CC BY
240/41, 14558 Bergholz-Rehbrucke, Germany.
14. Safarov Ibrahim Valievich Production of microalgae and their possibilities of production oil under different conditions
international scientific journal "modern biology and genetics" 2023 №4 (6) issn: 2181-3396 p. 6-11.
15. Tsukada, O., Kawahara, T., Miyachi, S., 1977. Mass culture of Chlorella in Asian countries. In: Mitsui, A., Miyachi, S., San Pietro, A., Tamura, S. (Eds.), Biological Solar Energy Conversion. Academic Pres, New York; 363-365.
16. Tsoglin and Gabel 2000. The technology of production of biomass labeled with stable isotopes. Abstracts of
the 4th European workshop on biotechnology of microalgae. BergholzRehbrücke, Germany.
17. Chisti Y. Constraints to commercialization of algal fuels // J. Biotechnol. 2013. V. 167. P. 201.
18. Y.P. Nagaraja., Chandrashekhar Biradar., K.S. Manasa and H.S. Venkatesh Production of biofuel by using micro algae (Botryococcus braunii) Int.J.Curr.Microbiol. App.Sci (2014) 3(4): 851-860.
19. Krienitz, Lothar; Huss, Volker A.R.; Bock, Christina (2015). "Chlorella: 125 years of the green survivalist". Trends in Plant Science. 20 (2): 67-69.
УДК:579.61
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ЭНДОФИТНЫХ ГРИБОВ С АНТИКОАГУЛЯНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ
Н.Х.Кузиева1, Л.И.Абдульмянова1, З.М.Хамиджонова2
Института микробиологии Академия Наук Республика Узбекистан, 1001258, г. Ташкент, улица Абдуллы Кадири 7 Б 2Национальный университет Узбекистана имени Мирзо Улугбека,100174, г.Ташкент,
улица Университетская, 174.
*Соответствующий автор email: nilufar [email protected] Адреса электронной почты соавторов: a l i [email protected], [email protected]
Аннотация. Пандемия показала необходимость и востребованность большого количества антикоагулянтных препаратов, так как при ковиде в первую очередь страдала кровеносная система и, в большинстве случаев, наблюдался смертельный исход от тромбозов. Кроме этого учитывая, что болезни сердечнососудистой системы стоят на первом месте по смертности в целях профилактики проведение антикоагулянтной терапии крайне необходимо для большинства населения. Высокая стоимость синтетических лекарств, ограниченность их поставки в сельские районы во многих развивающихся странах приводят к использованию населением народной медицины с применением лекарственных трав и растений. Это, в свою очередь, способствует исчезновению редких, эндемичных растений с уникальными свойствами. В этом случае эндофитные грибы, способные синтезировать те же вещества, что и растение-хозяин, в том числе и антикоагулянтные, становятся незаменимым и перспективным источником исследований. В наших исследованиях для определения качественного состава этих
соединений провели анализ экстрактов фитохимическими методами. Было установлено, что отобранные эндофитные культуры грибов лекарственных растений Узбекистана, способны синтезировать вторичные метаболиты, относящиеся к различным классам химических соединений и обладающих высокой антикоагулянтной активностью.
Ключевые слова: антикоагулянт, эндофитные грибы, танин, феноль, терпеноид, антрахинон, сердечных гликозид, алкалоид, белок, флавоноид.
QUALITATIVE ANALYSIS OF SECONDARY METABOLITES OF ENDOPHYTIC FUNGI WITH ANTICOAGULANT PROPERTIES
N.Kh.Kuzieva1, L.I.Abdulmyanova1, Z.M.Khamidzhonova2
1Institute of Microbiology Academy of Sciences Republic of Uzbekistan, 1001258,
Tashkent, Abdulla Kadiri street 7 B 2National University of Uzbekistan named after Mirzo Ulugbek, 100174, Tashkent, street
Universitetskaya, 174.
*Corresponding author email: nilufar [email protected] Co-authors' email addresses: a l i [email protected], [email protected]
Annotation. The pandemic has shown the need and demand for a large number of anticoagulant drugs, since during Covid, the circulatory system primarily suffered and, in most cases, there was death from thrombosis. In addition, given that diseases of the cardiovascular system are in first place in mortality, for the purpose of prevention, anticoagulant therapy is extremely necessary for the majority of the population. The high cost of synthetic drugs and the limited supply of them to rural areas in many developing countries lead to the use of traditional medicine by the population using medicinal herbs and plants. This, in turn, contributes to the disappearance of rare, endemic plants with unique properties. In this case, endophytic fungi, capable of synthesizing the same substances as the host plant, including anticoagulant ones, become an irreplaceable and promising source of research. In our studies, to determine the qualitative composition of these compounds, we analyzed the extracts using phytochemical methods. It was found that selected endophytic cultures of fungi from medicinal plants of Uzbekistan are capable of synthesizing secondary metabolites belonging to various classes of chemical compounds and having high anticoagulant activity.
Keywords: anticoagulant, endophytic fungi, tannin, phenol, terpenoid, anthraquinone, cardiac glycoside, alkaloid, protein, flavonoid.
Введение
Высокий уровень разнообразия микромицетов в природных условиях обуславливает разнообразие
синтезируемых ими вторичных метаболитов.
Вторичные метаболиты
микромицетов, относящиеся к различным классам химических
соединений, обладают
антимикробными, противоопухолевыми, иммуностимулирующими, антиоксидантными и другими свойствами, что способствует их широкому применению в
фармакологии и медицине [2, 8, 11].
Возрастающая потребность в новых мощных фармацевтических продуктах, а также различных биопрепаратов для сельского хозяйства, обуславливает поиск новых альтернативных источников
химических соединений, в том числе и микробного происхождения [4, 12].
В последнее время огромное внимание уделено эндофитам -микроорганизмам, бессимптомно обитающим в тканях растений, а именно эндофитным грибам, поскольку они демонстрируют большие потенциальные возможности в синтезе уникальных соединений со сложной структурой [9].
Пандемия показала
необходимость и востребованность большого количества
антикоагулянтных препаратов, так как при ковиде в первую очередь страдала кровеносная система и, в большинстве случаев, наблюдался смертельный исход от тромбозов. Кроме этого учитывая, что болезни сердечнососудистой системы стоят на первом месте по смертности в целях профилактики проведение
антикоагулянтной терапии крайне необходимо для большинства
населения [13]. Как правило, антикоагулянты уменьшают
образование тромбов и в жизненно важных органах, таких как легкие и мозг [5]. Более того, они снижают риск развития других заболеваний например, фибрилляция предсердий, тромбоз глубоких вен, инфаркт миокарда, инсульт и легочная эмболия [5, 13].
Высокая стоимость
синтетических лекарств,
ограниченность их поставки в сельские районы во многих развивающихся странах приводит к использованию населением народной медицины с применением лекарственных трав и растений [1]. Это, в свою очередь, способствует исчезновению редких, эндемичных растений с уникальными свойствами [6].
В этом случае эндофитные грибы, способные синтезировать те же вещества, что и растение-хозяин, в том числе и антикоагулянтные, становятся незаменимым и перспективным источником исследований.
В этой связи, целью настоящего исследования стало проведение фитохимического анализа вторичных метаболитов 11 изолятов эндофитных грибов, выделенных из 9 лекарственных растений республики, обладающих антикоагулянтными свойствами.
Материалы и методы исследования
Из лекарственных растений, произрастающих в различных климатических условиях и
географических поясах республики, было выделено более 80 изолятов эндофитных грибов.
Выделение эндофитных грибов проводили по Strobel et al., с небольшими изменениями. Для выделения эндофитных грибов образцы стеблей и листьев растений предварительно замачивали в 70%-ном этиловом спирте на 1 мин, затем промывали стерильной водой, образцы асептически измельчали до толщины 0,5 см и высевали на питательную среду Чапека - Докса с агаром в чашку Петри. В среду добавляли 50 мг/мл хлортетрациклина и 250 мг/мл стрептомицина для остановки роста бактерий. Чашки выращивали при 28°С в течение 7-14 дней. Выросшие изоляты грибов культивировали на чистой
агаризованной среде Чапека - Докса, не содержащей антибиотиков [10].
Вторичные метаболиты выделяли из биомассы эндофитных грибов, выращенных на картофельно -декстрозном бульоне (КДБ) в условиях жидкофазной ферментации при рН-6,8-7,2, температуре 28°С и 180 об/мин на качалке.
Экстракцию вторичных
метаболитов осуществляли
этилацетатом, с последующим получением этанольных экстрактов по методу Lang с сотр. с модификациями Hazalin. Для этого 1 г замороженной при - 40°С биомассы
гомогенизировали растиранием с
кварцевым стеклом в ступке, переносили в коническую колбу, содержащую 5 мл этилового эфира уксусной кислоты (этилацетат), и оставляли на сутки на качалке при комнатной температуре для перемешивания. Затем смесь отфильтровывали через бумажный фильтр (ватман бумага №1) и добавляли Na2SÜ4 из расчета 40 мкг/мл для удаления водного слоя. Далее смесь упаривали досуха на роторном испарителе и получали сухой остаток, который
ресуспензировали в 1 мл этиловом спирте. Полученные экстракты хранили при температуре +40 С и использовали для определения антикоагулянтных свойств [3].
Проведенный ранее скрининг антикоагулянтной активности
методом рекальцификации, позволил отобрать 11 изолятов, синтезирующих вторичные метаболиты с
антикоагулянтной активностью.
Фитохимический анализ
синтезируемых метаболитов
определяли качественными
реакциями.
Наличие танинов и фенольных веществ определяли путем
добавления к 2 мл полученного экстракта 2-3 капель 1% раствора FeCL3. В присутствии ионов железа танины дают черно-синий или черно-зеленый цвет, фенолы - фиолетовый.
Наличие сапонинов
устанавливали путем растворения 1
мл экстракта в 5 мл горячей воды (60°С) с дальнейшим интенсивным встряхиванием в течение 5 минут до образования стойкой пены. Объем пены сохранялся в течении последующих 30 минут.
Наличие терпеноидов
определяли путем смешивания 0,5 мл экстракта с 2 мл хлороформа и 3 мл. H2SO4 (конц.). Образование между фазами красно-коричневого
окрашивания говорило о наличии терпеноидов.
Наличие антрахинонов
устанавливали смешиванием 2 мл экстракта с 4 мл гексана и последующим встряхиванием. При этом наблюдалось разделение экстракта на 2 слоя. Верхний слой отделяли, обрабатывали 4 мл разведенного 10% аммиака и определяли окраску нижнего слоя. Фиолетово-розовая окраска говорила
0 наличии антрахинонов.
Наличие сердечных гликозидов определяли путем смешивания 1 мл экстракта с 1 мл ледяной уксусной кислоты и последующим добавлением
1 капли 3% хлорида железа в метаноле. Затем добавляли по стенке пробирки H2SO4 (конц.) и определяли окраску нижнего слоя. Сине-зеленое окрашивание говорило о наличии сердечных гликозидов.
Наличие алкалоидов основаны на способности алкалоидов образовывать не растворимые в воде соединения с солями тяжелых металлов, с комплексными йодидами,
комплексными кислотами и другими соединениями кислотного характера. Эти реакции позволяют установить наличие алкалоидов даже при незначительном их содержании. Раствор йода в растворе калия йодида (реактив Вагнера, реактив Бушарда) с алкалоидами образуют бурые, трудно растворимые в воде осадки. К 1 мл эстракта добавляют 5 капель реактива для осаждения алкалоидов. При наличии алкалоидов появляется бурый осадок осадок
Тест на белок: к 2 мл каждого экстракта добавляли 1 мл 40% гидроксида натрия и несколько капель 1% сульфата меди; образование фиолетового цвета указывает на присутствие молекул пептидной связи в экстракте образца.
Тест на флавоноиды: к 2 мл каждого экстракта добавляли несколько капель 20% гидроксида натрия, наблюдается образование интенсивного желтого цвета. К нему было добавляем несколько капель 70% разбавленной соляной кислоты и желтый цвет исчезает. Образование и исчезновение желтого цвета указывает на присутствие флавоноидов в экстракте пробы [7].
Результаты и обсуждение Первичный скрининг на наличие антикоагулянтных свойств вторичных метаболитов эндофитных грибов, ассоциированных с такими
растениями как: ферула, барвинок, тимьян, базилик, каштан, ромашка, цикорий, подорожник, гинко, хрен и
др. был проведен методом рекальцификации в результате которого было отобрано 11 изолятов. Активированное время
рекальцификации плазмы
этанольных экстарктов отобранных эндофитных грибов составило более 120,0 мин. При этом АВР плазмы (положительный контроль) составило 1,43 мин, а АВР плазмы+этанол (отрицательный контроль) - 1,48 мин. То есть отобранные культуры эндофитов синтезировали
соединения, способные полностью предотвращать свертываемость крови.
Для определения качественного состава этих соединений провели анализ экстрактов фитохимическими методами. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Как видно из данных таблицы 1, сапонины не обнаружены ни в одном из исследованных эндофитных изолята. Большинство культур (5070%) обладает способностью синтезировать алкалоиды,
терпеноиды и сердечные гликозиды. Уникальным оказался штамм CI3L, выделенный из Cichórium íntybus, способный синтезировать фенолы. Танины обнаружены в изолятах рода Penicillium - CS50R из Crocus sativus и
Список литературы
1. Dangarembizi R, Erlwanger KH, Moyo D, Chivandi E.Phytochemistry, pharmacology and ethnomedicinal uses of Ficus thonningii (Blume Moraceae). a
VE89L из Vinca erecta. При этом изолят Penicillium sp. - CS50R единственный штамм, способный синтезировать помимо танинов еще 5 классов соединений: терпеноиды, алколоиды, сердечные гликозиды, флавоноиды и белок. В то время как штамм, идентифицированный как Aspergillus amstelodami - VR177L из Vinca rosea, синтезировал лишь сердечные гликозиды. Антрахиноны
продуцировали три культуры: Penicillium concavoradulozum - VE89L и Aspergillus terreus - VR176L, ассоциированные с растениями рода Vinca, и изолят CI3L, выделенный из Cichorium intybus.
Заключение. Таким образом, отобранные эндофитные культуры грибов лекарственных растений Узбекистана, способны синтезировать вторичные метаболиты, относящиеся к различным классам химических соединений и обладающих высокой антикоагулянтной активностью.
Дальнейшие исследования
направлены на оптимизацию условий выделения и очистки индивидуальных метаболитов исследуемых
эндофитных грибов, обладающих антикоагулянтыми свойствами.
review. Afr J Tradit Complement Altern Med 2013; 10 (2): 203-212. 2. Fox EM, Howlett BJ. Secondary metabolism: regulation and role in fungal biology. Curr Opin Microbiol. 2008; 11 (6): 481-487.
Таблица 1
Фитохимический анализ эндофитных грибных изолятов лекарственных
растений республики
№ Штаммы OB4R CS50R VE89L VR176L VR177L CS4C CI2F CI3L PM4S CS13L GB4L
1 Танин + • 1 + Л D т
2 Фенол п 1 1 4 ь I 1
3 Сапонин
4 Терпеноид + My ё + ш » t + + 1! + ш + | 1 + ч *
5 Антрохинон + ГШ 1 • + |Jj а W, t 1 ь Ji 1
Сердечный гликозид
Алкалоид
Белок
Флавоноид
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3. Hazalin N.A., Ramasamy K., Lim S.M., Wahab I.A., Cole A.Lj, Majeed A.A. Cytotoxic and antibacterial activities of endophytic fungi isolated from plants at the National Park, Pahang, Malaysia. BMC Complementary and alternative medicine. 2009, 9: 46. 49.
4. Hawksworth DL. The tropical fungal biota: census, pertinence, prophylaxis, and prognosis. In: Aspects of Tropical
Mycology. Cambridge, UK: Cambridge University Press; 1993. 5. Liu L, Duan JA, Tang Y, Guo J, Yang N, Ma H, Shi X. Taoren-Honghua herb pair and its main components promoting blood circulation through influencing on hemorheology, plasma coagulation and platelet aggregation. Journal of Ethnopharmacology 2012; 139(2): 381387.
6
+
+
7
+
8
+
9
+
6. Olusola A, Lajide L, Ajayi OO, Amoo IA. Morphological and physicochemical characterization of ipin gum (Ficus elasticaa). Sch. Acad. J. Biosci.2014; 2 (11): 773-777.
7. Prabhavathi R. M., Prasad M. P. and Jayaramu M. Studies on Qualitative and Quantitative Phytochemical Analysis of Cissus quadrangularis. Pelagia Research Library Advances in Applied Science Research, 2016, 7(4):11-17.
8. Schulz B, Boyle C. The endophytic continuum. Mycol Res. 2005; 109 (Pt 6): 661-686.
9. Strobel G.A. Endophytes as sources of bioactive products. Microbes Infect. 2003; 5 (6): 535-544.
10. Strobel G, Yang X, Sears J, Kramer R, Sidhu R.S., and Hess W. M., "Taxol from
Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallachiana," Microbiology (Reading), vol. 142 ( Pt 2), pp. 435-440.
11. Tan RX, Zou WX. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat Prod Rep. 2001; 18 (4): 448-459.
12. Wasser SP. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Appl Microbiol Biotechnol. 2002; 60 (3): 258-274.
13. Xie P, Cui L, Shan Y, Kang WY. Antithrombotic effect and mechanism of radix paeoniae rubra. Biomed Res Int 2017; 2017: 9475074. doi: 10.1155/2017/9475074.
