНК-зависимой РНК полимеразы коронавируса, RdRp, позиция 15643-15778 по последовательности MN985325. Данный участок был консервативен для всех известных на момент разработки геномов SARS-CoV-2 и имел значимые нуклеотидные отличия от последовательностей геномов других близкородственных коронавирусов, включая SARS-CoV
Дизайн праймеров и зонда проводили в соответствии со стандартными требованиями к выбору олигонуклеотидных праймеров и TaqMan зондов [9, 10], были использованы онлайн-ресурсы Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator [11] и OligoAnalyzer Tool [12], термодинамические характеристики флуоресцентных зондов и их вторичные структуры оценивали с помощью онлайн-сервиса The mfold Web Server [13]. В качестве флуорофоров для зондов были использованы 6-Карбоксиродамин (R6G) в сочетании с гасителем флуоресценции black-hole quencher 1 (BHQ1) и Карбоксифлуоресцеин (FAM) в сочетании с гасителем флуоресценции BHQ1. Синтез праймеров и зондов проводила АО Гентерра.
Разрабатываемый набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2, «АмплиТест SARS-CoV-2», предназначен для проведения всех этапов исследования: экстракции РНК вируса из образцов, обратной транскрипции и ПЦР. Учитывая особенности течения заболевания при заражении новым вирусом SARS-CoV-2, характеризующимся как поражением респираторного тракта, так и, в отдельных случаях, кишечными симптомами, в качестве материала для исследования использовали три вида клинического материала: мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки, мокроту и фекалии.
Для оценки эффективности всех стадий исследования использовали контрольные образцы. Внутренний
контрольный образец (ВКО) представляет собой искусственно синтезированную рекомбинантную последовательность РНК, длиной около 500 п.о., заключенную в оболочку тэ2-фага [14, 15]. ВКО добавляется на этапе экстракции РНК во все исследуемые образцы, что позволяет контролировать успешность прохождения этапов экстракции РНК, обратной транскрипции и амплификации. Положительный контрольный образец (ПКО) представляет собой рекомбинантную РНК, содержащую целевой участок генома коронавируса SARS-CoV-2 протяжённостью ~500 п.о., в оболочке бактериофага ms2 [14, 15]. Контрольный образец ПКО вводится на этапе экстракции нуклеиновых кислот как отдельный образец. Концентрации препаратов ВКО и ПКО измеряли методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием системы QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-Rad Laboratories, США). Отсутствие остаточной ДНК в препаратах ВКО и ПКО подтверждали с помощью постановки ПЦР без стадии обратной транскрипции.
Пробоподготовку образцов клинического материала (мазков и мокроты) проводили в соответствии с опубликованными клиническими рекомендациями [16]. Подготовка образцов фекалий была несколько модифицирована, осветленный экстракт готовили, тщательно ресуспендируя 0,1 г (0,1 мл) фекалий в 0,9 мл фосфатном буфере. Центрифугировали 5 мин при 7000 g («MiniSpin», Eppendorf), отбирали верхнюю фазу.
Для экстракции нуклеиновых кислот применяли обработку гуанидинизотиоцианатом при 65°С с последующей преципитацией изопропанолом тотальной ДНК/РНК в присутствии соосадителя гликогена. После отмывки осадка от примесей и солей растворяли его в ТЕ-буфере, содержащем 0,02 мг/мл полиаденитата калия.
Обратную транскрипцию и ПЦР проводили в один этап (one step). Объём реакционной смеси составлял 50 мкл. Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 25 мкл РНК-пробы, по 0,6 мМ каждого праймера (АО Гентерра, Россия), 0,3 мМ каждого зонда (АО Гентерра, Россия), 0,5 мМ каждого дНТФ (Биосан, Россия), 1 мкл TaqF полимеразы (АО Гентерра, Россия), 0,5 мкл TM-ревертазы (Mmlv) (АО Гентерра, Россия), Random-праймеры — 0,15 мМ (АО Гентерра, Россия), polyA — 0,01 мг/мл (АО Гентерра, Россия), азид натрия 0,05 % («Sigma-Aldrich», США), трис-HCl-буфер (pH 8,3) с концентрацией трис (оксиметил)-аминометана 70 мМ («Sigma-Aldrich», США), магния хлорид — не более 5 мМ («Sigma-Aldrich», США), калия хлорид — не более 80 mM («Sigma-Aldrich», США), стабилизатор ферментов — не более 0,2 мг/мл (АО Гентерра, Россия), стерильная H2O — до 25 мкл.
ОТ-ПЦР проводили в мультиплексном формате, сигнал накопления флуоресценции ВКО регистрировали по каналу для флуорофора FAM, сигнал накопления флуоресценции при амплификации целевой НК коронавируса SARS-CoV-2 детектровали по каналу для флуорофора HEX.
Программа амплификации включала следующие стадии термоциклирования: 50°C — 30 мин; 95°C — 15 мин; следующие стадии повторялись 45 циклов — 95°C -15 с, 60°C — 30 с, 72°C — 15 с. Детекцию проводили при 60°C по каналам для флуорофоров FAM/HEX. Время проведения ОТ-ПЦР — около 2 часов. Результат оценивали пороговым методом, определяя С по пересечению кривой флуоресценции с пороговой линией, установленной на середине экспоненциального участка графика прироста флуоресценции в логарифмическом масштабе. Результаты амплификации интерпретировали как положительные,
Рисунок. Выравнивание последовательностей геномов коронавирусов SARS-CoV-2, OC43, HKU1, SARS, MERS, 229E и NL63 в области конструирования праймеров и зонда
если наблюдали пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.
Аналитическую специфичность ОТ-ПЦР с выбранными праймерами и зондом оценивали в исследовании РНК штаммов коронавируса Human Coronavirus 229E (ATCC® RV-740TM), Betacoronavirus 1 OC43 (ATCC® VR-1558™), вируса гриппа А (H1N1) (ATCC® VR-1469), вируса гриппа А (H3N2) (ATCC® VR-776) и вируса гриппа В (Victoria Lineage) (ATCC® VR-1930) из коллекции АТСС® (American Type Culture Collection, США), HCoV 229E, HCoV OC43, HCoV N163, SARS-CoV HKU39849, MERS-CoV (European Virus Archive Global 011N-03868 — Coronavirus RNA specificity panel), ДНК штаммов Streptococcus pneumoniae (№ 131116), Streptococcus pyogenes (№ 130001), Haemophilus influenza (№ 151221), Staphylococcus aureus (№ 201108), Klebsiella pneumoniae (№ 180129) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России в концентрации не менее 1х106 геномных эквивалентов в 1 мл (ГЭ/мл).
Аналитическую чувствительность (предел обнаружения) оценивали на модельных образцах биологического материала (мазки со слизистой носо- и ротоглотки, мокроты, фекалий) с добавлением разведений стандартного образца — защищенной рекомбинантной РНК, содержащей целевой участок генома коронавируса SARS-CoV-2, в оболочке бактериофага ms2. Использовали следующие разведения: 1 хю4, 5х103, 2х103, 1 хю3, 5х102 и 1 х102 ГЭ/мл. Каждое разведение тестировалось для 3 образцов каждого материала, в двух повторах. Порог чувствительности устанавливали по минимальному разведению, детектированному в трех повторах.
Диагностические показатели оценивали при анализе всех видов клинического материала (мазки из ротоглотки и носоглотки, мокрота, фекалии), предварительно
охарактеризованного как содержащий или не содержащий коронавирус 8АЯ8-СоУ-2, а также материала, полученного от здоровых людей и пациентов с иной этиологией заболевания, контаминированного стандартным образцом в концентрации не менее 103 ГЭ/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве мишени для выявления РНК коронавируса 8АЯ8-СоУ-2 был выбран ген РНК-зависимой РНК полимеразы, ЯсИЧР, на рисунок приведено выравнивание разных последовательностей коронавируса 8АЯ8-СоУ-2 и других коронавирусов на участке отжига праймеров и зонда. Нуклеотидные последовательности в данной области известных на момент разработки геномов коронавируса 8АЯ8-СоУ-2 полностью идентичны и имели множество различий с геномами других близкородственных коронавирусов, что обеспечивает высокую специфичность выбранных праймеров для амплификации РНК коронавируса 8АЯ8-СоУ-2 (рисунок).
Диагностический набор разрабатывался в условиях отсутствия клинического материала в Российской Федерации (не было зарегистрировано ни одного случая заболевания СОУЮ-19), поэтому первоначально был синтезирован участок генома коронавируса в области гена ЯСЯр протяжённостью ~500 п.о. Целевой фрагмент коронавируса был клонирован в плазмидную конструкцию, позволяющую получить рекомбинантную РНК, содержащую целевой участок генома коронавируса 8АЯ8-СоУ-2, в оболочке бактериофага тв2 [14, 15]. Данная рекомбинантная РНК в белковой оболочке использовалась в качестве ПКО в составе диагностического набора, что позволяло оценить эффективность всех этапов исследования.
Оптимизация набора реагентов «АмплиТест 8АЯ8-СоУ-2» произведена на зарегистрированных в Российской
Таблица 1. Результаты повторных клинических испытаний (оценка диагностической чувствительности и специфичности) набора реагентов
Тип образцов Всего исследовано образцов Результаты применения набора реагентов
Положительных отрицательных
Мазки из носо- и ротоглотки 113 50 0
0 63
Мокрота 103 50 0
0 53
Фекалии 100 50 0
0 50
Таблица 2. Результаты множественного выравнивания 50386 известных последовательностей генома коронавируса SARS-CoV-2, представленных в базе данных GISAID в областях выбранных праймеров и зонда. В столбцах указано: 1 — порядковый номер нуклеотида по референсной последовательности MN985325, 2-5 выявленные полиморфизмы среди проанализированных последовательностей в данном положении, 6 — количество последовательностей геномов SARS-CoV-2 в базе данных GISAID, не имеющих отличия в конкретной позиции с MN985325, 7 — количество последовательностей геномов SARS-CoV-2 GISAID, имеющих отличие в конкретной позиции, 8 — количество последовательностей геномов SARS-CoV-2 GISAID, в которых в конкретной позиции нуклеотид не установлен
sum.œunt GISAID=50386; ref MN985325 Кол-во GISAID seq совпадающих с MN985325 Кол-во GISAID seq с отличиями от MN985325 Кол-во GISAID seq, для которых отсутствует достоверное прочтение
Нуклеотидная последовательность по MN985325 Полиморфизмы
A T G C
1 2 3 4 5 6 7 8
Область прямого праймера
15643 50359 0 0 0 50359 0 28
15644 2 0 50356 0 50356 2 29
15645 50361 0 0 0 50361 0 26
15646 50358 2 1 0 50358 3 26
15647 50358 0 1 1 50358 2 27
15648 0 50361 0 0 50361 0 26
15649 50370 0 0 0 50370 0 17
15650 0 0 50377 0 50377 0 10
15651 50380 0 0 0 50380 0 7
15652 2 0 50380 0 50380 2 5
15653 50376 0 5 0 50376 5 6
15654 0 50377 0 4 50377 4 6
15655 0 1 50378 0 50378 1 8
15656 0 50379 0 0 50379 0 8
15657 0 50379 0 0 50379 0 8
15658 0 2 50375 0 50375 2 10
15659 50380 0 0 0 50380 0 7
15660 0 16 0 50361 50361 16 10
15661 50378 0 0 0 50378 0 9
15662 0 7 0 50367 50367 7 13
15663 50374 0 3 0 50374 3 10
15664 0 0 50374 0 50374 0 13
15665 50377 0 0 0 50377 0 10
15666 0 0 0 50376 50376 0 11
Область зонда
15726 0 55 0 50317 50317 55 15
15727 0 0 50379 0 50379 0 8
15728 50381 0 0 0 50381 0 6
15729 0 50381 0 0 50381 0 6
15730 0 0 50381 0 50381 0 6
15731 0 0 0 50381 50381 0 6
15732 0 50381 0 0 50381 0 6
15733 1 0 50379 0 50379 1 7
15734 0 50379 0 0 50379 0 8
15735 0 50378 0 0 50378 0 9
15736 0 0 50379 0 50379 0 8
15737 0 50379 0 0 50379 0 8
15738 0 6 50373 0 50373 6 8
15739 0 50379 0 0 50379 0 8
15740 0 0 50378 0 50378 0 9
15741 0 50379 0 0 50379 0 8
15742 0 50379 0 0 50379 0 8
15743 0 50378 0 0 50378 0 9
15744 0 26 0 50340 50340 26 21
15745 50379 0 0 0 50379 0 8
15746 50379 0 0 0 50379 0 8
15747 0 50379 0 0 50379 0 8
15748 50378 0 0 0 50378 0 9
15749 1 0 50376 0 50376 1 10
15750 0 0 0 50377 50377 0 10
15751 50377 0 0 0 50377 0 10
15752 0 0 0 50377 50377 0 10
15753 0 50376 0 0 50376 0 11
Область обратного праймера (комплементарная)
15758 0 13 0 50361 50361 13 13
15759 50370 0 2 0 50370 2 15
15760 0 50371 0 0 50371 0 16
15761 1 1 0 50369 50369 2 16
15762 0 50370 0 1 50370 1 16
15763 0 0 0 50371 50360 0 16
15764 50370 1 0 0 50371 1 16
15765 50371 0 0 0 50371 0 16
15766 45 1 50325 0 50325 46 16
15767 0 0 50371 0 50371 0 16
15768 0 50371 0 0 50371 0 16
15769 0 10 0 50360 50360 10 17
15770 0 50370 0 0 50370 0 17
15771 50370 0 0 1 50370 1 16
15772 0 2 50368 0 50368 2 17
15773 1 50368 0 0 50368 1 18
15774 0 1 50371 0 50371 1 15
15775 1 1 50362 0 50362 2 23
15776 0 0 0 50371 50371 0 16
15777 0 50344 0 0 50344 0 43
15778 50366 0 0 0 50366 0 21
Федерации в качестве медицинских изделий приборах ПЦР-диагностики — Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), CFX96 (Bio-Rad Laboratories,CIIIA), Applied Biosystems QuantStudio 5 (Life Technologies Holdings Pte. Сингапур), ДТпрайм («ДНК Технология», Россия).
Оценка специфичности на генетическом материале других вирусов, а также бактерий, не выявила перекрёстных реакций, набор реагентов «АмплиТест SARS-CoV-2» показал 100 % аналитическую специфичность. Контроль аналитической чувствительности (предела обнаружения) набора реагентов проводили на модельных образцах биологического материала, контаминированных стандартным образцом рекомбинантого бактериофага ms2, содержащего фрагмент генома SARS-CoV-2. Для мазков со слизистой носоглотки и ротоглотки, а также мокроты предел обнаружения генома SARS-CoV-2 составил 1 х103 ГЭ/мл, для фекалий — 5*104 ГЭ/мл.
Диагностическую чувствительность и специфичность оценивали на выборке из 115 модельных образцов различного биологического материала (мазки из ротоглотки и носоглотки, мокрота, фекалии), контаминированной стандартным образцом до концентрации не менее 103 ГЭ/мл, а также на 195 пробах биологического материала, полученного от здоровых людей и пациентов с иной патологией заболевания. В дальнейшем при распространении
коронавирусной инфекции в РФ клинические испытания были проведены повторно, исследовали 150 образцов мазков из носо- и ротоглотки, мокроты, фекалий, содержащих вирус SARS-CoV-2, полученных от пациентов с установленной инфекцией COVID-19, а также 166 образцов биологического материала (мазков из носо- и ротоглотки, мокроты, фекалий), не содержащих РНК SARS-CoV-2 (табл. 1). Диагностические показатели (чувствительность и специфичность) составили 100% (диапазон 94,2-100 % с доверительной вероятностью 95%). Таким образом, при оценке диагностической чувствительности и специфичности на пробах от пациентов ложноположительных и ложноотрицательных случаев не было выявлено.
Известна высокая способность коронавирусов к приобретению новых мутации [17]. Мутации в областях генома SARS-CoV-2, комплементарных праймерам и зонду, могут привести к ложноотрицательным результатам или снизить чувствительность выявления клинических изолятов с нуклеотидными заменами. Для оценки накопления мутаций в областях праймеров и зонда было проведено их сравнение с последовательностями изолятов коронавируса SARS-CoV-2, опубликованными в базе данных GISAID (множественное выравнивание 50386 последовательностей c помощью алгоритма MAFFT доступно в базе GISAID на 30 июня 2020).
Результаты наличия нуклеотидных полиморфизмов в областях праймеров и зонда по данным выравнивания известных на 30.06.2020 последовательностей геномов SARS-CoV-2 приведены в таблице 2 (табл. 2).
Для прямого праймера из известных 50386 последовательностей выявлены 45 (не более 0,1% от общего количества), имеющих единичные полиморфизмы (48 нуклеотидных отличий), замены локадизуются в центральной области олигонуклеотида (в основном одна замена на праймер) и не являются критическими.
Выявлены 80 последовательностей (из 50386), имеющих по одному полиморфизму в области обратного праймера, из них 13 последовательностей имеют замену G/A на 3' конце (замена приводит к образованию С/A эффективного неканонического взаимодействия [18]).
Выявлены также 82 последовательности с полиморфизмами в области зонда, C/T замены.
Все выявленные полиморфизмы принадлежат изолятам SARS-CoV-2, выделенных по всему миру, преимущественно в США, Австралии, Англии, Нидерландах, Швейцарии, Китае. При анализе известных 237 отечественных изолятов, расположенных в GISAID в областях прямого и обратного праймеров нуклеотидные отличия не выявлены. Один отечественный изолят (hCoV-19/Russia/StPetersburg-RII8955S/2020|EPI_ISL_450) имеет нуклеотидное отличие G/A в области зонда, однако данная замена не является критической, так как обеспечивает достаточно устойчивое неканоническое C/A взаимодействие зонда с матрицей [18], и находится близко к 3%-концу зонда.
Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии критических для ПЦР диагностики нуклеотидных различий в областях праймеров и зондов для всех известных изолятов SARS-CoV-2 (низкая распространённость полиморфизмов, не более одной-двух замен для одного изолята, образование устойчивых неканонических пар).
Таким образом, анализ геномов всех известных изолятов SARS-CoV-2 показал на сегодняшний день высокую надежность разработанного ПЦР набора «АмплиТест SARS-CoV-2», обеспечивающую выявление РНК коронавируса в подавляющем большинстве случаев.
Однако, необходимо отметить, что высокая изменчивость геномов коронавируса предполагает необходимость постоянного мониторинга накопления мутаций в областях праймеров и зонда у новых изолятов, с целью внесения при необходимости изменений в последовательности используемых олигонуклеотидов для сохранения высокой чувствительности диагностикума.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ФГБУ «ЦСП» ФМБА России был разработан набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом ОТ-ПЦР в реальном времени «АмплиТест SARS-CoV-2», набор содержит контроли всех этапов исследования. На момент разработки тест-системы в России не было зарегистрировано ни одного набора реагентов для выявления РНК нового коронавируса. Набор был зарегистрирован как изделие медицинского назначения 06.03.20, регистрационное удостоверение №РЗН 2020/9765, 30.06.20 внесены изменения в регистрационные документы.
В рамках проведенных технических и клинико-лабораторных испытаний, а также практике использования в клинических исследованиях, набор реагентов продемонстрировал высокие показатели аналитической и диагностической чувствительности, что делает его использование перспективным для своевременного выявления заболевания COVID-19. На сегодняшний день набор активно используется на территории Российской Федерации.
Литература
1. Bogoch I. I. et al. Pneumonia of unknown aetiology in Wuhan, China: potential for international spread via commercial air travel // Journal of travel medicine. 2020. Vol. 27. №. 2. P.1-3.
2. Hui D. S. et al. The continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health — The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China // International Journal of Infectious Diseases. 2020. Vol. 91. P. 264-266.
3. Rothan H. A., Byrareddy S. N. The epidemiology and pathogenesis of coronavirus disease (COVID-19) outbreak // Journal of autoimmunity. - 2020. P. 1-4.
4. Chan J. F. W. et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus: another zoonotic betacoronavirus causing SARS-like disease // Clinical microbiology reviews. 2015. Vol. 28. №. 2. P. 465-522.
5. Elfiky A. A., Mahdy S. M., Elshemey W. M. Quantitative structure activity relationship and molecular docking revealed a potency of anti-hepatitis C virus drugs against human corona viruses // Journal of medical virology. 2017. Vol. 89. №. 6. P. 1040-1047.
6. Ibrahim I. M. et al. COVID-19 spike-host cell receptor GRP78 binding site prediction // Journal of Infection. 2020. Vol. 80. №. 5. P. 554-562.
7. WHO: Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) — The Kingdom of Saudi Arabia Retrieved. 24 February 2020. URL: https://www.who.int/csr/don/24-february-2020-mers-saudi-arabia/en/
8. John Hopkins University. Coronavirus Resourse Center. [Электронный ресурс] URL: https://coronavirus.jhu.edu/map. html. Дата обращения: 30.06.2020.
9. Van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., Hays J.P. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. — Springer Science &
Business Media, 2008.
10. Yuryev A. Methods in Molecular Biology: PCR Primer Design. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2007.
11. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic. Acids Res. 2007. URL: http://biotools.nubic. northwestern.edu/OligoCalc.html.
12. Integrated DNA Technologies. OligoAnalyzer Tool. URL: https:// www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer.
13. The mfold Web Server (Hosted by The RNA Institute, College of Arts and Sciences). URL: http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/ DNA-Folding-Form.
14. Cheng Y, Niu J, Zhang Y, Huang J, Li Q. Preparation of his-tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus // J Clin Microbiol. 2006; 44:3557-62.
15. Pasloske BL, Walkerpeach CR, Obermoeller RD, Winkler M, Du Bois DB. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards // J Clin Microbiol. 1998;36(12):3590-4.
16. Jatsyshina S. B. et al. Laboratory diagnosis of influenza and other acute respiratory viral infections by polymerase chain reaction // Laboratornaya sluzhba. 2017. Vol. 6. №. 3. P. 238-267.
17. Sanchez, C. M., F. Gebauer, C. Sune, A. et al. Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses // Virology. - 1992. P. 92-105.
18. Hatim T. Allawi and John SantaLucia, Jr. Nearest-Neighbor Thermodynamics of Internal A,C Mismatches in DNA: Sequence Dependence and pH Effects // Biochemistry. 1998. 37. 9435-9444.
References
1. Bogoch I. I. et al. Pneumonia of unknown aetiology in Wuhan, China: potential for international spread via commercial air travel 10. // Journal of travel medicine. 2020. Vol. 27. №. 2. P.1-3.
2. Hui D. S. et al. The continuing 2019-nCoV epidemic threat of 11. novel coronaviruses to global health — The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China // International Journal of Infectious Diseases. 2020. Vol. 91. P. 264-266. 12.
3. Rothan H. A., Byrareddy S. N. The epidemiology and pathogenesis
of coronavirus disease (COVID-19) outbreak // Journal of 13. autoimmunity. - 2020. P. 1-4.
4. Chan J. F. W. et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus: another zoonotic betacoronavirus causing SARS-like disease // 14. Clinical microbiology reviews. 2015. Vol. 28. №. 2. P. 465-522.
5. Elfiky A. A., Mahdy S. M., Elshemey W. M. Quantitative structure activity relationship and molecular docking revealed a potency
of anti-hepatitis C virus drugs against human corona viruses // 15. Journal of medical virology. 2017. Vol. 89. №. 6. P. 1040-1047.
6. Ibrahim I. M. et al. COVID-19 spike-host cell receptor GRP78 binding site prediction // Journal of Infection. 2020. Vol. 80. №. 5.
P. 554-562. 16.
7. WHO: Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) — The Kingdom of Saudi Arabia Retrieved. 24 February 2020. URL: https://www.who.int/csr/don/24-february-2020- 17. mers-saudi-arabia/en/
8. John Hopkins University. Coronavirus Resourse Center. [Электронный ресурс] URL: https://coronavirus.jhu.edu/map. 18. html. Дата обращения: 30.06.2020.
9. Van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., Hays J.P. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. — Springer Science &
Business Media, 2008.
Yuryev A. Methods in Molecular Biology: PCR Primer Design.
Totowa, New Jersey: Humana Press, 2007.
Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties
calculator. Nucleic. Acids Res. 2007. URL: http://biotools.nubic.
northwestern.edu/OligoCalc.html.
Integrated DNA Technologies. OligoAnalyzer Tool. URL: https://
www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer.
The mfold Web Server (Hosted by The RNA Institute, College of
Arts and Sciences). URL: http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/
DNA-Folding-Form.
Cheng Y, Niu J, Zhang Y, Huang J, Li Q. Preparation of his-tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus // J Clin Microbiol. 2006; 44:3557-62. Pasloske BL, Walkerpeach CR, Obermoeller RD, Winkler M, Du Bois DB. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards // J Clin Microbiol. 1998;36(12):3590-4.
Jatsyshina S. B. et al. Laboratory diagnosis of influenza and other acute respiratory viral infections by polymerase chain reaction // Laboratornaya sluzhba. 2017. Vol. 6. №. 3. P. 238-267. Sanchez, C. M., F. Gebauer, C. Sune, A. et al. Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses // Virology. - 1992. P. 92-105.
Hatim T. Allawi and John SantaLucia, Jr. Nearest-Neighbor Thermodynamics of Internal A,C Mismatches in DNA: Sequence Dependence and pH Effects // Biochemistry. 1998. 37. 94359444.